厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動過程的影響因素及微生物群落變化研究進展

任 婧， 徐愛玲, 宋志文

(青島理工大學(xué) 環(huán)境與市政工程學(xué)院，山東 青島 266033)

當(dāng)前，水體氮素污染日益嚴重，極大地影響到環(huán)境和人體健康，采用常規(guī)硝化和異養(yǎng)反硝化脫氮工藝通常需要曝氣和外加有機碳源，并且產(chǎn)泥量多。厭氧氨氧化(Anaerobic Ammonium Oxidation, ANAMMOX)是新興的高效生物脫氮技術(shù)，對于填埋廠滲濾液、污泥消化池上清液及其他含高氨氮、低碳氮比廢水有較高的處理能力，是一種有效的處理方式[1]。1995年，van de Graaf等[2]在荷蘭某酵母生產(chǎn)企業(yè)污水處理系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)厭氧氨氧化菌的存在并提出了厭氧氨氧化菌代謝模型(圖1)，即亞硝酸鹽被亞硝酸鹽還原酶還原為羥胺(NH2OH)，聯(lián)氨水解酶催化羥胺和氨縮合成聯(lián)氨(N2H2)，最后，聯(lián)氨在聯(lián)氨氧化酶HZO(或羥胺氧化還原酶HAO)的催化下轉(zhuǎn)化成氮氣，同時釋放的電子通過傳遞鏈傳遞給亞硝酸鹽還原酶。厭氧氨氧化菌(Anaerobic ammonia oxidation bacteria, AnAOB)俗稱為“紅菌”，因富集培養(yǎng)物呈現(xiàn)紅色顆粒狀而得其名。Anammox菌對環(huán)境適應(yīng)性強，在污水處理廠活性污泥、海洋、淡水湖和河底土壤生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在，甚至在北極海底冰川中能夠存活，這為厭氧氨氧化菌的實際應(yīng)用提供了新的思路。然而，研究顯示此類微生物在最佳生長條件下代時約為10～12 d，Anammox緩慢地生長速率使其在污水處理系統(tǒng)中具有較低的污泥產(chǎn)量，導(dǎo)致啟動時間過長，通常情況下，啟動時間可能長達幾個月到幾年[3]，由此限制了其在廢水處理系統(tǒng)中的應(yīng)用[4]，因此探討快速有效的Anammox富集培養(yǎng)方法對厭氧氨氧化技術(shù)的推廣至關(guān)重要。本文綜述了國內(nèi)外厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動過程的影響因素及微生物群落變化的最新研究進展，并對該技術(shù)今后的研究方向提出了建議，期望對厭氧氨氧化領(lǐng)域的后續(xù)研究提供參考。

圖1 基于15N示蹤研究的代謝途徑Fig.1 Metabolic pathway based on 15N tracer study

1 厭氧氨氧化機理

反應(yīng)可以看成由兩個過程組成：①分解(產(chǎn)能)代謝：以氨為電子供體，亞硝酸鹽為電子受體，兩者以1∶1的比例反應(yīng)生成氮氣，并把產(chǎn)生的能量以ATP形式儲存起來；②合成代謝：以亞硝酸鹽為電子受體提供還原力，利用二氧化碳為碳源，以分解代謝產(chǎn)生的ATP為能源合成細胞物質(zhì)，并在該過程中產(chǎn)生硝酸鹽[5]。

2 Anammox菌富集培養(yǎng)裝置

上流式厭氧污泥床(Up-flow anaerobic sludge blanket reactor, UASB)是目前最受歡迎的用于廢水厭氧生物處理反應(yīng)器，由lettinga等在20世紀70年代開發(fā)[6]。與傳統(tǒng)的厭氧處理相比，UASB反應(yīng)器的優(yōu)勢在于污泥持留量高、容積負荷高，反應(yīng)器可以在較短的水力停留時間下運行。

UASB反應(yīng)器通常由四個部分組成：①顆粒污泥床；②流化區(qū)；③氣固分離器；④沉降室。UASB反應(yīng)器裝置構(gòu)造見圖2。

圖2 UASB系統(tǒng)裝置圖Fig.2 Schematic diagram of the UASB system

3 影響厭氧氨氧化反應(yīng)的因素

3.1 溫度

溫度會影響微生物的活性，厭氧氨氧化細菌對溫度條件要求很高，并且不同種類的厭氧氨氧化細菌對溫度要求不同[7]。De等[8]研究了溫度降低(從35 ℃降至20 ℃)對厭氧氨氧化序批式反應(yīng)器(SBR)脫氮性能和微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響。結(jié)果表明，氨氮和亞硝態(tài)氮的平均去除率在富集期的第一階段(35 ℃)和第二階段(25 ℃)較高(96%)，在20 ℃運行時略有下降(90%)。同時，溫度降低會改變微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性。當(dāng)反應(yīng)器溫度從35 ℃降至20 ℃時Chloroflexi(綠彎菌門)的相對豐度從36%降至16%，由于該門細菌大多數(shù)嗜熱，低溫會導(dǎo)致細菌活性和代謝降低。此外，在具有厭氧氨氧化活性的反應(yīng)器中，Chloroflexi利用的碳源主要來自細胞裂解，低溫條件下細胞衰減率可能會降低，因此限制了Chloroflexi的生長。Li等[9]研究了厭氧氨氧化序批式反應(yīng)器(SBR)在較低氮負荷率(NLR)(0.28 kgN/(m3/d))時，不同溫度下的脫氮性能和微生物群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明，當(dāng)溫度從(33±1) ℃下降到(15±1) ℃時，脫氮性能明顯下降(P<0.05)，出水氮化合物急劇增加，NVLR容量從(0.70 ± 0.05) mgN/(L·h)降至(0.55 ±0.08) mgN/(L·h)，說明在較低溫度下Anammox活性受到抑制，Gonzalez-Martinez等[10]利用亞硝酸鹽(CANON)生物反應(yīng)器通過降溫(從35 ℃到15 ℃)處理厭氧消化物，并通過降低氨濃度(從466 mgN/L降至100 mgN/L)觀察反應(yīng)器除氮性能，表明在低溫下氮去除性能明顯下降。但也有研究發(fā)現(xiàn)，不同環(huán)境下Anammox菌有不同的適宜溫度，在格陵蘭島的海洋沉積物中，Anammox的最適溫度為12 ℃[11]。說明海洋厭氧氨氧化菌適宜的溫度范圍比污水廠低得多，可以在較低溫度下處理含海水污水[12]。

3.2 溶解氧

Anammox菌是厭氧微生物，對溶解氧非常敏感，溶解氧過高對厭氧氨氧化活性有抑制作用，但該抑制過程是可逆的[13]。Carvajal-Arroyo等[14]研究DO含量為(1.0～8.0) mg/L時厭氧氨氧化反應(yīng)器的處理效果，發(fā)現(xiàn)在DO為8.0 mg/L時，Anammox菌活性嚴重抑制，在DO為1.0 mg/L時，僅觀察到20%以下的部分Anammox菌活性受到抑制，而Anammox菌在低水平的溶解氧下可以保持相當(dāng)大的活性。溶解氧抑制作用的強弱與富集期間使用的反應(yīng)器類型有關(guān)。在UASB反應(yīng)器中，溶解氧濃度為0.30 mg/L對厭氧氨氧化活性沒有明顯影響，Jetten等[15]利用SBR反應(yīng)器研究了氧氣對Anammox過程的影響，控制DO濃度從2%逐漸降低到0，實驗結(jié)果表明，在0.5%、1%和2%DO條件下，氨氮沒有被氧化。向反應(yīng)器內(nèi)通入氬氣除去所有空氣后，氨氮和亞硝酸氮的轉(zhuǎn)化才得以恢復(fù)，說明SBR反應(yīng)器內(nèi)的Anammox菌只有在嚴格厭氧條件下才能保持穩(wěn)定的活性。Wang等[16]使用不含氨和亞硝酸鹽的合成廢水洗滌Anammox污泥直至檢測不到氨和亞硝酸鹽，將Anammox污泥等量轉(zhuǎn)移到2個“饑餓”反應(yīng)器(即滴加式半間歇反應(yīng)器)中進行批量實驗，通過氨去除率、活/死菌染色和熒光原位雜交實驗研究了經(jīng)過84 d饑餓脅迫期間Anammox菌的活性變化，Anammox菌的厭氧和好氧衰變率分別為(0.015± 0.001) /d和(0.028± 0.001) /d，表明與厭氧饑餓條件相比，Anammox菌在有氧饑餓條件下會更快地失去活性。Kalvelage等[17]研究發(fā)現(xiàn)，Anammox菌對溶解氧適應(yīng)的濃度上限為20 μmol/L，也有文獻報道在Anammox反應(yīng)器中最高DO濃度為1.5 mg/L。

3.3 pH

3.4 鹽度

Anammox菌活性和反應(yīng)器除氮性能受鹽度影響很大。當(dāng)廢水中含鹽量過高時，會破壞Anammox菌細胞膜和胞內(nèi)酶，對菌體生長產(chǎn)生抑制作用。Dapena-Mora等[22]發(fā)現(xiàn)當(dāng)鹽度添加到20 g/L時SAA值(厭氧氨氧化活性)會降低，低鹽度對Anammox菌活性有利，淡水厭氧氨氧化菌在鹽度為10 g/L時具有最大厭氧氨氧化率。Meng等[23]研究了鹽度變化對厭氧氨氧化細菌功能蛋白的影響，結(jié)果表明，反應(yīng)器內(nèi)鹽度從0 g/L增加到20 g/L，導(dǎo)致厭氧氨氧化反應(yīng)器脫氮性能下降，有18種蛋白質(zhì)含量降低，血紅蛋白(I3IPU4)和血紅素合成蛋白(I3IL00)急劇減少，說明在高鹽度下Anammox菌活性受到抑制。Jiang等[24]在鹽度梯度(0%～40%)下進行了連續(xù)培養(yǎng)實驗，研究了長江口潮間濕地厭氧氨氧化菌活性、多樣性和豐度對鹽度變化的響應(yīng)，結(jié)果表明，對Anammox進行長期培養(yǎng)(120 d)，當(dāng)鹽度為5 g/L時，表現(xiàn)出最大的厭氧氨氧化細菌的活性和豐度，在短時間內(nèi)(10 d)當(dāng)鹽度介于(0～20) g/L之間時，Anammox菌活性和豐度會隨鹽度的增加而增加，但當(dāng)鹽度增加到30 g/L，其活性明顯減弱，與Engelbrecht等[25]研究結(jié)果一致。此外，鹽度的長期影響比短期影響更明顯，鹽度的急劇變化比鹽度逐漸增加對Anammox菌的影響更大，Yang等[26]發(fā)現(xiàn)鹽度從14 g/L急劇增加到20 g/L時，厭氧氨氧化反應(yīng)器性能完全抑制。Anammox菌對高鹽度敏感是阻礙厭氧氨氧化工藝在含氮廢水處理中應(yīng)用的關(guān)鍵因素，目前關(guān)于經(jīng)過高鹽度抑制后的厭氧氨氧化過程性能恢復(fù)的研究還比較少。

3.5 抗生素

污水處理過程中抗生素的出現(xiàn)與積累越來越受到關(guān)注，國內(nèi)外已有大量關(guān)于抗生素對厭氧氨氧化反應(yīng)影響的研究報道。抗生素對厭氧氨氧化菌的影響可分為短期抑制和長期抑制，其中青霉素G和土霉素對厭氧氨氧化菌活性的長期抑制遠遠大于短期抑制。馬靜等[27]通過考察青霉素、土霉素和硫酸多粘菌素對厭氧氨氧化顆粒污泥活性的短期抑制特性，結(jié)果表明，硫酸多粘菌素對厭氧氨氧化顆粒污泥的活性抑制作用最強，其次是土霉素和青霉素，厭氧氨氧化顆粒污泥對3種抗生素具有較好的耐受能力。多粘菌素對Anammox菌的活性抑制作用強的原因可能是多粘菌素為多肽類抗生素，能殺死大多數(shù)革蘭陰性菌。Zhang等[28]研究了兩種抗生素(諾氟沙星(NOR)和紅霉素(ERY))對Anammox菌生物膜的長期影響，表明NOR不僅會降低Anammox的活性，還會降低其功能性O(shè)TU豐度，而向Anammox系統(tǒng)中添加ERY，可以誘導(dǎo)細菌體內(nèi)ermB和mphA兩個基因的擴增，其中ermB具有抵抗ERY的作用，mphA可以使ERY失活，因此Anammox菌的活性和功能性O(shè)UT沒有明顯變化。

3.6 污泥來源

選擇合適的接種污泥或菌劑作為接種物是快速啟動厭氧氨氧化反應(yīng)器的關(guān)鍵。研究發(fā)現(xiàn)，Anammox菌適宜生存在同時有氨鹽和亞硝酸鹽的環(huán)境中。這種環(huán)境通常存在于好氧-厭氧環(huán)境中沉積物或水體的界面。目前，不同類型的污泥已被作為用來快速啟動厭氧氨氧化反應(yīng)器的接種物，常見的主要有好氧硝化污泥、厭氧消化污泥、厭氧顆粒污泥、海水底泥以及上述幾種的混合污泥。研究發(fā)現(xiàn)，在上流式厭氧污泥床(UASB)反應(yīng)器中接種成熟的厭氧氨氧化物顆粒用于厭氧氨氧化菌富集，在兩周內(nèi)成功富集了厭氧氨氧化細菌，縮短了厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動時間[29]。在有機物耐受方面，顆粒污泥比絮凝污泥更具有優(yōu)勢。反應(yīng)器在啟動過程中通常添加富集的厭氧氨氧化污泥，但這樣在含氮廢水的處理中具有局限性[30]。為了快速啟動厭氧氨氧化反應(yīng)器，國內(nèi)外許多研究者對接種污泥的選擇進行了大量實驗并取得了一定的進展。李瑩瑩[31]采用厭氧序批式反應(yīng)器，對5種不同類型的污泥進行厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動，結(jié)果如表1所示。接種不同污泥對厭氧氨氧化反應(yīng)啟動存在差別，好氧顆粒污泥未能成功富集Anammox菌，在成功富集出的4種污泥中，污泥源中C/N越低，反應(yīng)器啟動時間越短，與Sheng等[32]研究的結(jié)果相似，當(dāng)C/N比增加時，Anammox菌豐度會相對減少。高氮厭氧污泥啟動時間最短，但在實際應(yīng)用過程中較難獲得，而混合污泥較為廣泛，可作為富集Anammox菌的泥源。

4 厭氧氨氧化接種物選擇的分子鑒定

由于厭氧氨氧化細菌生長速度極為緩慢，目前仍沒有成功分離出其純菌種，因此分子技術(shù)成為用于鑒定Anammox菌最廣泛的方法。利用PCR方法對各種污泥中的厭氧氨氧化細菌進行鑒定，具有快速、操作簡單、價格低廉等優(yōu)點。表2中列舉了用于厭氧氨氧化菌鑒定使用的引物序列。

5 厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動過程中群落結(jié)構(gòu)特征

到目前為止，研究發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌共有7個屬：Kuenenia、Brocadia、Anammoxoglobus、Brasilis、Jettenia、Scalindua、Anammoximicrobium；20個種[40]。表3中列舉了目前已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌。其中大多數(shù)來自污水處理系統(tǒng)中的活性污泥，還有一部分來自海洋與河流沉積物。

表1 不同接種污泥對厭氧氨氧化反應(yīng)器啟動的影響[30]

Table 1 Influence of different inoculation sludge on start-up of anammox reactor[30]

表2 用于厭氧氨氧化菌鑒定的16S rRNA基因PCR擴增引物

注：a表示實時定量熒光PCR

表3 目前已發(fā)現(xiàn)的厭氧氨氧化菌

楊瑞麗等[60]對啟動成功Anammox工藝中的污泥樣品進行群落結(jié)構(gòu)分析，于浮霉菌門中檢測到4個Anammox菌屬：CandidatusJettenia、Ca.Kuenenia、Ca.Brocadia和Ca.Anammoximicrobium屬，占測序總數(shù)的1.65%，Ca.Jettenia和Ca.Kuenenia是反應(yīng)器中主要的Anammox菌屬。譚錫誠等[61]分析了UASB系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果表明，厭氧氨氧化優(yōu)勢菌種由Ca.Brocadia(20 d)變?yōu)镃a.Jettenia和Ca.Kuenenia的混合菌種(134 d)。姚芳等[62]分別接種城市污水處理廠活性污泥(A)和厭氧顆粒污泥(B)啟動厭氧氨氧化反應(yīng)器，經(jīng)過119 d的啟動，A反應(yīng)器中Ca.Brocadia豐度可以達到11.34%，而B反應(yīng)器中Ca.Brocadia豐度僅為7.28%。汪瑤琪等[63]通過高通量測序法對不同負荷情況下反應(yīng)器污泥群落結(jié)構(gòu)進行檢測，發(fā)現(xiàn)綠彎菌門 (Chloroflexi)、變形菌門(Proteobacteria)、WWE3門、放線菌門(Actinobacteria)、浮霉菌門(Planctomycetes)是優(yōu)勢菌門，其中浮霉菌門中檢測出有Ca.Brocadia、Ca.Jettenia、Ca.Kuenenia等，Ca.Brocadia增幅最大，其豐度從0.07% 增至13.40%。Ca.Scalindua屬主要分布在海洋環(huán)境中，而其他幾個屬廣泛存在于淡水環(huán)境中。在Scalindua屬中，已經(jīng)鑒定出兩種海洋分子分離物，其中一種，在黑海的缺氧水柱中發(fā)現(xiàn)，暫定名為S.sorokinii[38]，另一種在蘭德爾峽灣的底泥中被發(fā)現(xiàn)[64]。

6 展 望

近年來，同時具備脫氮和能量自給的反應(yīng)工藝是污水處理的目標，與傳統(tǒng)的硝化反硝化相比，厭氧氨氧化工藝具有污泥產(chǎn)量較低、無需曝氣、成本低且不產(chǎn)生二次污染的優(yōu)點。實現(xiàn)反應(yīng)器快速啟動并能夠穩(wěn)定運行是目前厭氧氨氧化技術(shù)投入到工程應(yīng)用的關(guān)鍵，綜上所述，選擇適宜的溫度、溶解氧、pH、鹽度、抗生素、接種污泥等進行富集培養(yǎng)，可有效地促進Anammox菌的快速增長，提高富集培養(yǎng)器的啟動時間。目前所發(fā)現(xiàn)并報道的Anammox菌有7個屬、20個種，并廣泛分布于各種環(huán)境中，可應(yīng)用于不同來源廢水的處理與處置。雖然目前還無法通過傳統(tǒng)微生物學(xué)的方法對其進行深入研究，但是分子生態(tài)學(xué)方法的引入使得該領(lǐng)域的研究已經(jīng)進入了一個嶄新的階段。