驢源羅伊氏乳桿菌的安全性評價

王卓，馮培祥，李光玉，劉曉穎，郭肖蘭，司華哲，姜桂苗，趙付偉，劉晗璐※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林省特種經(jīng)濟動物分子生物學省部共建國家重點實驗室，吉林 長春 130112；2.聊城大學驢產(chǎn)業(yè)科技協(xié)同創(chuàng)新中心，山東 聊城 252000；3．國家膠類中藥工程技術(shù)研究中心，東阿阿膠股份有限公司，山東 聊城 252201）

關(guān)鍵字：驢源；羅伊氏乳桿菌；安全性

益生菌是指能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)或者能夠產(chǎn)生對生物體有益的活性物質(zhì)，對于動物健康或提高免疫力有積極作用[1-2]。在無抗飼養(yǎng)的大環(huán)境下，畜禽飼用益生菌產(chǎn)品亟待開發(fā)。乳酸菌是益生菌中應(yīng)用最廣泛的菌種之一[3-4]。益生菌株發(fā)揮益生作用時存在來源特異性、種屬特異性和菌株差異性[5]，為開發(fā)驢源益生菌制劑，本研究從東阿黑毛驢腸道中分離、篩選出一株羅伊氏乳桿菌L2-2。益生菌作為一類活性微生物，必須滿足其不具有致病性的前提，特別針對新型的益生菌菌株，安全性評價是一項很重要的基礎(chǔ)工作[6-7]。小鼠是藥物篩選性試驗、毒性試驗和安全評價試驗最常用的動物，避免了動物數(shù)量需求大、宰殺取樣困難的限制[8]。本研究以小鼠為研究對象，對驢源羅伊氏乳桿菌L2-2進行小鼠安全性檢驗，測量小鼠體重和采食量，檢測臟器指數(shù)、血液學指標、細菌易位情況，以期判斷其作為益生菌的可行性，為開發(fā)驢源益生菌制劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

羅伊氏乳桿菌（L2-2），由本研究從健康驢腸道中分離并鑒定。取活化的受試菌株接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)18 h，以5 000 r/min，4 ℃離心10 min，用生理鹽水調(diào)整有效活菌數(shù)為5 1010CFU/mL。

1.2 試驗動物

健康ICR 小鼠，體重18～22 g，由長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責任公司提供，動物質(zhì)量合格證號為SCXK-（吉）2016-0003。

1.3 急性經(jīng)口毒性試驗

參照《食品安全國家標準急性經(jīng)口毒性試驗》（GB 15193.3-2014）[9]要求進行試驗。隨機選取雄性小鼠24 只，分為2 組，每組各12 只，分別為對照組和羅伊氏乳桿菌組，其中，對照組小鼠灌喂生理鹽水，羅伊氏乳桿菌組小鼠灌喂劑量為1 1010CFU/mL 的菌液，每天9：00 經(jīng)口灌胃1 次，劑量為0.2 mL/只，連續(xù)灌胃7 d。每天觀察并記錄小鼠的行為、中毒表現(xiàn)、腹瀉情況和死亡情況。每隔2 d 稱體重，飼喂7 d 稱重后摘眼球采血1 mL，每組4 個血液樣本置于EDTA 抗凝管內(nèi)，用于血液細胞分析；另外8 個血液樣本置于促凝固管中，用于血液生化指標分析。小鼠脫頸椎處死后進行解剖檢查，稱重肝臟、脾臟、腎臟和胸腺，按照以下公式計算其臟器指數(shù)：臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）100。

1.4 細菌易位試驗

經(jīng)口毒性試驗結(jié)束后，無菌操作下隨機取試驗組3 只小鼠的肝臟、脾臟、腎臟，加入適量的無菌生理鹽水制成組織勻漿液，涂布于MRS 固體培養(yǎng)基，另取組織勻漿中加入菌液后涂布于MRS 固體培養(yǎng)基作為陽性對照，以生理鹽水代替組織勻漿涂布于MRS 固體培養(yǎng)基作為陰性對照，在37℃培養(yǎng)48h，觀察菌落生成情況。

1.5 小鼠血液細胞分析

血液樣本置于EDTA 抗凝管中后，立即進行紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類、血紅蛋白濃度和血小板計數(shù)等血液學指標的測定。

1.6 小鼠血液生化指標測定

將血液樣本置于促凝固管中，以4 ℃，3 500 r/min條件下離心5 min，檢測血清中的白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、堿性磷酸酶（ALP）、血高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、血糖（GLU）和乳酸脫氫酶（LDH）含量，測定用試劑盒購自中生北控有限公司。球蛋白（GLOB）為TP和ALB 的差值。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，并采用獨立樣本t 檢驗對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及顯著性檢驗。試驗數(shù)據(jù)以“平均數(shù)±標準差”表示，P ＜0.05 表示差異顯著，P ＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 對小鼠體重和采食量的影響

小鼠灌服高劑量羅伊氏乳桿菌后采食、糞便均無異常，體重持續(xù)增長，體重和采食量見表1，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；驢源羅伊氏乳桿菌L2-2 小鼠經(jīng)口灌服后，未對小鼠采食和生長性能產(chǎn)生異常影響。

表1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠體重及采食量的影響Table 1 Effects of large dos the body weight and feed intake of mice

表1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠體重及采食量的影響Table 1 Effects of large dos the body weight and feed intake of mice

組別Group初始體重（g）Initial body weight不同天數(shù)體重（g）Body weight on different days 體增重（g）Body weight gain日采食量（g）Daily feed intake 3 d 5 d 7 d對照組Control group 21.42±1.12 25.14±1.27 26.89±1.44 28.78±1.71 7.36±1.30 3.97±0.22羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 21.22±0.94 24.75±0.90 26.69±0.99 28.55±1.59 7.57±1.25 4.06±0.02 P 值P-value 0.631 0.381 0.696 0.724 0.679 0.652

2.2 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠臟器指數(shù)的影響

由表2 可知，灌服羅伊氏乳桿菌L2-2 后，小鼠心、肝、脾、肺、腎和腸道均未出現(xiàn)病變，小鼠胸腺指數(shù)明顯增加（P ＜0.05），肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均無顯著差異。

表2 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of large index of mice

表2 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of large index of mice

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）。Note:Different lowercase letters in the same column indicate significant differences（P ＜0.05）.

組別Group 肝臟指數(shù)Liver index脾臟指數(shù)Spleen index腎臟指數(shù)Kidney index胸腺指數(shù)Thymus index對照組 Control group 6.73±0.48 0.55±0.08 1.62±0.15 0.248±0.043 b羅伊氏乳桿菌組 Lactobacillus reuteri group 6.88±0.79 0.62±0.12 1.67±0.19 0.308±0.063 a P 值 P-value 0.590 0.112 0.475 0.012

2.3 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠細菌易位情況

如圖1 所示，灌服羅伊氏乳桿菌L2-2 后小鼠肝臟、脾臟及腎臟未見有菌落長出。結(jié)果表明，灌服高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 后小鼠肝臟和腎臟、脾臟未發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。

圖1 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠細菌易位情況Fig.1 Bacterial translocation of large dos

2.4 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠血液生化指標的影響

由表3 可知，高劑量羅伊氏乳桿菌可以顯著提高小鼠血清中GLOB 含量（P ＜0.05），同時可以極顯著降低血清中TG 含量（P＜0.01），對葡萄糖、膽固醇、低密度脂蛋白和高密度脂蛋白均無顯著影響（P＞0.05）。

表3 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of large dosees of mice

表3 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血清生化指標的影響Table 3 Effects of large dosees of mice

注：同列不同小寫字母表示差異顯著（P ＜0.05）；同列不同大寫字母表示差異極顯著（P ＜0.01）。Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant differences（P ＜0.05）;Different capital letters in the same column indicated extremely significant differences（P ＜0.01）.

組別Group ALB（g/L）TP（g/L）GLOB（g/L）Glu（mmol/L）LDH（U/L）ALP（U/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）CHO（mmol/L）HDL（mmol/L）對照組Control group 20.85±1.21 44.22±1.70 23.37±1.23 b 8.06±0.55 879.66±117.41 135.06±17.85 1.25±0.13 A 0.45±0.03 3.16±0.18 1.87±0.14羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 20.19±0.74 46.53±2.22 26.34±1.75 a 8.50±0.73 845.13±83.82 145.84±27.88 0.82±0.12 B 0.46±0.06 3.20±0.48 1.97±0.25 P 值P-value 0.331 0.102 0.015 0.347 0.607 0.487 0.001 0.902 0.865 0.458

2.5 高劑量羅伊氏乳酸菌L2-2 對小鼠血液學指標的影響

由表4 可知，試驗組小鼠血液紅細胞、白細胞數(shù)量、血紅蛋白濃度和血小板數(shù)量等血液學指標與對照組相比均差異不顯著（P ＞0.05）。

表4 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血液學指標的影響Table 4 Effects of large dosehematological indices of mice

表4 高劑量羅伊氏乳酸菌對小鼠血液學指標的影響Table 4 Effects of large dosehematological indices of mice

組別Group白細胞數(shù)目（ 109/L）Number of WBC淋巴細胞數(shù)目（ 109/L）Number of lymphocytes單核細胞數(shù)目（ 109/L）Number of mononuclear cells中性粒細胞數(shù)目（ 109/L）Number of neutrophils淋巴細胞百分比（%）Lymphocyte percentage單核細胞百分比（%）Percentage of mononu-clear cells中性粒細胞百分比（%）Percentage of neutrophils紅細胞數(shù)目（ 1012/L）Number of red blood cells血紅蛋白含量（g/L）Hemoglobin content血小板數(shù)目（ 109/L）Number of platelet對照組Control group 7.03±1.68 5.40±1.63 0.20±0.09 1.48±0.26 75.52±5.28 3.13±1.30 21.35±4.17 7.62±0.70 144.17±8.84 1 382.00±248.34羅伊氏乳桿菌組Lactobacillus reuteri group 6.95±0.79 5.40±0.68 0.13±0.05 1.42±0.33 77.42±4.12 2.08±0.25 20.50±4.05 7.05±0.85 133.00±6.08 1 643.50±357.98 P 值P-value 0.930 1.000 0.170 0.764 0.561 0.153 0.758 0.276 0.094 0.206

3 討論與結(jié)論

腸道菌群與動物機體健康息息相關(guān)。有益菌群不僅可以促進機體免疫應(yīng)答，而且能代謝產(chǎn)生多種消化酶從而促進營養(yǎng)物質(zhì)吸收，抑制腸道有害菌群，以維持腸道菌群平衡，發(fā)揮腸道生物屏障作用[10]。宿主動物的胃腸道內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)[11]。在正常情況下，胃腸道菌群中共生菌之間相互作用，為宿主胃腸道提供一定的營養(yǎng)及屏障功能，維持胃腸道的穩(wěn)態(tài)[12]。當外源攝入高劑量微生物后，胃腸道內(nèi)微生物之間會出現(xiàn)相互依賴，相互促進和相互制約，機制極其復雜，其安全性評價是一個必不可少的環(huán)節(jié)。

正常時各臟器與體重的比值稱為臟體比或臟器指數(shù)，臟器指數(shù)比較穩(wěn)定，當臟器充血、水腫、增生肥大或者臟器萎縮及其他退行性改變等則會引起臟器指數(shù)的變化，是毒理試驗常用的指標。本研究結(jié)果顯示，羅伊氏乳桿菌對小鼠肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)和腎臟指數(shù)均無明顯影響，但可以顯著提高胸腺指數(shù)。胸腺是小鼠體內(nèi)重要的免疫器官，胸腺指數(shù)主要反映機體的非特異免疫能力。胸腺也是機體的一個分泌器官，髓質(zhì)上皮中的Ⅵ型上皮細胞具有合成、分泌功能，可以分泌胸腺素及胸腺生成素。胸腺素和胸腺生成素分泌能夠活化T淋巴細胞參與機體的免疫[13]，胸腺指數(shù)增加表明羅伊氏乳桿菌L2-2 可以增強小鼠的免疫功能。

血清生化指標檢測結(jié)果對于動物營養(yǎng)健康狀況具有重要參考價值。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在小鼠灌服高劑量羅伊氏乳桿菌L2-2 后，小鼠血清GLOB 含量增加，同時降低了血清中TG 含量，而其他血清生化指標未受影響。血清GLOB 通常也稱為免疫球蛋白，可反映機體一定的免疫水平[14]。血清TG 是臨床血脂分析的重要指標，血脂高會導致血小板大量集聚，繼而導致心腦血管疾病的發(fā)生[15]。因此，羅伊氏乳桿菌L2-2 具有改善小鼠健康狀況的潛力。

本研究結(jié)果表明，小鼠連續(xù)7d 灌服劑量1 1010CFU/d的羅伊氏乳桿菌L2-2，小鼠體征和采食情況未受到不利影響，小鼠血液學檢查未見異常。細菌易位是指胃腸道內(nèi)活菌穿過黏膜防御屏障，進入正常無菌的組織或器官，是評價細菌致病性的一個重要指標[16]。在小鼠灌服7 d 后，羅伊氏乳桿菌并未在原定居點腸道易位入其他組織發(fā)生感染。根據(jù)前人研究報道可知，半數(shù)致死量（LD50）是指導致死亡率50%的劑量，現(xiàn)已成為標志動物急性中毒程度的重要參數(shù)，在細菌濃度為5 1010CFU/mL時，對于6～8 周齡、體重20～25 g的雄性小鼠，羅伊氏乳桿菌L2-2 菌株口服LD50將大于10 mL/（kg·d），因此，預測體重100 kg 的驢駒每天服用超過1 L 的細菌是安全的[17]，可接受的每日攝入量是通常用在動物試驗（1 1010CFU/mL 濃縮飼料）的1 000 倍左右[18]。

本研究對從驢腸道內(nèi)分離篩選到的羅伊氏乳桿菌在小鼠上進行了安全性評價，通過灌服大劑量羅伊氏乳桿菌研究其對小鼠的采食、生長情況、血清生化指標以及內(nèi)臟細菌易位情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠無中毒跡象，上述結(jié)果表明羅伊氏乳桿菌L2-2 菌株對小鼠具有非致病性，并能增加胸腺指數(shù)和血清中球蛋白含量，表明羅伊氏乳桿菌L2-2 能增強小鼠的免疫功能，而該菌的其他益生特性則有待進一步研究。