神經復元方對原代大鼠海馬神經元BDNF/TrKB信號通路影響的研究*

蔡 麗，董耀榮，李文濤，劉 毅

上海中醫(yī)藥大學附屬市中醫(yī)醫(yī)院(上海 200071)

卒中后抑郁(Post-stroke depression,PSD)是與腦卒中事件相關、臨床表現(xiàn)為抑郁心境的情感障礙性疾病。屬中醫(yī)學“中風病”、“郁證”范疇，屬于“因病致郁”兩者合病而成。目前很多研究者認為該病由于臟腑功能失調，或氣血不足，在內傷積損的基礎上，復因外邪、情志、飲食等而誘發(fā)，導致氣血運行不暢，氣滯痰阻，瘀血內生，痰熱內蘊，或肝陽化風、血隨氣逆，導致腦脈痹阻或血溢脈外而發(fā)中風。中風后氣血逆亂，上沖于腦，加之情志不舒，肝氣郁滯，痰瘀互阻而致郁。多項臨床研究表明中醫(yī)藥治療PSD，包括中藥治療、中成藥等治療手段，可以因人因時因地辨證論治，個體化的治療方案針對性強，除了可以改善患者抑郁癥狀外，還可以改善患者的中醫(yī)其他癥候，療效明確，副作用較小，有一定優(yōu)勢。前期研究證實神經復元方對改善卒中后抑郁患者抑郁癥狀有較好療效[1-2]，但對其發(fā)揮作用的分子機制尚無研究。有研究發(fā)現(xiàn)腦源性神經營養(yǎng)因子(Brain-derived neurotrophic facto，BDNF)水平與PSD具有相關性[3-4]。本實驗引入BDNF/TrkB通路抑制劑(K252a)，探討神經復元方是否通過介導BDNF-TrkB信號通路發(fā)揮抗抑郁作用，為本方分子機制打下一定基礎。

材料與方法

1 材 料

1.1 動物：清潔級健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，3個月齡，體重(210±30)g，上海實驗動物研究中心提供，在標準實驗環(huán)境中飼養(yǎng)。出生1 d的SD新生鼠，由上海實驗動物研究中心提供。所有實驗操作經上海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準并指導進行，盡量減輕動物的痛苦。

1.2 主要實驗用試劑：神經復元方藥劑，采用單味中藥配方顆粒沖調而成，由江蘇省江陰市天江藥業(yè)有限公司生產提供、MEM培養(yǎng)基、BDNF 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、木瓜蛋白酶溶液、脫氧核糖核酸酶I(DNaseI)、BCA蛋白濃度測定試劑盒及RIPA裂解液、電泳液、麗春紅、脫脂奶粉、轉膜液、氯仿、異丙醇等。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備：制備大鼠正常血清和神經復元方含藥血清。選取SD大鼠12只，隨機分為正常對照組和神經復元方組，各6只。神經復元方組每次按照1 ml/100 g的神經復元方灌胃，每日兩次，連灌7 d，第7天給藥后2 h腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，離心，分離血清，滅活(紫外線消毒法)、抽濾、凍存。

2.2 原代大鼠海馬神經元的培養(yǎng)：選取新生1 d的SD大鼠，從胎鼠中分離出全腦。使用兩對精細鑷子在立體顯微鏡下從大腦中解剖大約20個海馬，小心地從海馬體中移除腦膜。將所有胎鼠和組織保持在最小必需培養(yǎng)基(Minimal essential medium，MEM)中并在冰上冷卻。除孵育和離心外的所有后續(xù)步驟均在層流罩中進行。解剖后，將海馬用7～8 ml磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)在15 ml錐形管中輕輕洗滌3次。洗滌后，將5 ml木瓜蛋白酶溶液和20～60 μl脫氧核糖核酸酶I(DNase I)加入到管中海馬中，然后將其在32℃下孵育12 min。孵育并用酶消化后，使用巴斯德玻璃吸管緩慢吸移海馬12次，然后用濕潤細胞過濾器(40-μmmesh，BD Biosciences)過濾到50 ml錐形管中。預先將細胞過濾器用10 ml含有20%FBS和1%N2補充物(100×,Invitrogen,Life technologies)的MEM潤濕，以防止非特異性神經元細胞附著。將整個海馬懸浮液倒入細胞過濾器中，然后將10 ml，20%FBS/N2/MEM倒在上面以收集殘留在過濾器上的神經元。輕輕搖動總體積25 ml的混合液使酶失活，放置1 min，然后以180×g離心10 min。接下來，吸出上清液，將沉淀物以3×104個細胞/ml的恒定細胞密度重懸于培養(yǎng)基中。隨后，將細胞懸浮液以每孔1 ml的體積接種到12孔板孔中。每個孔預先用0.5 ml的25% PuraMatrix制備，輕輕地進行電鍍。以這種方式制備的大鼠胚胎海馬神經元放置在37℃以下，含5%，CO2和95%空氣的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后以無血清培養(yǎng)基全量換液，此后每3 d換液1/3。3 d后加濃度為5×10-6mmol/L的阿糖胞昔，抑制神經膠質細胞增殖。將大鼠海馬神經元原代培養(yǎng)到第7天，經NSE染色鑒定純度。

2.3 藥物血清毒性試驗及最佳濃度：設空白對照組(正常血清)和不同濃度的中藥血清組，將各組中藥血清分別按2.5%、5%、7.5%、10%、15%的血清濃度和正常培養(yǎng)基相混合，與原代海馬神經元細胞進行培養(yǎng)，每組4皿，分別于24 h、72 h后收集細胞，采用MTT法觀察不同濃度藥物血清對原代海馬神經元細胞增殖的影響，以確定無毒劑量及最佳含藥血清濃度。

2.4 細胞分組及干預：海馬神經元原代培養(yǎng)第7天，進行實驗分組。正常對照組：在培養(yǎng)液中孵育3 h后，更換含空白血清培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。H2O2培養(yǎng)組：在培養(yǎng)液中孵育3 h后，更換100 μmol/L，H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。含藥血清(Serum)+ H2O2培養(yǎng)組：含藥血清預處理1 h，再加入100 μmol/L ，H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。含藥血清(Serum)+K252a+ H2O2組：含藥血清預處理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制劑K252a(K252a又分為100、200、400 nmol/L ，3個劑量)及100 μmol/L H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。K252a+ H2O2組：含藥血清預處理1 h，再加入BDNF/TrkB通路抑制劑K252a(K252a又分為100、200、400 nmol/L 3個劑量)及100μmol/L， H2O2培養(yǎng)液繼續(xù)孵育48 h。每組5個復孔，收集細胞進行檢測。K252a為BDNF/TrkB信號通路抑制劑；H2O2濃度為100 μmol/L。

2.5 透射電鏡觀察：用透射電鏡測量海馬神經元突觸界面結構參數，包括突觸界面曲率、突觸活性區(qū)長度與突觸后致密物厚度、突觸間隙寬度[5]。

2.6 實時熒光定量PCR檢測：采用實時熒光定量PCR(Real-Time PCR)檢測突觸生長相關蛋白-43(GAP-43)、突觸蛋白(SYN I和SYNA)的mRNA基因表達水平。主要步驟參考文獻[6]，分為Total RNA的提取和鑒定、cDNA合成和定量PCR反應，最后經過上機擴增檢測，利用2-ΔΔct法計算。

2.7 Western-Blot檢測：采用Western-Blot實驗進行蛋白質印跡分析，測定海馬神經元突觸相關蛋白SYN I、SYNA和突觸生長相關蛋白-43(GAP-43)的表達水平。主要實驗步驟參考文獻[6]。

3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料用t檢驗，計數資料用χ2檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學差異。

結 果

1 透射電鏡觀察結果 與對照組比較，H2O2組的突觸密度降低，提示H2O2引發(fā)氧化應激，誘導損傷海馬神經元；H2O2加入含藥血清(Serum)組突觸密度增大，突觸后致密物厚度增厚(H2O2+Serum組)，提示神經復元方可以有效修復H2O2對神經元的損傷作用；當同時加入含藥血清和BDNF/TrkB信號通路阻斷劑K252a后，神經元突觸密度降低，突觸后致密物厚度變薄，神經元損傷修復效果減弱(H2O2+K252a+Serum組)，提示K252a阻斷BDNF/TrkB信號通路起到效果(圖1)。

2 實時熒光定量檢測 檢測各組對突觸相關蛋白SYNA、GAP-43和SYN1的mRNA表達影響(圖2)。H2O2組、K252a+ H2O2組、含藥血清+ K252a+ H2O2組的SYNA、GAP-43和SYN1 mRNA水平低于對照組和含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組(P<0.01)。與對照組比較，含藥血清+H2O2培養(yǎng)組三項mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義。提示，H2O2可損傷突觸相關蛋白基因作用，加入神經復元方的血清可以有效修復這種損傷，若加入K252a阻斷了BDNF/TrKB信號傳導通路則藥物作用受到抑制。

圖1 培養(yǎng)細胞神經元TEM超微結構(×10000)

圖2 各組SYNA、GAP-43、SYNI的mRNA表達水平比較(★P<0.05，★★P<0.01)

3 蛋白質印跡分析結果 定量測定和比較海馬神經元中突觸相關蛋白SYNA、GAP-43和SYN I的表達水平，結果見圖3、4。H2O2組、K252a+H2O2組、含藥血清+ K252a+ H2O2組的SYNA、GAP-43及SYN I蛋白表達水平明顯低于對照組和含藥血清+H2O2組(P<0.01)；與對照組比較，含藥血清+H2O2培養(yǎng)組突觸相關蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示，H2O2可損傷神經元突觸相關蛋白表達，加入神經復元方的血清可以有效修復這種損傷，若加入K252a阻斷了BDNF/TrKB信號傳導通路則抑制了藥物的修復作用。

圖3 Western blot檢測的各組神經元相關蛋白灰度分析

圖4 各組SYNA、GAP-43、SYNI蛋白表達水平

討 論

PSD是發(fā)生在卒中后的一系列郁證的表現(xiàn)，屬本虛標實之證，病位多責之于腦，發(fā)病多涉及心、肝、脾、腎等諸臟，與風、痰、瘀、虛有關，治療當滋心補腎，同時疏肝利氣、化痰祛瘀、健脾養(yǎng)心。近年來，多項研究證實中醫(yī)藥治療PSD臨床療效較好[7]，可以增加PSD大鼠5-HT的含量[8]。神經復元方源于名老中醫(yī)李如奎教授的臨床驗方，在臨床應用治療中風后遺癥及卒中后抑郁長達15年之久，可以有效改善PSD患者神經功能缺損及抑郁狀態(tài)。

文獻研究證實，BDNF與其特異性受體TrkB結合形成BDNF-TrkB 信號通路，在神經活動的刺激下參與神經元細胞的存活和生長發(fā)育，調節(jié)神經興奮性[9]。TrkB酪氨酸磷酸化是整個信號傳遞系統(tǒng)的啟動程序。其生物學效應的發(fā)揮，是在BDNF與TrkB 結合后，主要經由癌基因Ras編碼的Ras蛋白通路實現(xiàn)信號轉導反應，使神經元免受谷氨酸的毒性作用，同時能激活MAPK及PI3K信號通路。MAPK通路激活可促進神經生存，增加突觸可塑性和神經再生，而PI3K通路不僅可以發(fā)揮促存活效應，還能對幼稚神經元的建立及神經元的遷徙起重要作用。多項研究發(fā)現(xiàn)其與PSD相關，Luo L等[10]的研究發(fā)現(xiàn)慢性抗抑郁藥物對缺乏TrkB受體的PSD模型大鼠無明顯療效。同時Lawlor-Savage L等[11]的研究亦發(fā)現(xiàn)在PSD模型大鼠中過表達TrkB受體，能夠起到類似抗抑郁的作用。Su Q等[12]研究發(fā)現(xiàn)在PSD模型大鼠海馬區(qū)域直接注入BDNF可以起到抗抑郁作用，并對海馬區(qū)神經元的增殖和分化具有促進作用。在2018歐洲精神神經藥理學會(ECNP)年會上，著名神經生物學專家Eero Castren博士報道，BNDF-TrkB信號通路，在神經活動的刺激下與神經突觸晚期長時程增強相互影響，從而在調節(jié)神經元存活及神經突觸可塑性上發(fā)揮著重要作用。

因此，我們推測神經復元方是通過介導BDNF-TrkB信號通路發(fā)揮抗抑郁治療作用，該信號通路是海馬神經重塑性的關鍵“傳動者”。本實驗采用原代大鼠海馬神經元氧化應激損傷模型，引入BDNF/TrkB通路抑制劑(K252a)，對照研究了神經復元方治療PSD的部分分子機制。通過定量RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，H2O2組神經元突觸相關蛋白SYNA、SYNI的基因表達相比正常對照組明顯下降，經含有神經復元方的血清干預后，含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組的SYNA、SYNI的基因表達水平得到提升，基本與正常對照組相當，而加入BDNF-TrkB信號通路阻斷劑K252a和含藥血清的組，神經元突觸蛋白SYNA、SYN I的表達水平并無明顯提升。通過蛋白質印跡法定量檢測BDNF/TrkB信號通路突觸可塑性相關蛋白SYNA、SYNI和突觸生長相關蛋白GAP-43的表達水平，結果基本與定量RT-PCR的一致，含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組SYNA、SYNI的蛋白表達水平顯著高于H2O2培養(yǎng)組，基本上恢復到正常對照組水平。通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)含藥血清+ H2O2培養(yǎng)組相比H2O2培養(yǎng)組神經元突觸密度增大，突觸后致密物厚度增厚。

綜合以上情況，我們認為神經復元方能夠修復海馬神經元氧化應激損傷模型的突觸可塑性，其作用發(fā)揮與BDNF/TrKB信號通路密切相關，可能是通過介導該信號通路調節(jié)突觸蛋白基因，促進海馬SYNI和SYNA的表達，從而達到修復神經功能的作用，但其作用機制有待進一步深入研究。