基于線粒體16S rRNA基因的舟山群島碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性分析

李 奎, 周傳江, 梁愛萍

(1. 河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院, 河南新鄉(xiāng) 453007; 2. 中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所, 動(dòng)物進(jìn)化與系統(tǒng)學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100101; 3. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 北京 100049)

島嶼(island)是指散布在江河湖海中的、四面環(huán)水的、且在高潮時(shí)仍暴露于水面上的陸地。島嶼地理結(jié)構(gòu)分明，且被海水阻隔，形成了彼此獨(dú)立的微型生態(tài)位，是探究推動(dòng)物種形成、生物多樣性、適應(yīng)輻射及跨海擴(kuò)散等事件的天然實(shí)驗(yàn)室(Demosetal., 2016)。陸橋島(continental islands)在歷史上曾與大陸相連，海平面的抬升或地質(zhì)構(gòu)造事件使其與鄰近的大陸隔離(Paulay, 1994)。島上的生物曾是鄰近大陸上生物區(qū)系的一部分，長(zhǎng)期的隔離阻斷了島嶼與鄰近大陸種群間的基因流，使其形成獨(dú)立的進(jìn)化單元。這很可能造成島嶼上不同種群及島嶼與大陸種群間遺傳多樣性的差異。Frankham(1997)及Yamada和Maki(2012)采用等位酶和微衛(wèi)星標(biāo)記，對(duì)分布于日本本州島東部沿岸及伊豆群島上的水仙花Weigelaoraeensis遺傳多樣性分析表明，大陸種群的遺傳多樣性明顯高于島嶼種群，且隨著島嶼與大陸距離的增加，其遺傳多樣性逐漸減小。

舟山群島位于我國(guó)浙江省東北部，北連上海，南接寧波，東鄰公海，總面積約2.22萬(wàn)平方公里，是我國(guó)最大的群島，由1 390個(gè)大小不同的島嶼組成(宋亞民，2001)。從地質(zhì)構(gòu)造上講，舟山群島隸屬于閩浙隆褶帶的東北端，是浙江天臺(tái)山脈沿東北方向東海的延伸(葉青超和黃金森, 1958)。受第四紀(jì)冰期的影響，更新世末期東海海平面抬升，造成舟山群島開始與大陸隔離；直到全新世時(shí)期(大約7-9 kya)，舟山群島與大陸完全分隔(Wangetal., 2014)。因此，舟山群島是探究島嶼隔離對(duì)種群多樣性影響的良好模型。然而，有關(guān)舟山群島上種群多樣性的研究多局限于鄰近大陸的島嶼上的個(gè)別物種(Huetal., 2006; Chenetal., 2008)。近期，對(duì)分布于整個(gè)舟山群島上的黑斑側(cè)褶蛙Pelophylaxnigromaculatus的遺傳多樣性評(píng)估表明，島嶼隔離致使島嶼種群遺傳多樣性相對(duì)較低(Wangetal., 2014)。目前，對(duì)舟山群島上分布的昆蟲的遺傳多樣性和種群歷史動(dòng)態(tài)的研究工作還不多(Lietal., 2020)，島嶼隔離效應(yīng)對(duì)分布于該群島上的昆蟲的遺傳多樣性的影響還有待深入的探討。

碧蛾蠟蟬Geishadistinctissima隸屬于蠟蟬總科(Fulgoroidea)蛾蠟蟬科(Flatidae)碧蛾蠟蟬屬Geisha，廣泛分布于我國(guó)南方諸省(Medler, 1992; 王應(yīng)倫等, 2005)。在樣本采集過程中，本研究發(fā)現(xiàn)碧蛾蠟蟬廣泛分布于舟山群島上。盡管Li等(2020)對(duì)分布于該區(qū)域的碧蛾蠟蟬的種群遺傳多樣性和進(jìn)化歷史進(jìn)行了探討，但其所選的分子標(biāo)記(COX1, COX2-COX3, CYTB)均為半翅目昆蟲線粒體基因組中最為保守的區(qū)段(Wangetal., 2015)，無(wú)法充分解析島嶼隔離對(duì)碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性及進(jìn)化歷史的影響。線粒體16S rRNA不僅含有高度保守區(qū)，還包含中度保守區(qū)和高度可變區(qū)，被廣泛應(yīng)用于分子系統(tǒng)學(xué)及群體遺傳多樣性研究中(黃衛(wèi)東等, 2019)。因此，本研究采用16S rRNA作為分子標(biāo)記，以評(píng)估島嶼隔離效應(yīng)對(duì)分布于舟山群島及鄰近大陸的碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

作者于2017年7-9月在舟山群島境內(nèi)由西南向東北方向共選擇了11個(gè)較大的有人類居住的島嶼作為碧蛾蠟蟬采樣點(diǎn)。其中舟山本島和六橫島因面積較大，分別設(shè)置了2個(gè)采樣點(diǎn)(舟山本島：橋頭施和展茅鎮(zhèn)；六橫島：峧頭和臺(tái)門)。此外，本研究還分別在寧波市瑞巖寺國(guó)家森林公園(RYS)及象山縣的賢癢鎮(zhèn)(XY)設(shè)立了采樣點(diǎn)。研究標(biāo)本采用手抄網(wǎng)進(jìn)行隨機(jī)采樣，詳細(xì)的采樣信息見圖1和表1，與已發(fā)表的研究(Lietal., 2020)相比，本研究增加了5頭樣本。采集到的標(biāo)本整理編號(hào)后置于無(wú)水乙醇中，并存放于-80℃冰箱中備用。

圖1 舟山群島地理位置及碧蛾蠟蟬樣本采集點(diǎn)分布Fig. 1 Geographical location of the Zhoushan Archipelago and the sampling sites of Geisha distinctissima地理底圖于2017年下載自國(guó)家基礎(chǔ)地理信息系統(tǒng)http:∥www.ngcc.cn/ngcc/;采集樣點(diǎn)種群代碼和全稱同表1，括號(hào)內(nèi)的數(shù)字表示樣本數(shù)。The geographical base map was downloaded in 2017 from the National Fundamental Geographic Information System (http:∥www.ngcc.cn/ngcc). The population codes and full names of sampling sites are the same as in Table 1, and the value in brackets is the number of individuals collected in the site.

1.2 舟山群島碧蛾蠟蟬種群16S rRNA基因擴(kuò)增

剪取碧蛾蠟蟬3對(duì)足，采用動(dòng)物組織與血液DNA提取試劑盒(天根，北京)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟提取該物種的總基因組DNA。利用Primer Premier 6.0參照NCBI上已有的碧蛾蠟蟬線粒體基因組(GenBank登錄號(hào): NC_012617.1)序列設(shè)計(jì)16S rRNA基因引物(正向引物: 5′-TTAATCCAACAT CGAGGTC-3′；反向引物: 5′-TACCTTTTGTGTCA GGGTT-3′)，并由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)體系(25 mL): 樣本DNA 0.8 μL, 正反向引物(10 mmol/L)各0.8 mL, LA Taq酶混合液12.5 μL, 雙蒸水10.1 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后，72℃終延伸5 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)分離純化后送至擎科生物公司(北京)進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 生物信息學(xué)分析

將獲取的碧蛾蠟蟬種群16S rRNA基因序列采用Lasergene.v7.1軟件包中的SeqMan程序進(jìn)行比對(duì)拼接，同時(shí)核查所獲16S rRNA基因序列是否有錯(cuò)配、雙峰及雜峰等現(xiàn)象，以確保序列的準(zhǔn)確性。采用MEGA7(Kumaretal., 2016)中的MUSCLE進(jìn)行多序列比對(duì)。比對(duì)完成的所有個(gè)體的rRNA基因序列按照BankIt(www.ncbi.nlm.nih.gov/WebSub/?tool=genbank)使用說(shuō)明在線上傳至NCBI中。

表1 舟山群島碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性信息Table 1 Genetic diversity of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelago

1.4 碧蛾蠟蟬種群遺傳進(jìn)化分析

使用DnaSP v5(Librado and Rozas, 2009)對(duì)不同島嶼上碧蛾蠟蟬種群的16S rRNA基因單倍型個(gè)數(shù)(haplotype number,Nh)、單倍型多態(tài)性(haplotype diversity,Hd)以及核苷酸多態(tài)性(nucleotide diversity,π)進(jìn)行評(píng)估，以衡量種群間的遺傳多樣性差異；結(jié)合先前的研究結(jié)果(Wangetal., 2014)，采用Spearman檢驗(yàn)分別對(duì)種群?jiǎn)伪缎投鄳B(tài)性及核苷酸多態(tài)性與島嶼-大陸間距離和島嶼被隔離時(shí)間的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以探究種群遺傳多樣性差異的潛在原因。為探究種群的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究運(yùn)用MrBayes v3.2.6(Ronquistetal., 2012)構(gòu)建種群間的系統(tǒng)發(fā)育樹。堿基替代模型采用軟件jModelTest v2.1.7 根據(jù)Bayesian information criterion(BIC)方法進(jìn)行評(píng)估(Darribaetal., 2012)。系統(tǒng)發(fā)育分析采用兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)進(jìn)程，每個(gè)進(jìn)程運(yùn)行4條MCMC鏈(3條熱鏈和1條冷鏈)，每條鏈運(yùn)行10 000 000代，每1 000代抽樣一次，并選取前25%的樣本作為老化樣本舍去。當(dāng)兩個(gè)重復(fù)進(jìn)程間的分歧頻率的平均標(biāo)準(zhǔn)差(standard deviation,SD)小于0.01時(shí)，即認(rèn)為MCMC鏈已經(jīng)收斂。本研究還采用Network v4.6構(gòu)建單倍型網(wǎng)絡(luò)圖(Bandeltetal., 2000)，以進(jìn)一步證實(shí)系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果的可靠性；并采用Arlequin v3.5進(jìn)行分子方差分析(AMOVA)，評(píng)估不同譜系間的遺傳分化程度(Excoffier and Lischer, 2010)。為探究舟山群島碧蛾蠟蟬的種群歷史動(dòng)態(tài)，本研究還運(yùn)用Arlequin v3.5進(jìn)行中性檢驗(yàn)(neutrality test)和錯(cuò)配分布分析(mismatch distribution analysis)。此外，本研究采用BEAST v1.8.4繪制了貝葉斯天空線(Bayesian skyline plots, BSP)，以評(píng)估種群大小隨時(shí)間的變化。BSP分析以jModelTest v2.1.7估算的核苷酸替代模型為最適模型，采用松散的分子鐘(uncorrelated lognormal relaxed clock)。堿基突變速率采用昆蟲線粒體 COX1的進(jìn)化速率(1.15% Myr-1)(Brower, 1994)，MCMC鏈運(yùn)行50 000 000代，每5 000代抽樣一次，前25%的老化樣本舍去。采用Tracer v1.6確保所有參數(shù)的有效種群大小(ESS)大于200，并繪制貝葉斯天空線。

2 結(jié)果

2.1 碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性

本研究擴(kuò)增獲得247頭碧蛾蠟蟬個(gè)體長(zhǎng)度為740 bp的16S rRNA基因片段(GenBank登錄號(hào): MN548464-MN548710)，共檢測(cè)到35個(gè)單倍型，其中共享單倍型11個(gè)(表2)。共享率最高的單倍型為H_1, 5, 7, 8, 28，均被15個(gè)以上的個(gè)體所共享。其中H_5被來(lái)自14個(gè)不同種群中的87個(gè)個(gè)體所共享，是涵蓋種群數(shù)最多的一個(gè)單倍型。這表明上述幾個(gè)共享單倍型可能為祖先單倍型。整體而言，該地區(qū)的碧蛾蠟蟬種群?jiǎn)伪缎投鄳B(tài)性(Hd)為0.817，核苷酸多態(tài)性(π)為0.008(表1)。對(duì)不同種群而言，橋頭施種群(QTS)的單倍型多態(tài)性最高(Hd=0.889)，但泗礁島種群(SJ)的核苷酸多態(tài)性最高(π=0.009)。賢氧鎮(zhèn)種群(XY)的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性均為0；此外，六橫峧頭種群(LHJT)的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性在除賢氧鎮(zhèn)外的各種群中最低。盡管不同島嶼種群的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性不盡相同，但統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，二者與島嶼-大陸間距離和島嶼被隔離的時(shí)間均無(wú)顯著的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)(R2)非常小，且不顯著(P>0.05)(圖2)，表明二者在不同種群間的差異與島嶼-大陸間距離和島嶼被隔離的時(shí)間的相關(guān)性不顯著。

表2 基于16S rRNA基因序列的舟山群島碧蛾蠟蟬種群?jiǎn)伪缎徒y(tǒng)計(jì)Table 2 Statistics of haplotypes of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelagobased on 16S rRNA gene sequence

個(gè)體編碼由種群代碼和個(gè)體編號(hào)組成。Individual code consists of population code and individual no.

圖2 基于16S rRNA基因序列的舟山群島碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性與島嶼特征間的相關(guān)性Fig. 2 Correlation between the genetic diversity of Geisha distinctissima populations and island featuresof the Zhoushan Archipelago based on 16S rRNA gene sequenceA: 遺傳多樣性與島嶼到大陸距離的相關(guān)性Correlation between the genetic diversity and island distance from the mainland; B: 遺傳多樣性與島嶼隔離時(shí)間的相關(guān)性Correlation between the genetic diversity and the time of island isolation. 菱形為單倍型多態(tài)性，三角形為核苷酸多態(tài)性。The diamonds represent haplotype diversity, and the triangles represent nucleotide diversity.

2.2 碧蛾蠟蟬種群遺傳結(jié)構(gòu)

基于jModelTest估算的舟山群島碧蛾蠟蟬16S rRNA基因的最適替代模型為F81+I，根據(jù)此模型的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，盡管個(gè)別末端枝的支持度較高，但該地區(qū)的碧蛾蠟蟬種群并沒有形成明顯的進(jìn)化支系(圖3)，提示該物種在舟山群島上可能沒有形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖表明，該地區(qū)種群以單倍型H_1, 5, 7, 8為核心，形成一個(gè)網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)圖(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)了上述的推斷。分子方差分析發(fā)現(xiàn)，種群內(nèi)部的變異占總變異的68.26%(表3)，是種群間變異(31.74%)的2倍多，表明該物種在島嶼之間及島嶼與大陸之間并沒有呈現(xiàn)出明顯的遺傳分化。

圖3 舟山群島碧蛾蠟蟬種群16S rRNA基因序列單倍型的貝葉斯系統(tǒng)發(fā)生樹Fig. 3 Bayesian tree of 16S rRNA gene sequence haplotype of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelago系統(tǒng)樹節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值為后驗(yàn)概率。The values on the note of the tree are the posterior probability.

圖4 舟山群島碧蛾蠟蟬種群16S rRNA基因序列單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig. 4 Haplotype network of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelago based on 16S rRNA gene sequence

表3 基于16S rRNA基因序列的舟山群島碧蛾蠟蟬種群分子變異方差分析(AMOVA)Table 3 Analysis of molecular variance (AMOVA) of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelagobased on 16S rRNA gene sequence

***顯著水平小于0.0001。***The significant level is less than 0.0001.FST: 遺傳分化指數(shù)Genetic differentiation index.

2.3 碧蛾蠟蟬種群歷史動(dòng)態(tài)

由于舟山群島碧蛾蠟蟬種群沒有呈現(xiàn)出明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，本研究將該地區(qū)所有種群合并成一個(gè)大種群，并進(jìn)行種群歷史動(dòng)態(tài)分析。中性檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，Tajima’sD(-1.912,P=0.003)和Fu’sFs(-27.180,P<0.001)均呈顯著的負(fù)值，表明碧蛾蠟蟬種群在舟山群島及鄰近的大陸上可能發(fā)生了近期的種群擴(kuò)張事件。錯(cuò)配分布分析呈典型的單峰(圖5)，且Rg. index值(Rg. index: 0.049,P=0.33)較小，SSD值(SSD=0.002,P=0.12)不顯著，進(jìn)一步證實(shí)該種群在舟山群島及鄰近大陸的近期擴(kuò)張事件。 BSP分析表明，舟山群島的碧蛾蠟蟬種群的擴(kuò)張事件大約發(fā)生在0.5-3.5 kya，在該時(shí)期內(nèi)其有效種群的大小發(fā)生了明顯的增長(zhǎng)現(xiàn)象(圖6)。

圖5 基于16S rRNA基因序列的舟山群島碧蛾蠟蟬種群的錯(cuò)配分布分析Fig. 5 Mismatch distribution of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelago based on 16S rRNA gene sequenceSSD: 平方差之和Sum of square deviations. Rg. index: 崎嶇參數(shù)Raggedness index.

圖6 基于16S rRNA基因序列的舟山群島碧蛾蠟蟬種群的貝葉斯天空線Fig. 6 Bayesian skyline plots of Geisha distinctissima populations in the Zhoushan Archipelago based on 16S rRNA gene sequence實(shí)線為有效種群大小的中值，虛線為95% 的最高后驗(yàn)密度。Solid lines indicate the median values of the effective population size, and the dotted lines denote the 95% highest posterior density.

3 討論

本研究基于16S rRNA基因序列對(duì)舟山群島及鄰近大陸的碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性進(jìn)行了評(píng)估，以揭示島嶼隔離對(duì)其遺傳多樣性差異的影響。盡管碧蛾蠟蟬不同種群間的單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性不盡相同，系統(tǒng)發(fā)育重建和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均沒有解析出該地區(qū)碧蛾蠟蟬種群明顯的遺傳結(jié)構(gòu)；且AMOVA分析表明，該地區(qū)碧蛾蠟蟬種群間沒有明顯的遺傳分化。這些結(jié)果表明，各島嶼之間及島嶼與大陸種群間的遺傳多樣性沒有呈現(xiàn)出明顯的差異。本研究結(jié)果與近期基于保守的線粒體基因片段(COX1,COX2-COX3,CYTB)和核基因?qū)υ搮^(qū)域碧蛾蠟蟬和篩豆龜蝽Megacoptacribraria的比較譜系地理學(xué)的研究結(jié)果(Lietal., 2020)一致。然而，對(duì)整個(gè)舟山群島上黑斑側(cè)褶蛙的遺傳多樣性評(píng)估表明，冰后期海平面上升造成的島嶼隔離可阻斷大陸與島嶼種群間的基因流，進(jìn)而造成種群間遺傳多樣性的差異和遺傳分化(Wangetal., 2014)。舟山群島碧蛾蠟蟬種群遺傳多樣性的均質(zhì)化表明，島嶼隔離效應(yīng)似乎沒有促使該物種遺傳多樣性的差異。單倍型多態(tài)性和核苷酸多態(tài)性與島嶼-大陸間距離和島嶼被隔離的時(shí)間的不相關(guān)進(jìn)一步證實(shí)了上述猜想。這種種群間沒有發(fā)生明顯的遺傳分化及遺傳多樣性的均質(zhì)化表明，種群間可能存在明顯的基因流。這一推測(cè)被多基因聯(lián)合的比較譜系地理學(xué)研究得到了證實(shí)(Lietal., 2020)。人類在舟山群島上活動(dòng)的歷史超過5 000年，且隨著我國(guó)航海技術(shù)和造船術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，大陸與島嶼間的人類活動(dòng)日趨頻繁(趙利平, 2007; 方牧, 2008; 鄭麗波等, 2016)，這可能是該地區(qū)碧蛾蠟蟬種群間遺傳多樣性均質(zhì)化的原因。種群動(dòng)態(tài)分析表明，舟山群島碧蛾蠟蟬種群在大約0.5-3.5 kya發(fā)生了種群擴(kuò)張。本研究估算的碧蛾蠟蟬種群擴(kuò)張時(shí)間晚于多基因聯(lián)合分析的種群擴(kuò)張時(shí)間(Lietal., 2020)。且先前的研究認(rèn)為，舟山群島碧蛾蠟蟬種群在近5 000年內(nèi)種群大小維持穩(wěn)定。盡管本研究和先前的研究都使用了昆蟲COX1的替代速率(0.0115 /site/Myr)作為分子鐘(Lietal., 2020)，但不同的分子標(biāo)記替代率不同(李可群, 2015)。因此，基于不同的分子標(biāo)記估算的種群歷史動(dòng)態(tài)很可能不同。盡管如此，無(wú)論基于16S rRNA還是多基因的聯(lián)合分析，均證實(shí)舟山群島碧蛾蠟蟬發(fā)生了種群擴(kuò)張。

本研究與先前的研究均證實(shí)，舟山群島碧蛾蠟蟬種群間沒有呈現(xiàn)出明顯的遺傳多樣性的差異，且都經(jīng)歷了近期的種群的擴(kuò)張事件。然而，不同的是，早前的多基因聯(lián)合分析表明，該地區(qū)碧蛾蠟蟬種群具有明顯的遺傳分化，形成了3個(gè)遺傳譜系，且在大約5-9 kya發(fā)生了一次種群擴(kuò)張(Lietal., 2020)。本研究所獲取的分子標(biāo)記較單一，且片段長(zhǎng)度較短，僅獲取了35個(gè)單倍型，可能不足以很好地解析舟山群島碧蛾蠟蟬種群的遺傳分化。盡管如此，考慮到先前的研究所選分子標(biāo)記的保守性及樣本數(shù)的不一致性，本研究并沒有將已有的分子標(biāo)記與本研究獲取的分子標(biāo)記合并使用。分子鐘是相對(duì)的，且不同分子標(biāo)記進(jìn)化速率不同(李可群, 2015)，可能會(huì)造成基于不同的分子標(biāo)記估算的種群歷史動(dòng)態(tài)存在差異。由于本研究與已有的研究均存在大陸樣本偏少，且研究結(jié)果均主要源于保守的線粒體基因片段，因此沒有充分解析分布于舟山群島及鄰近大陸上的碧蛾蠟蟬種群的進(jìn)化歷史。后續(xù)的研究需廣泛增加大陸樣本，采用更有效的分子標(biāo)記(如增加核分子標(biāo)記或采用基因組數(shù)據(jù))，以進(jìn)一步深入探討碧蛾蠟蟬在舟山群島與大陸間的遺傳分化和種群歷史動(dòng)態(tài)。