芍藥苷對(duì)慢性高眼壓大鼠RGCs保護(hù)作用的研究

張丹，趙軍，孫鳳江，張娟美，季亞男

青光眼全球發(fā)病率約1%～2%[1]，視神經(jīng)損傷及特征性視野缺損為其主要特征。病理性高眼壓是青光眼危險(xiǎn)要素之一，但單純控制眼壓并不能完全抑制視神經(jīng)損害的發(fā)展[2]。進(jìn)行性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cells,RGCs）凋亡是視神經(jīng)損傷和視功能損害進(jìn)展的主要因素，RGCs 是青光眼視神經(jīng)損害的核心[3-4]。因而，RGCs 保護(hù)是青光眼治療的重點(diǎn)。芍藥苷（paeoniflorin，PF）是從毛茛科植物芍藥/牡丹的根皮中提取的水溶性單萜苷，具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)活性及神經(jīng)保護(hù)等作用[5-6]。本研究通過對(duì)慢性高眼壓大鼠模型進(jìn)行腹腔注射芍藥苷的治療，初步討論芍藥苷對(duì)慢性高眼壓模型大鼠RGCs 凋亡的影響及作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)新的保護(hù)RGCs 的藥物，尋找減輕青光眼視神經(jīng)侵害新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

30 只SPF 級(jí)健康雄性SD 大鼠（7～8 周齡）由武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)室提供，體質(zhì)量180～210 g，許可批號(hào)：SYXK（鄂）2018-0104。所有大鼠均經(jīng)裂隙燈檢查及檢眼鏡檢查。按照國(guó)家科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》進(jìn)行使用。

1.2 主要試劑及儀器

芍藥苷（上海源葉生物科技有限公司，純度＞98%，生產(chǎn)批號(hào)：L07M9Q60533）；0.5%鹽酸丙美卡因滴眼液（美國(guó)愛爾康公司）；左氧氟沙星眼膏（湖北遠(yuǎn)大天天明制藥有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H20040234）；TONO-Pen AVIA 眼壓計(jì)（美國(guó)Medtronnic SALON 公司）；HE 染色試劑盒 （Bioswamp，批號(hào)：I17091）、TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒 （ROCHE，批號(hào)：11684817910）、HO-1 一抗（HO-1 Max VisionTM，抗體種屬：兔，Bioswamp,批號(hào)：PAB38338）；兔/鼠聚合物二抗免疫組化試劑盒 （邁新，批號(hào)：KIT-5020）、DAB 濃縮型試劑盒（Bioswamp，批號(hào)：W1762）。

1.3 方法

1.3.1 分組 按照隨機(jī)數(shù)字表法將30 只SD 大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組，高眼壓模型組及芍藥苷治療組，每組10 只，選取右眼為試驗(yàn)眼。

1.3.2 建立慢性高眼壓模型采用標(biāo)準(zhǔn)鞏膜靜脈燒灼法[7]制造高眼壓大鼠模型。10%水合氯醛（0.3ml/100mg）腹腔內(nèi)注射麻醉，隨后丙美卡因點(diǎn)眼，1 次/5 min，共3 次。在角膜緣后1.5 mm 處連續(xù)剪開6：00～12：00位球結(jié)膜，分離結(jié)膜下筋膜及肌肉，暴露上直肌兩側(cè)及外直肌下方共3 條表淺鞏膜靜脈總支 （1 點(diǎn)位、8點(diǎn)位、10 點(diǎn)位），用臺(tái)式電凝筆止血器進(jìn)行灼燒靜脈總支。燒灼處靜脈血流消失，近端靜脈充血怒張，遠(yuǎn)端靜脈血流消失成一條白線標(biāo)志燒灼成功。假手術(shù)組只剪開球結(jié)膜，不處理鞏膜靜脈。Tono-Pen AVIA眼壓計(jì)測(cè)量眼壓，單位為mmHg（1mmHg=0.133 kPa），術(shù)后眼壓大于術(shù)前眼壓的1.7 倍即視為造模成功。于造模前及造模后30 min、7 d、14 d 分別測(cè)量右眼眼壓。測(cè)量前10%水合氯醛麻醉，用眼壓計(jì)測(cè)量3次，取其平均值。術(shù)畢每日結(jié)膜囊內(nèi)涂左氧氟沙星眼膏。術(shù)后治療組大鼠進(jìn)行腹腔注射芍藥苷（20 mg/kg），其余大鼠腹腔內(nèi)注射生理鹽水0.5 ml，每日1 次，連續(xù)2 周。

1.3.3 取材 末次注射后次日，過量麻醉處死，快速摘除右眼球，留取部分球后視神經(jīng)組織，4%多聚甲醛（4℃）中固定24 h，石蠟包埋備HE 染色、TUNEL及免疫組化用。

1.4 檢查指標(biāo)

1.4.1 蘇木素-伊紅染色（HE 染色）組織切片脫臘至水化，進(jìn)行HE 染色，蘇木精染液染核，雙蒸水終止染色，分化液分化，脫洗，0.5%伊紅染色2～3 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，封片。高倍鏡（×400）觀察各組大鼠視網(wǎng)膜的形態(tài)結(jié)構(gòu)。每組隨機(jī)選取10 張切片，取50 μm 視野中的RGCs 區(qū)域，計(jì)算RGCs 層細(xì)胞數(shù)量。

表1 各組大鼠造模前后的眼壓比較（）

表1 各組大鼠造模前后的眼壓比較（）

注:* 與同組術(shù)前比較，P＜0.05；# 與同一時(shí)間段假手術(shù)組比較，P＜0.05

圖1 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HE 染色（×400）。1A 假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜構(gòu)造規(guī)整，層次清晰，細(xì)胞整齊排列，單層視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞外形規(guī)則，內(nèi)、外核層排列整齊；1B 高眼壓模型組大鼠視網(wǎng)膜構(gòu)造紊亂，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)目減少，排列錯(cuò)亂，形狀不規(guī)則，可見部分細(xì)胞核裂解、變性，內(nèi)、外核層輕度水腫，排列疏松；1C 芍藥苷組大鼠視網(wǎng)膜各層構(gòu)造尚規(guī)整，層次明晰，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞排列尚規(guī)整，形狀較規(guī)則，內(nèi)、外核層排列稍紊亂

圖2 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL 染色（×400）。2A 假手術(shù)組；2B 高眼壓模型組，箭頭指凋亡細(xì)胞；2C 芍藥苷治療組。箭頭指凋亡細(xì)胞

1.4.2 TUNEL 檢測(cè) 組織切片常規(guī)脫臘至水化，常規(guī)進(jìn)行TUNEL 染色,組織切片常規(guī)脫臘至水化，蛋白酶K 孵育15 min，TUNEL 反應(yīng)混合液孵育60 min，PBS 沖洗3 次，DAB 孵育10 min，蘇木素復(fù)染。高倍顯微鏡下（×400）觀察并拍照，棕色細(xì)胞核為凋亡細(xì)胞,每張切片隨機(jī)選取3 個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽性著色細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.4.3 視網(wǎng)膜組織血紅素加氧酶-1 （Heme oxygenase-1，HO-1）免疫組化染色 組織切片常規(guī)脫臘至水化；0.05 mol/L 枸櫞酸鈉緩沖液（PH=6.0）微波修復(fù)抗原；自然冷卻后PBS 清洗3 次，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶活性10min；10%山羊血清室溫封閉30 min；相繼加入一抗，4℃過夜；室溫復(fù)溫40 min；Maxvision 二抗37℃作用30 min；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染。高倍顯微鏡下（×400）根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)定：淡黃色，即弱陽性；棕黃色，即陽性；棕褐色，即強(qiáng)陽性。應(yīng)用image pro-plus 6.0 圖像系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，以陽性染色細(xì)胞平均光密度值作為HO-1陽性表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）描述，比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼壓測(cè)量

造模前，3 組眼壓比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=1.191,P=0.319）；造模后30 min，模型組及芍藥苷組眼壓均較之前升高，造模成功（t模型組=-25.086，t芍藥苷組=-24.912,均P=0.000）；造模后1 周、2 周，高眼壓模型組與芍藥苷治療組眼壓均較假手術(shù)組升高（F1周=388.43，F(xiàn)2周=281.504，均P=0.000）；造模后，模型組與芍藥苷治療組眼壓無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.223，P=0.283）。

2.2 大鼠視網(wǎng)膜HE 染色

與假手術(shù)組（17.0±2.67）個(gè)/視野比較，模型組（8.5±2.07）個(gè)/視野及芍藥苷治療組（12.5±1.72）個(gè)/視野，RGCs 層細(xì)胞數(shù)量均減少（t模型組=7.965，t芍藥苷組=4.488，均P=0.000），但芍藥苷治療組RGCs 層細(xì)胞數(shù)量高于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-4.407，P=0.000）（圖1）。

2.3 TUNEL 檢測(cè)大鼠RGCs 凋亡

假手術(shù)組大鼠視網(wǎng)膜RGCs 層未見細(xì)胞凋亡；模型組大鼠RGCs 層凋亡細(xì)胞增多，（12.1±1.52）個(gè)/視野，且內(nèi)、外核層也可見少量凋亡細(xì)胞；芍藥苷治療組大鼠RGCs 層TUNEL 陽性細(xì)胞少量表達(dá)，（5.3±1.7）個(gè)/視野，與模型組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.410,P=0.000）（圖2）。

2.4 大鼠RGCs 中HO-1 的表達(dá)

HO-1 主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，散見于胞核中，陽性細(xì)胞呈片狀散布的棕褐色顆粒（圖3）。假手術(shù)組HO-1 蛋白平均光密度值為（0.45±0.13），高眼壓模型組HO-1 蛋白平均光密度值（0.5±0.3），芍藥苷治療組HO-1 蛋白平均光密度值（0.74±0.19）。3 組光密度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.657,P=0.004）。兩兩比較，模型組與假手術(shù)組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.05,P=0.31），但芍藥苷治療組則平均光密度值高于模型組（t=-2.306,P=0.017），有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

青光眼為全球第一大不可逆致盲性眼病[1]，尤其是亞洲后裔，并有一定的遺傳傾向。病理性高眼壓是青光眼危險(xiǎn)因素之一，但單純降低眼壓并不能有效控制視神經(jīng)病變的進(jìn)展。青光眼是一種視神經(jīng)變性類疾病，其發(fā)病核心是RGCs。RGCs 進(jìn)行性凋亡是視神經(jīng)損傷的主要要素。因此，加強(qiáng)預(yù)防和治療視神經(jīng)損傷尤為重要。

圖3 造模后兩周各組大鼠視網(wǎng)膜組織HO-1 蛋白表達(dá)免疫組化（×400）。3A 假手術(shù)組HO-1 蛋白弱陽性表達(dá)；3B 高眼壓模型組HO-1 陽性表達(dá)增多，著色加深；3C 芍藥苷治療組HO-1 蛋白表達(dá)比模型組表達(dá)數(shù)量多，著色更深，強(qiáng)陽性表達(dá)進(jìn)一步增多。HO-1：血紅素加氧酶-1

氧化應(yīng)激在發(fā)展和加速青光眼視神經(jīng)損傷中起關(guān)鍵作用[8]。氧化應(yīng)激反應(yīng)升高，視網(wǎng)膜自由基增加，使線粒體功能異常，能量代謝異常，導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡，同時(shí)自由基還可直接攻擊細(xì)胞的DNA，加快細(xì)胞凋亡[9]。在Liu Q 等[10]的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)下HO-1 在視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)增多。在高眼壓狀態(tài)下，大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)活性氧產(chǎn)生增多和脂質(zhì)過氧化增加等[11]，為響應(yīng)氧化損傷，機(jī)體會(huì)調(diào)動(dòng)抗氧化系統(tǒng)。HO-1 是體內(nèi)分布最普遍的抗氧化酶之一，其一方面可阻止游離血紅素參與氧化反應(yīng)，另一方面可通過其降解產(chǎn)物（膽紅素、CO、鐵離子）發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎、抑制凋亡和改善組織微循環(huán)的作用[12]。在本次實(shí)驗(yàn)中，模型組HO-1 表達(dá)輕度上調(diào)主要是機(jī)體自身抗氧化系統(tǒng)激活的結(jié)果。HO-1相關(guān)通路的激活顯著降低慢性高眼壓大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡和損傷，從而起到保護(hù)作用[13-14]。

芍藥苷是從毛茛科植物芍藥或者牡丹的根皮中提取的一種水溶性單萜苷，主要應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)或者神經(jīng)退行性疾病，近年其抗炎、抗氧化應(yīng)激、免疫調(diào)節(jié)活性等作用受到越來越多的關(guān)注。芍藥苷能下調(diào)活性氧、NO、H2O2、Ca2+等物質(zhì)，抑制氧化亢進(jìn)，并能活化Nrf2 等抗氧化通路，上調(diào)Nrf2 等因子及其下游抗氧化酶（HO-1）的水平[15-16]，保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷。芍藥苷能降低大鼠血糖及抑制膠質(zhì)細(xì)胞活化,上調(diào)視網(wǎng)膜GLAST、GS 表達(dá)，降低視網(wǎng)膜谷氨酸含量，對(duì)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜Müller 細(xì)胞具有保護(hù)作用[17]。另外，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)芍藥苷在急性高眼壓模型中可通過抑制NLRP3 炎癥小體信號(hào)通路保護(hù)視網(wǎng)膜[18]。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)芍藥苷在慢性高眼壓大鼠模型中能夠通過上調(diào)HO-1 的表達(dá)減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)初步證明在慢性高眼壓大鼠模型中，芍藥苷可抑制RGCs 的凋亡，其保護(hù)效應(yīng)可能是通過上調(diào)HO-1 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。HO-1 相關(guān)通路的激活減輕RGCs 凋亡與損傷，將為青光眼發(fā)病機(jī)制—氧化應(yīng)激學(xué)說提供支持證據(jù)，也確定了芍藥苷的視神經(jīng)作用機(jī)制。這將對(duì)于挽救視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的凋亡提供新的途徑和作用靶點(diǎn)。