基于轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)研究川芎嗪對急性脊髓損傷模型大鼠基因表達(dá)的影響

張毅　祁文　吳迪　謝旻成

中圖分類號 R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2020）11-1327-09

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.08

摘 要 目的：探討川芎嗪對急性脊髓損傷（SCI）模型大鼠基因表達(dá)的影響。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組，6只），模型組（B組，不同時間點(diǎn)各6只，共12只）和川芎嗪干預(yù)組（C組，不同時間點(diǎn)各6只，共12只）。B、C組大鼠參照改良Allens法復(fù)制急性SCI模型。造模后，C組大鼠腹腔注射川芎嗪100 mg/kg，A、B組大鼠腹腔注射等容生理鹽水，每日1次，持續(xù)7 d或14 d（分別記為B7 d、B14 d組和C7 d、C14 d組）。分別于造模前和造模后7、14 d對各組大鼠進(jìn)行BBB評分，并行脊髓標(biāo)本蘇木精-伊紅、尼氏染色觀察;采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析A組與B組、B組與C組大鼠脊髓標(biāo)本中的差異表達(dá)基因（DEGs），借助基因本體（GO）數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO和KEGG信號通路富集分析。結(jié)果：與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d的BBB評分均顯著降低（P<0.05），其脊髓組織中的神經(jīng)細(xì)胞和尼氏體數(shù)量明顯減少;與B組比較，C組大鼠上述時間點(diǎn)的BBB評分均顯著升高（P<0.05），其脊髓組織中的神經(jīng)細(xì)胞和尼氏體數(shù)量有所增多。A組和B7 d組、A組和B14 d組、B7 d組和C7 d組、B14 d組和C14 d組大鼠的DEGs分別有886、1 404、70、66個，組間表達(dá)變化趨勢相反的基因包括Ncmap、Prx、Gabrq、Gabrg2等。各組間DEGs富集的細(xì)胞部位、分子功能、生物學(xué)過程各有不同，主要涉及溶泡、溶酶體、質(zhì)膜部分、同型蛋白結(jié)合、免疫應(yīng)答、離子通道活性、免疫反應(yīng)（A組和B組），基底外側(cè)質(zhì)膜、外脫氧核糖核酸酶活性、對干擾素γ的反應(yīng)（B7 d組和C7 d組），以及細(xì)胞外區(qū)、受體調(diào)節(jié)活性、含酚化合物代謝過程（B14 d組和C14 d組）等;同時，DEGs富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（A組和B組），細(xì)胞黏附分子、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、Hedgehog信號通路（B7 d組和C7 d組），逆行內(nèi)源性大麻素信號、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、過氧化物酶體增殖物激活受體信號通路、γ-氨基丁酸（GABA）能突觸（B14 d組和C14 d組）等信號通路。結(jié)論：川芎嗪對急性SCI模型大鼠的保護(hù)作用可能與其參與炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答/調(diào)節(jié)、離子通道、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、GABA能突觸活性調(diào)節(jié)等有關(guān)。

關(guān)鍵詞 川芎嗪;急性脊髓損傷;轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù);差異表達(dá)基因;基因本體;KEGG信號通路;機(jī)制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of ligustrazine on gene expression of acute spinal cord injury （SCI） model rats. METHODS： Male SD rats were randomly divided into sham operation group （group A， 6 rats）， model group （group B， 6 rats at each time point， 12 rats in total） and ligustrazine intervention group （group C， 6 rats at each time point， 12 rats in total）. Acute SCI model was established by modified Allens method in group B and C. After modeling， group C was given ligustrazine 100 mg/kg intraperitoneally， while group A and B were given constant volume of normal saline intraperitoneally， once a day， for consecutive 7 d or 14 d （i.e. group B7 d and B14 d， group C7 d and C14 d）. BBB scoring was conducted in each group before modeling， 7 and 14 days after modeling. HE and Nissl staining observation were also carried out for spinal cord specimen. The differentially expressed genes （DEGs） between group A and group B， group B and group C were analyzed by transcriptome sequencing. The enrichment of Gene Ontology （GO） and KEGG signaling pathway was analyzed by GO database and KEGG database. RESULTS： Compared with group A， BBB scores of group B were decreased significantly 7 d and 14 d after modeling （P<0.05）， and the number of nerve cells and Nissl body in spinal cord tissue were decreased. Compared with group B， BBB scores of group C were increased significantly at above time points （P<0.05）， and the number of nerve cells and Nissl body in spinal cord tissue were increased. The numbers of DEGs of group A and group B7 d， group A and group B14 d， group B7 d and group C7 d， group B14 d and group C14 d? were 886， 1 404， 70， 66， respectively. The genes with opposite expression trend included Ncmap， Prx， Gabrq， Gabrg2， etc. The enrichment cell component， molecular function， biological process of DEGs were different in each group， mainly involving lyocytosis， lysosome， plasma membrane， homotype protein binding， immune response， ion channel activity， immune response （group A and B）; basolateral plasma membrane， exodeoxyribonuclease activity， response to INF-γ （group B7 d and C7 d）; extracellular domain， receptor regulatory activity， phenolic compound metabolism process （group B14 d and C14 d）. DEGs enriched in cytokine-cytokine receptor interaction （group A and B）; CAMs， complement and coagulation cascades and Hedgehog signaling pathway （group B7 d and C7 d）; retrograde endocannabinoid signaling， neuroactive ligand-receptor interaction， PPAR signaling pathway， GABA ergic synapse （group B14 d and C14 d）， etc. CONCLUSIONS： Protective effect of ligustrazine on acute SCI model rats may be associated with inflammatory response， immune response/regulation， neuron ion channel， cytokine-cytokine receptor interaction， neuroactive ligand-receptor interaction and regulation of GABA ergic synapse activity.

KEYWORDS? ?Ligustrazine; Acute spinal cord injury; Transcriptome sequencing; Differentially expressed gene; Gene Ontology; KEGG signaling pathway; Mechanism; Rats

脊髓損傷（Spinal cord injury，SCI）是一種因高能量損傷而導(dǎo)致的嚴(yán)重性致殘性疾病。在全世界范圍內(nèi)，由于收集數(shù)據(jù)的方式以及結(jié)果推算的技術(shù)不同，不同地區(qū)SCI的發(fā)病率差別很大，從236/100萬到4 187/100萬不等[1]。最近的一項(xiàng)二次研究顯示，我國SCI每年的發(fā)病率約為37/100萬[2]。SCI在中醫(yī)上屬于“體惰”“癱證”“痿躄”范疇，為督脈損傷所導(dǎo)致的其他經(jīng)絡(luò)、氣血、臟腑功能障礙[3]。近年來，中醫(yī)藥治療SCI的相關(guān)研究有所增多。川芎嗪（即四甲基吡嗪）是從中藥川芎中分離出的一種生物堿，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡、改善微循環(huán)等作用，臨床上多用于治療各種缺血再灌注損傷[4-5]。SCI的原發(fā)性損傷大多不可逆，繼發(fā)性損傷則是緊接原發(fā)性損傷之后的由類似于“雪崩式”損傷激活的自身損傷過程，包括缺血、出血、脊髓休克、水電解質(zhì)紊亂、自由基增多、一氧化氮改變等，可引起持續(xù)性的細(xì)胞損害，甚至可引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞凋亡[6-7]。近年來，學(xué)者對SCI的研究逐漸轉(zhuǎn)向多基因參與、復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)調(diào)控等分子水平發(fā)展。轉(zhuǎn)錄組測序是當(dāng)前最有效的高通量技術(shù)，可快速檢測和發(fā)現(xiàn)細(xì)胞或器官在特定條件下所有基因、功能基因及其轉(zhuǎn)錄的調(diào)控規(guī)律[8]?；诖耍狙芯吭趧游飳?shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，借助轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析川芎嗪干預(yù)急性SCI模型大鼠基因表達(dá)的影響并尋找差異表達(dá)基因（DEGs），并對其進(jìn)行基因本體（GO）和KEGG信號通路富集分析，以期為進(jìn)一步探索川芎嗪治療SCI的分子機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2100型生物分析儀（美國Agilent公司）;Hiseq X-ten型高通量轉(zhuǎn)錄組測序儀（美國Illumina公司）;CK31型正置光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;TVO 63XC-MO型顯微數(shù)碼成像系統(tǒng)（廣州市明美光電技術(shù)有限公司）;Pannoramic SCAN型數(shù)字全掃儀器（匈牙利3DHISTECH公司）;ImpactorModelⅠ型打擊儀（安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司）;KD-BM型包埋機(jī)、KD-2258型病理切片機(jī)、KD-P型攤片機(jī)、KD-BL型冷凍臺（浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司）;PHG-9070A型烤箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;JJ124BC型分析天平（常熟雙杰測試儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

注射用鹽酸川芎嗪（北京四環(huán)科寶制藥有限公司，批號：18110345，規(guī)格：80 mg;臨床用量：80～120 mg/次，每日1次）;氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號：A18122701-1，規(guī)格：500 mL ∶ 4.5 g，作生理鹽水用）;注射用青霉素（山東圣旺藥業(yè)股份有限公司，批號：20180301，規(guī)格：167萬單位）;Ambion Trizol試劑盒（美國Life Technologies公司，批號：15596018）;多聚甲醛（美國Sigma公司）;尼氏體染色液（北京索萊寶科技有限公司）;蘇木精-伊紅（HE）染色液、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.0）均為本實(shí)驗(yàn)室自制;無水乙醇、二甲苯等其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級健康SD大鼠30只，雄性，6～8周齡，體質(zhì)量200～230 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，動物生產(chǎn)合格證號：SCXK（湘）2016-0002。所有動物均單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度為20～28 ℃。

2 方法

2.1 造模

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組（A組，6只）、模型組（B組，共12只;不同時間點(diǎn)各6只，分別記為B7 d、B14 d組）和川芎嗪干預(yù)組（C組，共12只;不同時間點(diǎn)各6只，分別記為C7 d、C14 d組）。禁食、不禁水8 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.3 mg/kg）麻醉，以第9胸椎（T9）為中心，咬除椎板，暴露長約5 mm的脊髓。A組大鼠止血縫合;B、C組大鼠利用打擊儀參照改良Allens法復(fù)制急性SCI模型：以棘突固定器鉗夾固定胸椎T8、T10棘突，調(diào)節(jié)T9節(jié)段脊髓水平，用直徑2.5 mm、質(zhì)量10 g的撞針自2.5 cm高處自由落下垂直撞擊T9脊髓后正中部（致傷能量：25 gcf），撞擊后迅速移除撞針。以肉眼可見脊髓組織腫脹、出血以及大鼠擺尾反射、雙下肢回縮樣撲動且麻醉清醒后呈遲緩性癱瘓為造模成功[9]，縫合術(shù)后皮下注射青霉素8萬單位，每日1次、持續(xù)3 d。人工按摩大鼠膀胱排尿，每日2次，直至其恢復(fù)自主排尿。

2.2 給藥

造模成功后，C組大鼠腹腔注射川芎嗪（藥液質(zhì)量濃度為10 mg/mL，以生理鹽水配制;給藥量為100 mg/kg，劑量根據(jù)該藥臨床用量并按人與動物體表面積換算而得），A、B組大鼠均腹腔注射等容生理鹽水。首次給藥應(yīng)在術(shù)后30 min內(nèi)，每日1次，分別持續(xù)7 d或14 d。

2.3 大鼠神經(jīng)功能行為學(xué)觀察及評分

分別于造模前和造模后7、14 d時對各組大鼠進(jìn)行BBB評分：將大鼠放入開口圓盆中，使其自由直線行走，盡量令其在盆內(nèi)的中心區(qū)域活動。測試時間為4 min，觀察大鼠在行走過程中膝、髖和踝關(guān)節(jié)的運(yùn)動幅度、軀干運(yùn)動和協(xié)調(diào)情況并計分;總分為21分，分?jǐn)?shù)高低與大鼠SCI程度呈反比[10]。評分由兩位研究者獨(dú)立完成，取平均值作為評分結(jié)果。

2.4 標(biāo)本的采集與指標(biāo)檢測

2.4.1 標(biāo)本的采集 分別于造模后7、14 d時取B、C組大鼠各6只，于造模后14 d時取A組大鼠6只，均于耳緣靜脈注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液（30 mg/kg）麻醉后，于左心室灌注生理鹽水約30 mL，再用4%多聚甲醛溶液30 mL灌注至肢體強(qiáng)直，以脊髓受損處（A組大鼠于對應(yīng)位置）為中心，取出上下各長約0.5 cm的脊髓，備用。

2.4.2 HE、尼氏染色觀察 每組在相應(yīng)時間點(diǎn)取3只大鼠的脊髓標(biāo)本適量，置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜，次日經(jīng)常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋后切片（厚度約4? ? ? ? ?μm）。切片分別經(jīng)HE、尼氏染色后，置于顯微鏡下觀察并拍照，記錄大鼠脊髓損傷及恢復(fù)情況[經(jīng)HE染色后，神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)紫色;經(jīng)尼氏染色后，尼氏體呈塊狀（如虎斑狀）或顆粒狀]。

2.4.3 DEGs分析 每組在相應(yīng)時間點(diǎn)取另外3只大鼠的脊髓標(biāo)本適量，采用Ambion Trizol試劑盒提取總RNA，選擇質(zhì)量合格[即經(jīng)生物分析儀檢測，RNA完整值（RIN）≥7;28S/18S≥1.5，且起始量為0.1～1 μg][11]的總RNA作為mRNA測序的建庫起始樣品，經(jīng)mRNA純化及片段化、cDNA合成、文庫片段富集、文庫質(zhì)檢后，采用二代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)以高通量轉(zhuǎn)錄組測序儀對上述文庫進(jìn)行雙末端（PE）測序。使用Cutadapt v1.15軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，去除3′端帶接頭的序列、平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)低于Q20的序列，以保證測序錯誤率<1%;使用FastQC v0.11.8軟件對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行單堿基質(zhì)量分布、含量分布、Reads值平均質(zhì)量分布檢測，以評估測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量;使用HISAT 2.0軟件將過濾后的Reads值與Ensembl數(shù)據(jù)庫（http：//www.ensembl.org/）中的參考基因組（共有基因22 250個）進(jìn)行對比。根據(jù)比對結(jié)果，使用HTSeq v0.11.1軟件統(tǒng)計各比對基因的Reads值，并將該值作為此基因的原始表達(dá)量。使用FPKM（Fragments per kilobase million，即在每百萬個Reads值中，來自某基因每千個堿基長度的Reads值）對表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，使用RSeQC v2.6.4軟件分析表達(dá)量飽和度，并以Pearson相關(guān)系數(shù)表示樣本間基因表達(dá)模式的相關(guān)性，并制作成熱圖（重復(fù)樣本間的相關(guān)系數(shù)越接近于1，表明相關(guān)性越強(qiáng)[12]）。在此基礎(chǔ)上，對不同樣本進(jìn)行表達(dá)分析，采用DESeq V3.10軟件對各組基因表達(dá)量（以經(jīng)FRKM進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的Reads值表示）進(jìn)行差異分析，以表達(dá)差異倍數(shù)log2FC>1且P<0.05的基因?yàn)镈EGs[13-14]，并繪制各組間共有、特有DEGs的Upset圖。

2.5 生物學(xué)分析

以“2.4”項(xiàng)下所得DEGs為對象，借助GO數(shù)據(jù)庫（http：//geneontology.org/）中的“topGO”插件進(jìn)行GO富集分析，挖掘DEGs涉及的生物學(xué)過程（BP）、細(xì)胞組分（CC）和分子功能（MF）;借助KEGG數(shù)據(jù)庫（http：//www.kegg.jp/）進(jìn)行KEGG通路富集分析，挖掘DEGs富集的主要信號通路。兩者均以P<0.05為顯著富集。

2.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠BBB評分結(jié)果

造模前，各組大鼠的BBB評分均為21分。與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著降低;與B組比較，C組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著升高（P<0.05），詳見表1。

3.2 HE、尼氏染色觀察結(jié)果

經(jīng)HE染色后，A組大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)正常，胞核清晰可見;B組大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞核固縮，且數(shù)量明顯減少;C組大鼠脊髓神經(jīng)細(xì)胞破損程度較同一時間點(diǎn)的B組要輕，詳見圖1A。經(jīng)尼氏染色后，A組大鼠尼氏體呈塊狀（形如虎斑）或顆粒狀;B組大鼠尼氏體染色變淺，數(shù)量明顯減少，在7 d時幾乎消失;C組大鼠尼氏體的數(shù)量較同一時間點(diǎn)的B組明顯增多，詳見圖1B。

3.3 DEGs分析結(jié)果

測序所得數(shù)據(jù)的質(zhì)量檢測結(jié)果顯示，大部分序列的堿基質(zhì)量均在Q20以上，未出現(xiàn)堿基偏移;中等表達(dá)的基因占大多數(shù)，而低表達(dá)、高表達(dá)的基因占比較小，見圖2[圖中，A、B、C分別對應(yīng)A、B、C組，數(shù)字對應(yīng)各組大鼠序號，“7 d”“14 d”分別表示造模后7 d、造模后14 d（下同）;盒型中間的橫線是中位數(shù)，盒型的上下邊緣為75%lgFRKM，上下限為90%lgFRKM];樣本間基因表達(dá)模式的Pearson相關(guān)系數(shù)均大于0.8，提示各樣本選擇合理、生物重復(fù)性較好，見圖3（圖中，左側(cè)和上側(cè)為樣本聚類情況，方塊中的數(shù)據(jù)為Pearson相關(guān)系數(shù)）。

在此基礎(chǔ)上，對各組間的DEGs進(jìn)行篩選，各組差異分析共有、特有DEGs的Upser圖見圖4（圖中，“number in each set”表示各組鑒定到的差異基因的總數(shù)，“number of each intersection”表示多個比較組鑒定到的共有差異基因的數(shù)目;橫坐標(biāo)的單一“·”表示該組鑒定到的特有差異基因的數(shù)目，橫坐標(biāo)多個“·”之間的連線所對應(yīng)的“number of each intersection”表示連線連接的多個比較組鑒定到的共有差異基因的數(shù)目）。結(jié)果，A組和B7 d組、A組和B14 d組、B7 d組和C7 d組、B14 d組和C14 d組大鼠比較，分別涉及DEGs 886、1 404、70、66個，詳見表2;涉及Ncmap、Prx、Gabrq、Gabrg2等基因，部分DEGs篩選結(jié)果見表3。

3.4 生物信息學(xué)分析

由于生物過程條目眾多，故本研究根據(jù)P值大小將排序前10位的GO富集結(jié)果進(jìn)行展示，詳見圖5（圖中，CC為細(xì)胞部位，MF為分子功能，BP為生物過程;MHC為主要組織相容性復(fù)合體，LUBAC為線性泛素裝配復(fù)合體，IFN-γ為γ干擾素，CRLF為細(xì)胞因子受體樣因子，CLCF1為心肌營養(yǎng)素樣細(xì)胞因子1，CNTFR為睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子受體，GABA為γ-氨基丁酸）。根據(jù)FDR值（FDR即未發(fā)現(xiàn)率，一般取值范圍為0～1，越接近于零則表示富集越顯著[15]）大小將排序前20位的KEGG富集結(jié)果（P<0.05）進(jìn)行展示，詳見圖6（圖中，HLTV-1為人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒1，CAMs為細(xì)胞黏附因子，TNF為腫瘤壞死因子，F(xiàn)oxO為叉頭框蛋白O，PPAR為過氧化物酶體增殖物激活受體）。

3.4.1 A組與B組 GO富集分析結(jié)果（圖5A、5B）顯示，A、B組DEGs富集的BP主要與免疫系統(tǒng)過程、生物過程調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞激活等有關(guān)，具體包括免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)、對細(xì)胞因子的反應(yīng)等。兩組DEGs富集的CC主要為細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞膜、細(xì)胞表面等部位，還涉及到MHC蛋白復(fù)合物、炎癥復(fù)合物（A組vs. B7 d組）和受體復(fù)合物（A組vs. B14 d組）、溶酶體（A組vs. B組）等。在MF中，兩組DEGs均富集于結(jié)合，包括蛋白質(zhì)結(jié)合、陰離子結(jié)合、陰離子配位等，同時還涉及半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合、趨化因子受體結(jié)合等受體結(jié)合（A組vs. B7 d組）以及被動跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、底物比通道活性等轉(zhuǎn)運(yùn)活性（A組vs. B14 d組）。KEGG富集分析結(jié)果（圖6A、6B）顯示，A、B組的DEGs主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、CAMs、吞噬體、類固醇生物合成、抗原處理和呈遞、自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)等信號通路上。

3.4.2 B組與C組 ①B7 d組與C7 d組：GO富集分析結(jié)果（圖5C）顯示，兩組DEGs主要富集于與免疫應(yīng)答、神經(jīng)元保護(hù)、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)等BP上，主要包括對IFN-γ的反應(yīng)、電壓門控鈉離子通道的聚集、髓鞘形成、神經(jīng)鞘、神經(jīng)元離子通道聚集、固有免疫應(yīng)答、羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)等。DEGs主要富集的CC包括基底外側(cè)質(zhì)膜、質(zhì)膜區(qū)、刷狀緣等部位，主要具有外脫氧核糖核酸酶活性、二羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、鈣離子結(jié)合等MF。KEGG富集分析結(jié)果（圖6C）顯示，兩組的DEGs主要富集于CAMs、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)、Hedgehog信號通路等信號通路上。②B14 d組與C14 d組：GO富集分析結(jié)果（圖5D）顯示，兩組DEGs富集的BP主要與含酚化合物代謝過程、細(xì)胞對內(nèi)源性刺激的反應(yīng)等有關(guān)，包括對兒茶酚類化合物代謝過程、對氮化合物的反應(yīng)、有機(jī)氮化合物的細(xì)胞反應(yīng)等。DEGs主要富集于細(xì)胞外區(qū)、細(xì)胞外間隙、頂體內(nèi)膜、頂體外膜等部位，涉及CRLF-CLCF1復(fù)合體、CNTFR-CLCF1絡(luò)合物、GABA受體復(fù)合體、GABA-A受體復(fù)合物等;主要涉及受體調(diào)節(jié)活性、G蛋白α亞單位結(jié)合、DNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等MF。KEGG富集分析結(jié)果（圖6D）顯示，兩組DEGs主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、GABA能突觸、FoxO信號通路、多巴胺能突觸等信號通路上。

4 討論

SCI在臨床上較為常見且治療棘手，且由于該癥高發(fā)病率、高致殘率、高耗費(fèi)和青壯年多發(fā)的特點(diǎn)，給患者及其家庭乃至整個社會都造成了極大的負(fù)擔(dān)[1-2]。DEGs及其mRNA一直是近十幾年來研究的熱點(diǎn)之一，以其為基礎(chǔ)開展靶向治療、精準(zhǔn)治療研究，可為SCI的臨床治療提供新的方向。本研究基于二代測序基礎(chǔ)，初步探討了川芎嗪對急性SCI模型大鼠脊髓組織中DEGs的影響，并對DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，旨在為川芎嗪治療SCI的深入研究提供參考。

4.1 A組與B組比較結(jié)果的分析

與A組比較，B組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著降低，且脊髓神經(jīng)細(xì)胞和尼氏體的數(shù)量均明顯減少。兩組共涉及DEGs 886個（A組和B7 d組）、1 404個（A組和B14 d組）。GO富集、KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，兩組DEGs主要富集于細(xì)胞表面、胞外區(qū)部分、溶泡、溶酶體、質(zhì)膜部分等CC，涉及蛋白質(zhì)結(jié)合、細(xì)胞因子結(jié)合、陰離子結(jié)合/配位等MF以及免疫系統(tǒng)過程、免疫反應(yīng)、免疫應(yīng)答、防御反應(yīng)等BP，主要富集于細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、CAMs、吞噬體等信號通路，與脊髓損傷相關(guān)機(jī)制和病理生理過程（如免疫性損傷、缺血再灌注損傷、脂質(zhì)過氧化）[6-7]基本相符。

4.2 B組與C組比較結(jié)果的分析

與B組比較，C組大鼠造模后7、14 d時的BBB評分均顯著升高，且脊髓神經(jīng)細(xì)胞和尼氏體的數(shù)量均有所增多。兩組共涉及DEGs 70個（B7 d組和C7 d組）、66個（B14 d組和C14 d組）。

4.2.1 B7 d組和C7 d組 DEGs分析結(jié)果顯示，在A組和B7 d組表達(dá)下調(diào)而在B7 d組和C7 d組表達(dá)上調(diào)的DEGs有Ncmap、Prx、Ddn等，主要與髓鞘形成、神經(jīng)元發(fā)育和突觸可塑性有關(guān)[7]。GO、KEGG富集分析結(jié)果顯示，兩組DEGs主要富集于基底外側(cè)質(zhì)膜、質(zhì)膜區(qū)、刷狀緣等CC，主要涉及外脫氧核糖核酸酶活性、二羧酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性、運(yùn)載受體活性等MF，對IFN、IFN-γ的反應(yīng)、電壓門控鈉離子通道的聚集、髓鞘形成、神經(jīng)元離子通道聚集、有機(jī)酸轉(zhuǎn)運(yùn)等BP以及CAMs、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)、Hedgehog信號通路等信號通路。

有研究表明，應(yīng)用鈉離子通道阻滯劑、早期開放低電導(dǎo)鈣依賴性鉀通道、激活磷酸三腺苷敏感性鉀通道（KATP）、阻斷鉀離子過度外流/阻斷細(xì)胞內(nèi)鈣超載等均對神經(jīng)損傷具有一定的改善作用;而激活延遲外向鉀通道、高電導(dǎo)鈣依賴性鉀通道等則可對神經(jīng)細(xì)胞造成損傷[16-18];同時，鈉離子通道各亞型均參與了炎性疼痛和神經(jīng)性疼痛的發(fā)生[19]。細(xì)胞免疫、體液免疫都受IFN-γ的調(diào)節(jié)：有研究指出，1型輔助T細(xì)胞（Th1）和小膠質(zhì)/巨噬細(xì)胞分泌的IFN-γ依賴性白細(xì)胞介素10（IL-10）有助于SCI后的功能恢復(fù)[20]。補(bǔ)體和凝血級聯(lián)在機(jī)體止血、免疫防御等方面具有非常重要的作用：有研究指出，在外周神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)疼痛模型大鼠中，其脊髓背角存在補(bǔ)體的異?；罨腋深A(yù)該活化過程可明顯抑制或者逆轉(zhuǎn)其痛覺過敏[21]。脫氧核糖核酸酶在細(xì)胞凋亡、DNA降解等中起著重要作用[22]。此外，CAMs的作用也不能忽視：有研究認(rèn)為，急性SCI患者的外周血淋巴細(xì)胞中細(xì)胞間黏附分子1（ICAM-1）含量升高，該分子可能參與了患者機(jī)體的免疫應(yīng)答及SCI發(fā)生過程[23];神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組分，參與了中樞神經(jīng)的分化、遷移、發(fā)芽、突觸重建等過程[24-25]，有研究者于蛛網(wǎng)膜下腔注射重組人神經(jīng)細(xì)胞黏附分子1（rhNCAM-1）蛋白后，患者雙下肢運(yùn)動功能有所恢復(fù)，提示該藥可通過改善SCI后損傷區(qū)及其兩端神經(jīng)細(xì)胞之間的功能來促進(jìn)軸突再生，從而促進(jìn)患者運(yùn)動功能恢復(fù)[26]。Hedgehog信號通路與神經(jīng)發(fā)育、分化過程以及神經(jīng)炎癥、神經(jīng)性疼痛有關(guān)，可能參與了SCI后的神經(jīng)修復(fù)調(diào)控[27-29]。由此可見，造模后7 d，川芎嗪對模型組大鼠的保護(hù)作用可能與其參與免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、離子通道聚集、髓鞘形成、CAMs、補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)等有關(guān)。

4.2.2 B14 d組和C14 d組 DEGs分析結(jié)果顯示，在A組和B14 d組表達(dá)下調(diào)而在B14 d組和C14 d組表達(dá)上調(diào)的DEGs有Gabrq、Gabrg2等，主要與GABA能突觸有關(guān)[30]。GO富集、KEGG信號通路富集分析結(jié)果顯示，兩組DEGs主要富集于細(xì)胞外區(qū)、頂體內(nèi)/外膜等部位，主要涉及受體調(diào)節(jié)活性、G蛋白α亞單位結(jié)合、DNA核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性等MF，含酚化合物代謝過程、細(xì)胞對氮化合物的反應(yīng)、內(nèi)源性刺激的細(xì)胞反應(yīng)等BP以及細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、逆行內(nèi)源性大麻素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、PPAR信號通路、GABA能突觸、FoxO信號通路、多巴胺能突觸等信號通路。

GABA是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)，其對神經(jīng)元抑制作用的發(fā)揮主要是由GABA-A受體來完成的[30]。GABA-A受體的再分配由多種神經(jīng)調(diào)節(jié)物質(zhì)（如激素和細(xì)胞因子）介導(dǎo)[31]。有研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α增加了神經(jīng)突觸上GABA-A受體的數(shù)量，該炎癥因子介導(dǎo)的GABA-A受體向脊髓神經(jīng)元質(zhì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)是中樞神經(jīng)興奮性毒性的一個潛在靶點(diǎn)[32]。有研究指出，GABA可降低SCI七鰓鰻幼蟲和非SCI七鰓鰻幼蟲的彎曲反應(yīng);GABA-A受體拮抗劑能增強(qiáng)SCI七鰓鰻幼蟲的彎曲反應(yīng)，同時GABA能效應(yīng)受其SCI恢復(fù)程度的影響[33]。有學(xué)者以部分坐骨神經(jīng)結(jié)扎大鼠模型為研究對象，發(fā)現(xiàn)經(jīng)脊髓刺激后誘導(dǎo)的鎮(zhèn)痛與局部GABA能神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)的激活有關(guān)[34]。唾液α-淀粉酶可反映交感神經(jīng)系統(tǒng)活性[35];同時，副交感神經(jīng)活動、反射活動或SCI下受體超敏反應(yīng)等也可能導(dǎo)致運(yùn)動后唾液α-淀粉酶活性的變化[36]。有研究者從不同角度探討去甲腎上腺素、腎上腺素、多巴胺等兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)與免疫系統(tǒng)之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)下丘腦、海馬和外周淋巴器官中兒茶酚胺的含量與免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)[37-38];其他的如PPAR信號通路、FoxO信號通路雖未見與急性SCI直接相關(guān)的證據(jù)，但均與氧化應(yīng)激損傷、細(xì)胞凋亡等有關(guān)[39-40]。由此可見，造模后14 d，川芎嗪對模型組大鼠的保護(hù)作用可能與免疫調(diào)節(jié)、兒茶酚胺代謝、GABA-A受體活性、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用等有關(guān)。

5 結(jié)語

SCI是多因子、多因素、多生物過程共同作用的結(jié)果。本研究發(fā)現(xiàn)，川芎嗪可能通過炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)、神經(jīng)元離子通道聚集、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、神經(jīng)活性配體-受體相互作用、氧化應(yīng)激損傷、突觸重建、軸突感覺、髓鞘形成、神經(jīng)性疼痛、GABA能突觸等生物學(xué)過程來發(fā)揮對SCI細(xì)胞凋亡、神經(jīng)損傷的改善作用，可為后續(xù)研究提供新方向。但本研究也存在一定的局限性，如川芎嗪對SCI主要為輔助治療、未設(shè)置多個劑量組等，且上述結(jié)論尚未通過相關(guān)基礎(chǔ)研究予以驗(yàn)證，故有待后續(xù)進(jìn)一步研究證實(shí)。

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（收稿日期：2019-09-18 修回日期：2020-04-08）

（編輯：張元媛）