基于環(huán)磷酰免疫抑制模型研究鮮人參膏增強(qiáng)小鼠免疫力的作用

王文婷，施展，林向輝，林曉熙，劉喜峰，任珅，李偉※

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長春 130118；2.遼寧熙峰藥業(yè)集團(tuán)有限公司，遼寧 桓仁 117000）

免疫力是人體自身的防御機(jī)制，是維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的重要保障，其作用體現(xiàn)在當(dāng)人體自身受細(xì)菌、病毒或病原體入侵時(shí)，自身免疫系統(tǒng)所具有的抵抗能力[1]，也是評(píng)價(jià)機(jī)體抵抗疾病的關(guān)鍵屏障。一旦免疫力低下或抵抗能力異常，其侵襲的病原體將直接影響機(jī)體內(nèi)環(huán)境，從而感染疾病，因此增強(qiáng)免疫力變得尤為重要。增強(qiáng)免疫力通常通過一定手段來加強(qiáng)自身免疫力，也是許多藥物治療疾病或者改善臨床藥效的目的之一，近年來大量研究表明天然藥物在增強(qiáng)機(jī)體免疫力方面有著非常顯著的效果[2]。

人參為五加科人參屬（Panax ginseng C.A.Meyer）植物的干燥根及根莖，是我國極具傳統(tǒng)特色的中藥資源，具有藥用和營養(yǎng)雙重價(jià)值，素有“百草之王”美譽(yù)[3]，其性甘、味微苦，歸脾、肺、心經(jīng)；具有安神益智、大補(bǔ)元?dú)夂脱a(bǔ)脾益肺之功效，久服可以增強(qiáng)其自身免疫力[4]。其主要化學(xué)成分為人參皂苷，還包括人參多糖、氨基酸和黃酮類等多種化學(xué)成分[5]，是發(fā)揮人參多重藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。近年來，隨著人參被列為新資源食品，其食用價(jià)值逐漸得到人們的廣泛關(guān)注，人參系列產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，例如今幸人參膠囊和人參飲料等。根據(jù)人參獨(dú)特的加工方法和藥用價(jià)值，蒸參水和人參須等加工產(chǎn)品也逐步得到應(yīng)用，進(jìn)一步豐富了人參的開發(fā)價(jià)值。同時(shí)，利用人參精深加工產(chǎn)品，提高機(jī)體防御能力和抗病毒能力，更符合現(xiàn)代“以食為養(yǎng)、以食為療”的養(yǎng)生理念。因此，開發(fā)人參功能性食品對(duì)于促進(jìn)人參相關(guān)制品的深度開發(fā)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

膏劑不僅是傳統(tǒng)中成藥的主要?jiǎng)┬椭?，而且是功能性食品的首選劑型。根據(jù)機(jī)體不同體質(zhì)及臨床反應(yīng)，通過煎熬等方式并加入某些輔料制成一種稠膏狀劑型，可充分體現(xiàn)膏劑治療、滋補(bǔ)和易于吸收的特點(diǎn)。鮮人參膏（fresh ginseng paste,FGP）利用國家發(fā)明專利技術(shù)[6]，精選優(yōu)質(zhì)新鮮人參，利用鮮人參不同部位的加工方法，以蒸須水為溶劑，并配以紅棗精華，科學(xué)加工，轉(zhuǎn)化稀有活性物質(zhì)，成功富集出以Rg3 為代表的16 種稀有皂苷組分群，最大限度地保留了人參中所有活性成分和營養(yǎng)物質(zhì)[7]，同時(shí)更富含精氨酸雙糖苷AFG、氨基酸、多糖和人參蛋白等多種有益物質(zhì)[8]。

人參加工制品因其富含人參皂苷并具有顯著的生理活性，是醫(yī)療和保健的首選佳品，更能體現(xiàn)人參獨(dú)特的藥用和食用價(jià)值。本研究基于人參的現(xiàn)代研究背景，探究人參新型加工品“鮮人參膏”對(duì)環(huán)磷酰免疫抑制模型增強(qiáng)小鼠免疫力的作用，以期為人參功能性食品的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步豐富人參系列深產(chǎn)品的開發(fā)利用。

1 材料與方法

1.1 儀器、材料與試劑

Neofuge 1600R 高速離心機(jī)（上海力新儀器有限公司）；SPECTRO star Nano 全波長掃描式酶標(biāo)儀（德國BMG LABTECH 公司）；超凈工作臺(tái)（蘇州安泰公司）；Leica DM 500 顯微鏡（德國徠卡公司）；HERACELL 240i CO2 培養(yǎng)箱（美國Thermo 公司）。

鮮人參膏（FGP），購自遼寧熙峰藥業(yè)集團(tuán)有限公司，合格證號(hào)SC10721052200667；刀豆蛋白A（Con A）、脂多糖（LPS，批號(hào)L2880），均購自美國Sigma 公司；二苯基四氮唑溴鹽（MTT），購自美國Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO），購自北京化工廠；小牛血清，購自杭州四季青公司；RPMI1640培養(yǎng)基；白細(xì)胞介素2（IL-2）和腫瘤壞死因子（TNF-）試劑盒，購自美國R&D 公司。

BALB/C 小鼠（雌性，20～25 g）和ICR 小鼠（雌性，18～22 g），由長春億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 取適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后的ICR 小鼠50 只，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（N），CTX 免疫抑制模型組（CTX），CTX+FGP 高劑量組（600 mg/kg，F(xiàn)GP-H）、中劑量組（300 mg/kg，F(xiàn)GP-M）、低劑量組（150 mg/kg，F(xiàn)GP-L），F(xiàn)GP 用生理鹽水配制成混懸液，每天灌胃1 次，連續(xù)30 d。模型組（M）及給藥組于第1、2、3、9、16和23 天腹腔注射80 mg/kg 的CTX。

1.2.2 免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的測定 經(jīng)給藥30 d，進(jìn)行小鼠眼球采血，離心并分離血清，做好分裝后待用。小鼠處死，收集臟器并稱重，計(jì)算其胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)。

臟器指數(shù)（%）=臟器重量（g）/體重（g）100

1.2.3 體外淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn) 取BALB/c小鼠處死，用75%的乙醇消毒，取出脾臟并用Hanks'液洗，研磨脾臟過200 目篩網(wǎng)，計(jì)數(shù)，配成2 106mL1細(xì)胞懸液待用。試驗(yàn)分為空白組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組和樣品組FGP 5 個(gè)濃度，分別為FGP（12.5、25.0、50.0、100.0和200.0g/mL）。將制備好的細(xì)胞懸液除空白孔加入100L 培養(yǎng)基，其余每孔均加100L 細(xì)胞懸液于96孔板中，每組3 個(gè)重復(fù)，將96 孔板置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h后取出?？瞻捉M和陰性對(duì)照組中各加入100L培養(yǎng)基，陽性對(duì)照組濃度加入10LCon A（50g/mL）置于37℃、5% CO2 孵箱中培養(yǎng)48 h 后取出，每孔加20L MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，吸去上清，加入150L DMSO 充分溶解，使用酶標(biāo)儀測定各孔OD值（490 nm）。

1.2.4 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 在制備脾細(xì)胞懸液的基礎(chǔ)上，進(jìn)行淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，其小鼠處理方法與“1.2.3”相同，試驗(yàn)共分3 組進(jìn)行：第1 組脾細(xì)胞自然轉(zhuǎn)化，不加刺激劑；第2 組加入Con A 刺激T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化；第3組加入LPS 刺激B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)分為空白孔、自然轉(zhuǎn)化孔、Con A刺激孔和LPS 刺激孔，每孔設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將各組細(xì)胞分別加入96 孔板中，空白孔和自然轉(zhuǎn)化孔分別加入100L 培養(yǎng)液，ConA刺激孔加入100L 濃度為5.0g/mL Con A，LPS 刺激孔加入100L 濃度為10.0g/mL 的LPS[9]。按照上述方法測定MTT。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Mean±SD 表示，采用單因素方差分析法（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用GraphPad Prism 6.0.4 軟件進(jìn)行方差分析并繪圖。P＜0.05 或P＜0.01認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FGP對(duì)CTX致免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響

在試驗(yàn)過程中，正常對(duì)照組和試驗(yàn)組小鼠生長狀況良好。如表1 所示，與正常對(duì)照組相比，免疫抑制模型組胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均明顯降低（P ＜0.05）。與免疫抑制模型組相比，低、中和高劑量FGP 組胸腺指數(shù)以及脾臟指數(shù)降低情況均有明顯改善（P ＜0.05），表明FGP 具有增強(qiáng)小鼠免疫力的作用。

表1 FGP 對(duì)CTX 致免疫抑制小鼠臟器指數(shù)的影響Table 1 Effect of FGP on organ index of CTX-induced immunosuppressed mice

2.2 FGP 對(duì)體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響

FGP 給藥組選用5種不同的給藥濃度（12.5、25.0、50.0、100.0 和200.0g/mL）作用于小鼠淋巴細(xì)胞48 h后，采用MTT 法檢測了不同濃度FGP 對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞的細(xì)胞毒性，結(jié)果如圖1 所示：隨著FGP 濃度的逐漸增加，BALB/c 小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率逐漸升高，且呈現(xiàn)出較明顯的劑量依賴（圖1）。

2.3 FGP 對(duì)CTX 致小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響

小鼠FGP 連續(xù)灌胃30 d，刺激劑為Con A 和LPS，F(xiàn)GP 對(duì)CTX 致小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響如圖2 所示。從圖2 可以看出，低、中劑量FGP 組與CTX 組相比均有顯著差異（P ＜0.05），高劑量FGP 組與CTX 組相比小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率明顯提高（P ＜0.01），表明FGP 能夠提高淋巴細(xì)胞的自然轉(zhuǎn)化。

圖1 FGP 對(duì)體外小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化的影響Fig.1 Effects of FGP on transformation of spleen lymphocytes in mice

2.4 FGP對(duì)CTX致小鼠血清中IL-2和IFN-水平的影響

如圖3 所示，與正常對(duì)照組（N）相比，CTX組小鼠血清中IL-2 與IFN-含量均顯著降低（P ＜0.05）；低劑量FGP 組（FGP-L）小鼠血清中IL-2 和IFN-含量有一定的升高，但與CTX 組相比無顯著差異。與CTX組相比，中劑量FGP 組（FGP-M）血清中IL-2 和IFN-含量均有顯著提高（P ＜0.05）。高劑量FGP 組（FGPH）的IL-2 含量與CTX 組相比極顯著升高（P ＜0.01）；高劑量FGP 組（FGP-H）的IFN-含量與CTX 組相比顯著升高（P ＜0.05）。

圖2 FGP 對(duì)CTX 致小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率的影響Fig.2 Effects of FGP on transformation rate of lymphocytes in mice induced by CTX

圖3 FGP 對(duì)CTX 致小鼠血清中IL-2 和IFN- 含量的影響Fig.3 Effects of FGP on IL-2 and IFN- contents in serum of miceinduced by CTX

3 討論

本研究基于環(huán)磷酰免疫抑制模型研究了鮮人參膏增強(qiáng)小鼠免疫力的作用，結(jié)果表明，F(xiàn)GP 能夠增強(qiáng)BALB/c 小鼠淋巴細(xì)胞的體外轉(zhuǎn)化，在給藥30 d 后小鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)明顯提高。隨著FGP濃度的升高，小鼠淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率也隨之升高，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴關(guān)系，也表明高劑量FGP組淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率相對(duì)較高；低、中劑量FGP在促進(jìn)免疫抑制小鼠淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化上均起到顯著的促進(jìn)作用；中、高劑量FGP 能夠明顯提高免疫抑制小鼠血清中IL-2和IFN-的水平。

CTX是目前常用的抗腫瘤藥物，也是臨床上常用的免疫抑制藥物，能通過抑制細(xì)胞增殖達(dá)到治療各種自身免疫性疾病的效果[10]。通過CTX 可以建立小鼠免疫抑制模型，而導(dǎo)致其機(jī)體免疫功能下降的原因涉及T 細(xì)胞、B 細(xì)胞異常分化等諸多方面。本試驗(yàn)主要針對(duì)CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制模型，通過觀察與免疫相關(guān)的器官和指標(biāo)，探究不同濃度的FGP 對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的影響。胸腺是T細(xì)胞分化成熟的場所，同時(shí)也是機(jī)體的中樞免疫器官；脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，當(dāng)抗原刺激機(jī)體后，免疫細(xì)胞（T 細(xì)胞、B 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞）過度增生，導(dǎo)致其體積增大；二者均為機(jī)體的主要免疫器官[11]。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是評(píng)價(jià)細(xì)胞免疫功能的一個(gè)重要指標(biāo)，淋巴細(xì)胞只有向成熟T 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化才能發(fā)揮免疫效應(yīng)[12]。IL-2 是免疫系統(tǒng)中的一類細(xì)胞生長因子，對(duì)于細(xì)胞免疫應(yīng)答具有明顯的促進(jìn)作用，是細(xì)胞免疫水平的一個(gè)重要指標(biāo)[13]；IFN-是細(xì)胞被病毒感染時(shí)產(chǎn)生的一類細(xì)胞因子，在細(xì)胞免疫過程中，高劑量的IFN-起抑制作用，而低劑量的IFN-起促進(jìn)作用，其調(diào)節(jié)免疫功能主要通過巨噬細(xì)胞的激活來實(shí)現(xiàn)[14-15]。

人參是我國一種珍貴的滋補(bǔ)性藥物資源，紅棗更具有“天然維生素”的美譽(yù)，而FGP 是將人參與紅棗二者加工并通過獨(dú)特專利技術(shù)制成的，富含16 種稀有皂苷及其多種活性物質(zhì)，為其強(qiáng)大的藥理活性提供了物質(zhì)保證[5]。人參中發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的主要是人參皂苷Rg3和Rh2，人參皂苷具有增強(qiáng)其自身的免疫活性分子和改善免疫抑制作用，從而增強(qiáng)其自身免疫力[16]。本試驗(yàn)探究了FGP對(duì)CTX 誘導(dǎo)的免疫抑制作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FGP能夠明顯減輕CTX 造成的免疫損傷，有效改善小鼠免疫力低下，從而增強(qiáng)其免疫應(yīng)答能力。這充分說明FGP 在體內(nèi)灌胃給藥以及體外淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中均起到了顯著的保護(hù)作用，并產(chǎn)生干擾素，以增強(qiáng)小鼠的免疫調(diào)節(jié)能力。本研究闡述了FGP 對(duì)CTX 誘導(dǎo)免疫損傷具有很好的拮抗作用，初步揭示了鮮人參膏具有較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)能力，可為人參及相關(guān)產(chǎn)品的精深開發(fā)提供理論依據(jù)。