紅火蟻巢穴土壤中生物堿成分分析

李曉玲, 陳 立, 方守國

(1. 長江大學農(nóng)學院, 湖北荊州 434025; 2. 中國科學院動物研究所, 農(nóng)業(yè)蟲害鼠害綜合治理研究國家重點實驗室, 北京100101)

紅火蟻Solenopsisinvicta是一種社會性昆蟲，在土壤中建立巢穴，巢穴高度可達30～40 cm (Vinson, 1997)。蟻后產(chǎn)卵、哺育幼蟲、化蛹、羽化、貯存糧食及種群活動等行為均發(fā)生在地下巢穴中。蟻巢不僅保護蟻群不受入侵者的侵害，還提供了一個對蟻群生存至關重要的微氣候調節(jié)系統(tǒng)(H?lldobler and Wilson, 1990)。螞蟻的筑巢、覓食活動能造成土壤結構改變和養(yǎng)分積累，進而改變土壤的物理性質和營養(yǎng)狀況(Lafleuretal., 2005)。除了土壤的物理性質如滲透和濾出特性的改變(Greenetal., 1998)，紅火蟻的建巢活動還會改變土壤的化學性質，如元素富集(Herzogetal., 1976)。蟻巢是螞蟻活動的中心場所，蟻群活動也可以將自身的一些化學物質帶入巢內土壤中：一方面紅火蟻會主動將代謝產(chǎn)物排泄到蟻巢土壤中，另一方面紅火蟻和土壤的頻繁接觸也會使體表化合物等次生代謝物被動地進入蟻巢土壤中。例如，Vander Meer和Lofgren (1988) 在紅火蟻巢穴土壤中發(fā)現(xiàn)了紅火蟻表皮烴類化合物。

Chen等(2009)利用正己烷浸提紅火蟻工蟻，用GC-MS鑒定紅火蟻毒液生物堿的主要成分是2-甲基-6-烷基哌啶生物堿混合物：2-甲基-6-十三碳烯基-6-哌啶(C13∶1)，2-甲基-6-十三烷基-6-哌啶(C13∶0)，2-甲基-6-十五碳烯基-6-哌啶(C15∶1)，2-甲基-6-十五烷基-6-哌啶(C15∶0)，2-甲基-6-十七碳烯基-6-哌啶(C17∶1)以及2-甲基-6-十七烷基-6-哌啶(C17∶0)。一頭紅火蟻工蟻的毒囊中含有約10～15 μg的毒液，所以每個蟻巢都擁有大量的毒液生物堿(Storeyetal., 1991)。紅火蟻利用毒液進行防御和殺死獵物(Vander Meeretal., 1980)。紅火蟻極具攻擊性，一旦不小心觸碰其巢穴，就會有大批紅火蟻出來進行攻擊。在攻擊過程中，紅火蟻會釋放出大量的毒液，每頭工蟻每次通過毒針釋放大約0.66 nL毒液，約占其毒液總含量的3.1% (Haight and Tschinkel, 2003)。紅火蟻棲息于真菌、細菌等微生物較豐富的巢穴環(huán)境中(Torsvik and Ovreas, 2002)，易受多種真菌和細菌性病原體的侵染(Allen and Buren, 1974; Evans, 1982)。為了抵御病原菌浸染，紅火蟻和其他社會性昆蟲一樣，會在24 h內將包括螞蟻尸體在內的雜物清除出巢穴(Wilson, 1971)。這樣感染真菌的尸體在產(chǎn)孢前被清除，就能有效地阻止分生孢子在蟻巢內的傳播。在實驗室給紅火蟻種群接種白僵菌后，工蟻會在真菌孢子形成之前將螞蟻尸體集中到蟻巢的一個角落(Storeyetal., 1991)。并且工蟻還用沙子覆蓋尸體，從而限制了分生孢子的擴散。除了行為反應外，紅火蟻還會產(chǎn)生具有顯著抗菌活性的毒液生物堿(Blumetal., 1958; Jouvenazetal., 1972; Blum, 1988)。紅火蟻會在巢穴內表面分泌毒液生物堿，對其生活環(huán)境和幼蟲體表等進行消毒(Obin and Vander Meer, 1985)；通過腹部快速振動向入侵者噴射毒液滴(Obin and Vander Meer, 1985; Storeyetal., 1991)。所以蟻巢土壤和螞蟻身上可能存在高濃度的生物堿，并發(fā)揮抗菌、抑菌作用。

關于土壤中生物堿類化合物提取方法的研究比較多，比如用四氫呋喃∶水∶乙腈∶乙酸(50∶30∶20∶1, v/v)混合溶劑提取土壤中的α-茄堿(Jensenetal., 2007)；用正己烷∶丙酮 (3∶1, v/v) 混合溶劑提取土壤中的咔唑類污染物(Mumboetal., 2015)；用含硫酸鎂和氯化鈉的乙腈提取土壤中的阿托品和莨菪堿(Bothetal., 2017)；用甲醇∶甲醇(85∶15, v/v)分步提取土壤中的吡咯西啶類生物堿(Hama and Strobel, 2019)；用1.5 mol/L氫氧化鈉溶液堿化土壤后，接著用氯化正丁酯提取土壤中的馬錢子堿(Starretal., 1995, 1996)；先用1 mol/L氫氧化鈉溶液調整乙醇的pH值到8～9，再用堿性乙醇提取土壤中的苦參堿(郝佳等, 2016)等。土壤pH值影響土壤對生物堿的吸附能力，比如隨著土壤pH值升高，吸附馬錢子堿的能力增強(Kookanaetal., 1997)。紅火蟻毒液呈弱堿性，而我國南方土壤主要呈酸性(楊志元, 2016)，毒液生物堿與土壤中的酸性物質結合形成不溶于有機溶劑的鹽，致使無法直接用有機溶劑提取土壤中的生物堿。三乙胺的堿性強于毒液生物堿，可優(yōu)先與酸性物質反應。利用三乙胺排除酸性物質的影響后，就可以用有機溶劑提取紅火蟻巢穴土中的毒液生物堿。

本研究探討紅火蟻巢穴土壤中的毒液生物堿的提取方法，測定紅火蟻蟻巢毒液生物堿的含量，研究結果將有助于后期從微生境角度分析紅火蟻入侵對土壤生態(tài)環(huán)境的影響，揭示入侵物種對新入侵地土壤微環(huán)境的適應機制等方面的工作。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1土壤樣品：采自廣州市華南農(nóng)業(yè)大學東校區(qū)附近草坪和廣州市黃浦區(qū)葡萄園附近草坪的紅火蟻蟻巢的土壤。蟻巢土壤采集方法：隨機選取4個紅火蟻蟻巢(各蟻巢之間相距至少5 m)，分別挖取蟻巢深度約15 cm處的土壤各約200 g，放置在蟻巢附近，待螞蟻爬回蟻巢，土壤樣品自然風干后，帶回實驗室。在制樣板上碾壓土壤顆粒，過2 mm孔徑篩，得到直徑<2 mm的蟻巢土壤樣品，用自封袋封裝，備注詳細采集信息后，保存于4℃冰箱中。按上述方法采集蟻巢周邊3 m處的土壤作為空白對照，并用于毒液添加回收實驗。

1.1.2主要儀器：萬分之一電子天平(AR224CN)、隔膜真空泵(N820.3FT.18)、旋轉蒸發(fā)儀(R-3HB)、美國安捷倫公司Agilent Technologies氣相色譜儀7890A(GC)、7890A-5975C氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(GC-MS)、超聲震蕩儀(KQ-100E)。

1.1.3主要試劑：HPLC級正己烷(上海安譜實驗科技股份有限公司)、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、三乙胺(均為分析純，北京市通廣精細化工公司)。

1.2 紅火蟻毒液生物堿的獲取和添加毒液生物堿的土壤樣品的制備

稱取5.0 g紅火蟻工蟻冷凍于-20℃冰箱，1 h后取出，用20 mL正己烷浸泡48 h，取出浸提液，加適量無水硫酸鈉干燥12 h后，用氮氣濃縮至5 mL，用硅膠柱層析法分離生物堿(Chen and Fadamiro, 2009)。柱層析分離所收集的流分用Agilent 7890A氣相色譜儀進行成分分析，最后將收集到的生物堿流分合并，濃縮抽干洗脫溶劑即得紅火蟻毒液生物堿樣品。用毛細管取極少量毒液生物堿，用正己烷溶解后進行GC-FID分析，以檢測其純度。稱取2.0 g蟻巢周邊土壤樣品于16 mL玻璃樣品瓶中，加入40 μL紅火蟻毒液生物堿樣品，震蕩混勻，使毒液與土壤充分混勻，即完成添加毒液生物堿的土壤樣品制備。

1.3 GC-FID和GC-MS分析

GC-FID分析：檢測器：FID(火焰離子化檢測器)；色譜柱：HP-5MS毛細管柱，規(guī)格30 m×0.32 mm×0.25 μm；進樣量：2 μL，無分流進樣；進樣口溫度270 ℃，檢測器溫度280℃。柱溫箱升溫程序：起始溫度50℃，保持1 min，以5℃/min的速率升至100℃，保持0 min，然后以10℃/min升至240℃，保持10 min。

GC-MS分析：參照Liu等(2017)利用GC-MS鑒定紅火蟻毒液生物堿和土壤樣品中的生物堿。GC-MS的色譜柱、柱溫箱升溫程序和進樣條件同GC-FID分析。MS的電離方式為EI，電離能量為70 eV，離子源溫度為230℃，質量掃描范圍50～500 amu。載氣為氦氣，流速為1 mL/min。

1.4 土壤樣品中生物堿提取方法的優(yōu)化

1.4.1毒液生物堿抽濾提取法：將加入提取溶劑的待測樣品常溫下浸提8 h后，超聲震蕩15 min；將超聲后的樣品用真空泵抽濾得到第1次回收提取液A；將濾渣再次加入等量的溶劑按上述方法提取，并重復3次，依次得到第2次回收提取液B，第3次回收提取液C，第4次回收提取液D；將上述4種提取液分別用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至近干，加入色譜級正己烷定容至1 mL，并過0.45 μm有機濾膜至1.5 mL樣品瓶中，用于GC-FID分析。

1.4.2提取溶劑篩選：選擇以下5種極性不同的溶劑進行比較，正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮和甲醇。取4 mL溶劑加入到1.2節(jié)中的土壤樣品中，同時分別向樣品中添加1 mL三乙胺，利用1.4.1節(jié)方法抽濾提取樣品中的毒液生物堿。計算不同溶劑處理的毒液總生物堿的回收率，篩選最佳提取溶劑。每種溶劑處理設4個重復。

1.4.3三乙胺添加方法：取4 mL正己烷加入到1.2節(jié)中的土壤樣品中，同時分別向樣品中添加0.125, 0.25, 0.5, 1和2 mL三乙胺，利用1.4.1節(jié)方法抽濾提取樣品中的毒液生物堿。以合成的順式2-甲基-6-十一烷基哌啶(cis-C11)為標準品用外標法(黃敏興等, 2019)定量計算土壤樣品中的生物堿含量。計算不同體積的三乙胺處理的毒液生物堿的回收率，篩選出三乙胺的最佳添加體積。實驗重復4次。

1.5 紅火蟻蟻巢土生物堿測定方法

稱取10.0 g蟻巢土壤樣品于50 mL離心管中，加入20 mL正己烷和5 mL三乙胺，采用1.4.1節(jié)中提取方法提取毒液生物堿，用于GC-FID分析。用外標法進行定量生物堿含量。用合成的cis-C11作為標準品，稀釋成3.125～400 ng/μL共8個濃度，制作標準曲線。標準品的濃度(X)與色譜峰面積(Y)通過線性回歸分析建立標準曲線。利用標準曲線計算出土壤樣品中的生物堿濃度。每個蟻巢土壤樣品重復4次。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007及SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)分析，并進行One-way ANOVA統(tǒng)計分析，以Tukey氏HSD進行顯著水平檢測。

2 結果

2.1 生物堿標準曲線和紅火蟻工蟻毒液生物堿成分鑒定

基于生物堿標準品濃度(X)與色譜峰面積(Y)實驗數(shù)據(jù)，通過線性回歸建立的生物堿標準曲線為Y=11.476X+8.6009,R2=0.9999(圖1)，說明3.125～400 ng/μL的濃度范圍內線性關系非常好。

紅火蟻工蟻體內毒液生物堿提取的氣相色譜圖顯示(圖2)，紅火蟻工蟻毒液生物堿的主要成分為trans-C13∶1 (峰2)、trans-C13 (峰3)、trans-C15∶1(峰4)和trans-C15 (峰5)，次要成分為trans-C11 (峰1)。選取其中4種主要成分用于定量分析。

圖1 cis-C11標準曲線Fig. 1 The standard curve of cis-C11

圖2 紅火蟻工蟻毒液生物堿氣相色譜圖Fig. 2 Gas chromatogram of venom alkaloids of workers of Solenopsis invicta1: trans-C11; 2: trans-C13∶1; 3: trans-C13; 4: trans-C15∶1; 5: trans-C15.

2.2 生物堿提取方法優(yōu)化

2.2.1不同有機溶劑對土壤毒液生物堿的提取效率：正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等5種不同極性的有機溶劑作為提取溶劑，并添加1 mL三乙胺到土壤樣品中，采用抽濾法提取毒液生物堿。正己烷的提取效率最高，生物堿的回收率為65.50%±3.55%;丙酮的提取效率最低,生物堿的回收率為49.73%±3.32%；但不同溶劑處理生物堿回收率在0.05水平上無顯著性差異(F4,15=1.407,P=0.279)(圖3)。

2.2.2三乙胺的添加量對土壤毒液生物堿的提取回收率的影響：選取正己烷作為提取溶劑，4種毒液生物堿的第1次提取回收率隨著三乙胺添加量的增加而提高。當加入三乙胺的量為1 mL時，4種生物堿的提取回收率達到最大，繼續(xù)增加三乙胺的添加量到2 mL，提取回收率無顯著性變化(P>0.05)(圖4: A)。

將4次提取所得的提取回收率相加，得到總提取回收率。trans-C13∶1,trans-C13和trans-C15∶1這3種生物堿的總提取回收率沒有隨著三乙胺添加量的增加而發(fā)生顯著變化，它們的總提取回收率都集中在55%～70%之間。trans-C15的總提取回收率在0.125 mL時最低，約為52%；而當三乙胺的添加量為0.25 mL及以上時，總提取回收率達到95%～120%之間(圖4: B)。

將4種生物堿的含量相加，得到總生物堿的含量。總生物堿的第1次提取回收率隨三乙胺量的增加而增加。當三乙胺為1 mL時，總生物堿第一次提取回收率均可達62%～69%。因此可以選取4 mL正己烷+1 mL三乙胺來提取2 g土壤中的毒液生物堿，且只需要進行1～2次提取即可提取到大部分生物堿(表1)。

2.3 蟻巢土壤中生物堿含量

紅火蟻蟻巢生物堿種類主要為trans-C13∶1,trans-C13,trans-C15∶1和trans-C15。在4巢土樣中，trans-C15∶1含量顯著高于其他3種生物堿(P<0.05)，含量為10.13±0.51 μg/g；trans-C13∶1的含量次之，為6.24±0.33 μg/g；trans-C13和trans-C15含量最低，分別為3.06±0.20 μg/g和2.85±0.36 μg/g，兩者之間沒有顯著差異(P>0.05)(圖5)。蟻巢土壤中的總生物堿含量為22.28±1.13 μg/g。

圖3 不同溶劑對總生物堿回收率的影響Fig. 3 Effect of different solvents on recovery rate of alkaloids圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤，柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05， Tukey氏HSD檢驗);圖4和5同。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase letters above bars indicate significant difference (P<0.05, Tukey’s HSD test). The same for Figs. 4 and 5.

圖4 三乙胺添加量對4種生物堿第1次提取回收率(A)和總回收率(B)的影響Fig. 4 Effect of additive amount of triethylamine on the recovery rate of the first extraction (A)and total recovery rate (B) of four alkaloids

表1 4次三乙胺抽濾提取的總生物堿回收率(%)Table 1 Recovery rate (%) of total alkaloids with four triethylamine extractions

表中數(shù)據(jù)為平均值±標準誤;同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母分別表示差異顯著(P<0.05, Tukey氏HSD檢驗)。Data in the table are mean±SE. Different lowercase letters following the data in the same column indicate significant differences (P<0.05, Tukey’s HSD test).

圖5 紅火蟻巢穴土壤中4種主要生物堿的含量Fig. 5 Contents of four major alkaloids in the soil of Solenopsis invicta nest

3 討論

生物堿的提取方法主要有超聲提取法、雙水相萃取法、加速溶劑提取法、半仿生提取法等(張林等, 2017)。我國南方土壤主要呈酸性，而紅火蟻毒液生物堿的主要成分呈弱堿性。在添加回收實驗時，由于添加的毒液生物堿可能與土壤中的腐殖酸等酸性物質結合，生成不易溶于有機溶劑的鹽，導致生物堿提取效率低甚至提取不出來，因此需要在提取溶劑中加入三乙胺。三乙胺的堿性強于毒液生物堿，可以優(yōu)先與土壤中的酸性物質反應，使土壤中的毒液生物堿呈游離態(tài)，很容易用有機溶劑提取出來。我們在比較4次提取的回收率時發(fā)現(xiàn)，第1次提取回收率隨著三乙胺添加量的增加而提高；當三乙胺的添加量達到1 mL時，通過1次提取就可回收大多數(shù)的生物堿。因此，當三乙胺與有機溶劑體積比為1∶4時，通過1～2次提取即可提取到土壤中的大部分生物堿。正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、甲醇等5種不同極性的有機溶劑作為提取溶劑時，提取效果相差不大，說明這5種溶劑都可以用作提取巢穴土壤中生物堿的提取溶劑。但是，丙酮和甲醇的極性、溶解性都比較強，導致土壤中的其他雜質的提取率也比較高，不利于生物堿成分的純化，而且用丙酮作為溶劑易產(chǎn)生乳化現(xiàn)象。

本研究結果表明,在紅火蟻巢穴土壤中，毒液生物堿trans-C13∶1和trans-C15∶1的含量顯著高于其他兩種生物堿，4次提取實驗測得的總生物堿含量大概為22 μg/g;因添加回收實驗所得的總生物堿的回收率最高為71.51%，所以蟻巢土壤中總生物堿含量理論值大概為31 μg/g。在采集巢穴土壤樣品過程中，不可避免地破壞蟻巢，引起大量工蟻的防御反應，有些工蟻可能會釋放毒液到土壤中，使得所測巢穴土壤生物堿含量要高于實際含量。所以綜合提取效率和工蟻防御反應這兩方面的影響，我們測定的蟻巢土壤生物堿含量可能非常接近其真實值。

紅火蟻生物堿具有廣泛的殺菌活性，稀釋50倍的生物堿能有效地抑制化膿性微球菌Micrococcuspyogenes、化膿性鏈球菌Streptococcuspyogenes、大腸桿菌Escherichiacoli、干酪乳桿菌Lactobacilluscasei等多種真菌(Blumetal., 1958)。從紅火蟻毒液分離出的哌啶和脫氫哌啶類生物堿對終極腐霉Pythiumultimum的菌絲生長有明顯的抑制作用，也能抑制其孢子囊的萌發(fā)，其中哌啶生物堿的抑菌EC50為17.0 μg/mL，抑制孢子萌發(fā)EC50為12.3 μg/mL (Lietal., 2012)。毒液中的哌啶和脫氫哌啶類生物堿還能抑制番茄細菌性潰瘍病菌Clavibactermichiganensissubsp.michiganensis的生長，其中哌啶生物堿的抑菌EC50為31.5 μg/mL，且在75.3 μg/mL的濃度下對該菌有完全抑制作用(Lietal., 2013)。合成的哌啶生物堿成分在低濃度下具有抑制多種細菌生長的能力(Urbani and Kannowsk, 1974)；對金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的殺菌濃度為4～12 μg/mL，對大腸桿菌E.coli的殺菌濃度為20～40 μg/mL (Jouvenazetal., 1972)。合成的脫氫哌啶生物堿成分2-甲基-6-十八烷基-Δ1,6-哌啶具有體外抗真菌活性，對新生隱球菌Cryptococcusneoforman的最低抑制濃度為6.6 μg/mL，對白色念珠菌Candidaalbicans的最低抑制濃度為12.4 μg/mL(Yanetal., 2017)。很顯然，所測得的蟻巢土壤生物堿含量在抑菌活性濃度范圍內。

螞蟻對土壤微生物群落的影響及螞蟻與真菌間的關系已成為社會昆蟲學家、生態(tài)學家的研究熱點。螞蟻巢穴內微生物多樣性的研究均顯示，蟻巢土壤微生物的豐富度及多樣性均高于巢外對照土壤(Dauber and Wolters, 2000; Zettleretal., 2002; Boultonetal., 2003; Bairdetal., 2007)。紅火蟻巢穴中的毒液生物堿可能會參與調節(jié)蟻巢土壤微生物的豐富度和多樣性水平。巢穴土壤中的微生物體系具有重要的化學轉化作用，反過來又影響螞蟻的種群活動。所以可以斷言，紅火蟻巢穴土壤中的毒液生物堿對紅火蟻在新的生境中的定殖和入侵有重要的促進作用。