SORL1、EPHA1基因多態(tài)性與新疆維吾爾族及漢族Alzheimer’s病的相關(guān)性研究

王曉蓓，再圖那木·麥麥提明，馬衣日木·賽買提，王倩，哈斯也提·依不來(lái)音，白睿

Alzheimer’s病(AD)是一種最常見的神經(jīng)退行性疾病[1]，世界衛(wèi)生組織2016年的癡呆報(bào)告指出全世界有4 750萬(wàn)人患有癡呆，全世界每年新增770萬(wàn)例新發(fā)患者[2]。AD占所有類型癡呆的50%～70%，發(fā)病的機(jī)制尚不明確，可能的發(fā)病機(jī)制有以下幾種：自由基學(xué)說(shuō)、淀粉樣蛋白斑塊假說(shuō)，神經(jīng)原纖維纏結(jié)，炎性機(jī)制等，發(fā)病危險(xiǎn)因素包括：老齡、陽(yáng)性家族史、攜帶載脂蛋白Eε4(Apo Eε4)等位基因。但上述都不能完全解釋該病的全部病變，經(jīng)過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)SORL1基因、EPHA1基因是種新發(fā)現(xiàn)的AD致病基因，不同人群、不同地區(qū)、各民族中致病情況不完全一致，國(guó)外對(duì)于SORL1基因在AD患者外周血中的表達(dá)及變異情況報(bào)道較多，但國(guó)內(nèi)報(bào)道卻較少，關(guān)于維吾爾族AD患者的的研究更少。雖然國(guó)外文獻(xiàn)表示這些基因與AD發(fā)病的生物學(xué)機(jī)制相關(guān)，但仍需要在不同人群、不同地區(qū)、各民族中進(jìn)行反復(fù)驗(yàn)證?；诖吮菊n題擬通過(guò)PCR法對(duì)維吾爾族及漢族AD患者和相應(yīng)健康人外周血SORL1基因、EPHA1基因DNA測(cè)序分析，探索SORL1基因、EPHA1基因與新疆維吾爾族及漢族AD患者間的相關(guān)性和民族之間的差異，為臨床早期診斷AD提供依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集來(lái)自2016年8月至2018年6月在新疆醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床腦科中心就診的及烏魯木齊周邊地區(qū)醫(yī)院就診的符合精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第四版診斷標(biāo)準(zhǔn)并在新疆地區(qū)居住時(shí)間超過(guò)10年的維吾爾族AD患者及漢族AD患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：抑郁癥引起的假性癡呆，其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病、系統(tǒng)性疾病和物質(zhì)中毒所引起的癡呆，正處于心、肺、肝、腎等重大軀體疾病急性期的患者。收集AD患者131例，年齡均≥65歲，平均(74.40±7.92)歲，均為散發(fā)性，其中維吾爾族 AD 72例(男35例，女37例)，漢族AD 59例(男26例，女33例)。同期選擇與病例組年齡、性別、生活環(huán)境及方式、民族習(xí)俗相匹配的非AD患者或健康志愿者做對(duì)照組，共128例，平均(75.20±7.59)歲，其中維吾爾族63例(男28例，女35例)，漢族65例(男25例，女40例)。病例組與對(duì)照組之間性別、年齡、族別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集 全部患者及健康對(duì)照組采集外周靜脈血3 ml。

1.2.2 基因組DNA的提取 全血提取基因組DNA使用TIANamp Genomic DNA kit提取試劑盒(北京天根生物技術(shù)公司)。嚴(yán)格按照說(shuō)明書操作。

1.2.3SORL1基因及EPHA1基因測(cè)定 PCR技術(shù)及DNA測(cè)序檢測(cè)SORL1基因、EPHA1基因位點(diǎn)的多態(tài)性。研究中SNP基因座信息來(lái)自于公共數(shù)據(jù)庫(kù)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)，查詢SORL1基因及EPHA1基因標(biāo)準(zhǔn)序列。引物序列參數(shù)見表1。委托北京博淼生物科技有限公司通過(guò)連接酶檢測(cè)-聚合酶鏈反應(yīng)(LDR-PCR)方法對(duì)SORLl、EPHA1基因的7個(gè)候選多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行分型。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)若不符合正態(tài)分布則用中位數(shù)(四分位間距)表示，采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)?；蛐唾Y料采用Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律的吻合度檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)和(或)Fisher 精確概率法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多位點(diǎn)關(guān)聯(lián)分析，使用多重檢驗(yàn)校正bonferroni校正,P<0.0167表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 SORL1及EPHA1基因PCR引物位點(diǎn)引物名稱PCR引物序列rs117675572nd-PCRPACGTTGGATGCCATCTTTCTTGTTGCCTCC1st-PCRPACGTTGGATGATGATGTCTTAGGGCATCTCUEP_SEQcCGATGCTGGGCAGTArs15251192nd-PCRPACGTTGGATGATGCTCAGAGTTTAAGTGAC1st-PCRPACGTTGGATGTAGAGGACAGAACACAGGACUEP_SEQggtcTTCAAGATTGCTTGAGGAAGATrs102330302nd-PCRPACGTTGGATGTGAGTCCCATCTGATATTCC1st-PCRPACGTTGGATGATGGTGAGCTTTGTGAGTGGUEP_SEQcccgCTTTACCCTCACCTCAGGArs16991022nd-PCRPACGTTGGATGAGAAGTGCAATGGATTCCGC1st-PCRPACGTTGGATGATCAGAGCAATCACGCAGACUEP_SEQATTCCGCTGCCCAAArs10101592nd-PCRPACGTTGGATGACCTGCCGAGAACCAAGAAG1st-PCRPACGTTGGATGGAAAGAACAGGAAAGAGGTGUEP_SEQcctgTAGATGAACAGCTAGTCATGrs22826492nd-PCRPACGTTGGATGGGGAGAAGAAAGTTGTGTG1st-PCRPACGTTGGATGCCCTTTCAAATGACTTTCAGUEP_SEQgctcAACTACGTTTCTCCATTTTCCrs38249682nd-PCRPACGTTGGATGGTGACTTTGACCTGGATGAG1st-PCRPACGTTGGATGACAAAGATGGGACCTACCTGUEP_SEQCCAAAAAAATGCCCTCTGC 注:1st-PCRP,前引物;2nd-PCRP,后引物;UEP_SEQ,單堿基延伸反應(yīng)引物

2 結(jié) 果

2.1SORL1基因及EPHA1基因多態(tài)性分析結(jié)果SORL1基因的rs1699102、rs1010159、rs2282649、rs3824968位點(diǎn)的基因型及EPHA1基因rs11767557、rs1525119、rs10233030位點(diǎn)基因型檢測(cè)結(jié)果符合Hardy-Weinberg平衡定律，見表2。

表2 AD病例組與對(duì)照組基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果基因位點(diǎn)病例基因型等位基因HWE(P)rs1010159TTTCCCTC 病例組1302365421111490.6736 對(duì)照組128295643114142rs2282649CCCTTTCT 病例組1312867361231390.9420 對(duì)照組128315938121135rs3824968AAATTTAT 病例組1312664411161460.6135 對(duì)照組128305939119137rs1699102TTTCCCTC 病例組131114080622000.6479 對(duì)照組12812417565191rs11767557CCCTTTCT 病例組13033394392210.6002 對(duì)照組1272309534220rs1525119TTTAAAAT 病例組130155758871730.3081 對(duì)照組12814476775181rs10233030GGGCCCGC 病例組1312364441101520.6203 對(duì)照組128275942113143 注:HWE:Hardy-Weinberg平衡定律吻合度檢驗(yàn)

2.2 病例組與對(duì)照組基因型及等位基因分布的比較見表3。SORL1基因rs1699102、rs1010159、rs2282649、rs3824968位點(diǎn)與EPHA1基因rs11767557、rs1525119、rs10233030位點(diǎn)分布在病例組和對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。SORL1基因的rs2282649位點(diǎn)的等位基因分布在維吾爾族AD患者與漢族AD患者間的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.0167)。SORL1基因的rs1699102位點(diǎn)的基因型及等位基因分布在維吾爾族AD患者與漢族AD患者間的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.0167)。EPHA1基因的rs10233030位點(diǎn)的基因型及等位基因分布在維吾爾族AD患者與漢族AD患者間的比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.0167)。

2.3SORL1染色體上形成LD等位基因的比較 見圖1、表4。SORL1基因上漢族AD患者與對(duì)照組比較中發(fā)現(xiàn)，rs1010159、rs2282649、rs3824968形成單體型，維吾爾族AD患者與對(duì)照組比較中發(fā)現(xiàn)，rs16991102、rs2282649、rs3824968形成單體型。維吾爾族AD患者與漢族AD患者比較中發(fā)現(xiàn)，rs1010159、rs2282649、rs3824968形成單體型，前二者等位基因頻率的比較中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。維吾爾族AD患者與漢族AD患者中LD單倍體中ATC∶TCC堿基序列差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 病例組與對(duì)照組基因型及等位基因分布的比較基因位點(diǎn)組別基因型χ2值P值等位基因χ2值P值rs1010159TTTCCCTC 漢族組病例組926240.620.7344740.650.42對(duì)照組1329235575 維吾爾族組病例組1439181.950.3867750.0030.95對(duì)照組1627205967 病例組維吾爾族組1439183.470.1867752.580.10漢族組926244474rs2282649CCCTTTCT 漢族組病例組927230.810.6745730.620.43對(duì)照組1428235674 維吾爾族組病例組1940131.550.4666780.180.67對(duì)照組1531176165 病例組維吾爾族組1940137.660.0278666.692<0.01漢族組927234573rs3824968TTATAATA 漢族組病例組242690.620.7374440.650.44對(duì)照組2329137555 維吾爾族組病例組1738170.370.8372720.020.90對(duì)照組1730166462 病例組維吾爾族組1738174.660.1072724.240.05漢族組242697444

續(xù)表基因位點(diǎn)組別基因型χ2值P值等位基因χ2值P值rs1699102TTTCCCTC 漢族組病例組012474.200.12121061.920.17對(duì)照組3154721109 維吾爾族組病例組1128330.080.9650940.0010.97對(duì)照組926284482 病例組維吾爾族組11283323.00<0.001509421.64<0.001漢族組0124712106rs11767557CCCTTTCT 漢族組病例組216401.090.5820961.090.30對(duì)照組1144916112 維吾爾族組病例組117540.070.97191250.070.80對(duì)照組1164618108 病例組維吾爾族組117540.950.62191250.080.36漢族組216402096rs1525119TTTAAATA 漢族組病例組726251.060.6040760.780.38對(duì)照組724343892 維吾爾族組病例組831330.660.7247970.340.56對(duì)照組723333789 病例組維吾爾族組831330.100.9547970.100.75漢族組726254076rs10233030GGGCCCGC 漢族組病例組624280.690.7036800.630.42對(duì)照組929274783 維吾爾族組病例組1739160.820.6671730.080.78對(duì)照組1530186066 病例組維吾爾族組17391610.410.00573719.960.002漢族組625283781 注:rs11767557漢族病例組及漢族對(duì)照組均有1例未檢出,rs1525119漢族病例組有1例未檢出,rs10233030漢族病例組有1例未檢出

圖1SORL1染色體上形成LD單倍體圖

2.4EPHA1染色體上形成LD等位基因的比較 見圖2、表5。EPHA1基因上漢族AD患者與對(duì)照組比較，維吾爾族AD患者與對(duì)照組比較，維吾爾族AD患者與漢族AD患者比較中均發(fā)現(xiàn)rs1525119、rs10233030形成單體型。前兩者比較中，LD形成的等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，維吾爾族AD患者與漢族AD患者中LD單倍體中AC堿基序列差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表4 SORL1染色體上形成LD等位基因的比較(例,%)LD單倍體等位基因型漢族組病例組對(duì)照組χ2值P值rs3824968-rs2282649-rs1010159ATC73(61.9)74(56.9)0.6230.43TCT44(37.3)55(42.3)0.650.42LD單倍體等位基因型病例組維吾爾族組漢族組χ2值P值rs3824968-rs2282649-rs1010159ATC66(45.8)73(61.9)6.700.01TCT66(45.8)44(37.3)1.930.16TCC6(4.2)0(0)5.050.02ACC4.8(3.3)1(0.8)1.860.17LD單倍體等位基因型維吾爾族組病例組對(duì)照組χ2值P值rs16991102-rs2282649-rs3824968CAT64.9(45.1)60.9(48.3)0.290.59TTC48.9(34)43.9(34.9)0.020.88CTC23.1(16)20.1(15.9)00.98CAC6(4.2)1(0.8)3.030.08

圖2 EPHA1染色體上形成LD單倍體圖

表5 EPHA1染色體上形成LD等位基因的比較(例,%)LD單倍體等位基因型漢族組病例組對(duì)照組χ2值P值rs1525119-rs10233030AC40(33.9)45(34.6)0.010.9095AG37(31.4)47(36.2)0.640.4253TC41(34.7)38(29.2)0.860.3546LD單倍體等位基因型病例組維吾爾族組漢族組χ2值P值rs1525119-rs10233030AG71.8(49.8)36.9(31.3)9.200.0024TC45.8(31.8)41.0(34.8)0.260.6075AC25.2(17.5)40.0(33.9)9.26<0.01LD單倍體等位基因型維吾爾族組病例組對(duì)照組χ2值P值rs1525119-rs10233030AC25(17.5)23(18.3)0.150.69AG72(49.9)66(52.3)0.200.65TC46(31.9)37(29.3)0.040.85

3 討 論

SORL1基因位于11號(hào)染色體上(11q23.2-q24.2)，是低密度脂蛋白家族成員，也是AD發(fā)生有關(guān)聯(lián)的排名前10的基因?；蚪M學(xué)數(shù)據(jù)顯示52個(gè)SORL1基因位點(diǎn)中，29個(gè)位點(diǎn)與AD患病密切相關(guān)，與加勒比海地區(qū)的西班牙人、非裔美國(guó)人和個(gè)別白種人的相關(guān)性可分別達(dá)到98%、90%、53%[3-4]。AD患者腦組織中SORL1表達(dá)水平的降低能增加Aβ的產(chǎn)生[4]。許多研究都將SORL1基因的常見和罕見變異與AD聯(lián)系起來(lái)[5-9]，不同的變異在不同的研究中是相關(guān)的，風(fēng)險(xiǎn)影響范圍從小的修改影響到因果影響不等。然而本研究中SORL1基因rs16199102、rs1010159、rs2282649、rs3824968多態(tài)性位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)與AD有相關(guān)性。El-Bitar等[10]在沙特阿拉伯AD患者中研究發(fā)現(xiàn)SORL1在家族和散發(fā)的AD中均起到一定的作用。然而本研究中AD患者均為散發(fā)型，且4個(gè)位點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)與散發(fā)型AD有關(guān)這與Campion等[11]報(bào)道相一致。在晚發(fā)型LOAD中一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)三個(gè)基因變異rs2070045，rs2282649和rs3824968及其標(biāo)記的基因變異導(dǎo)致中國(guó)北方人和歐洲人群的患AD風(fēng)險(xiǎn)增高，這三種基因變異具有顯著的遺傳效應(yīng)，調(diào)節(jié)人腦組織中SORL1的表達(dá)[9]。Ning等[12]研究中發(fā)現(xiàn)rs2070045和rs2282649是風(fēng)險(xiǎn)等位基因，但rs3824968與AD發(fā)病無(wú)相關(guān)性。本研究與上述研究結(jié)論部分不一致，考慮在LOAD的發(fā)病率及基因頻率具有種族差異性，不同的人群、不同地區(qū)，SORL1基因需要在其他人群中進(jìn)行驗(yàn)證[13]。張玉潔等[14]首次分析新疆哈薩克族人群SORL1基因的rs2070045及rs3824968位點(diǎn)，并未發(fā)現(xiàn)之間有相關(guān)性。張玉潔等[14]的研究與本研究均發(fā)現(xiàn)rs3824968與新疆AD患者發(fā)病無(wú)明顯相關(guān)性，但上述結(jié)論需增加樣本量，再次在人群中反復(fù)驗(yàn)證使結(jié)論可信。

有幾項(xiàng)GWAS及候選基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，除了SORL1基因外，還有10個(gè)與 AD相關(guān)的危險(xiǎn)因素包括：ABCA7、BIN1、CD2AP、CD33, CLU、CR1、EPHA1、MS4A6A、MS4A6E、PICALM。但少有相關(guān)報(bào)道指出AD與相應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)基因表達(dá)水平之間有顯著關(guān)聯(lián)[15-17]。EPHA1基因位于7號(hào)染色體上(7q34-q35)，rs11767557變異位于EPHA1上游約3 kb處，可能會(huì)改變鄰近基因表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致AD的發(fā)生。Liu等[17]研究中rs11767557變異具有明顯的調(diào)節(jié)作用EPHA1基因在人全血中的表達(dá)，非決定性的證據(jù)。這些發(fā)現(xiàn)可能進(jìn)一步提供重要的補(bǔ)充rs11767557變異在AD發(fā)病中的調(diào)控機(jī)制。許多研究強(qiáng)調(diào)了rs11767557變異在歐洲人口中與AD風(fēng)險(xiǎn)密切相關(guān)，但本研究未發(fā)現(xiàn)EPHA1基因的rs11767557、rs1525119、rs10233030與AD的發(fā)生相關(guān)，AD的發(fā)生可能還與組織、細(xì)胞、區(qū)域、疾病的特異性因素來(lái)影響基因的表達(dá)，需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，從而得到可信的結(jié)果。

在本研究中，漢族rs16991102、rs2282649、rs3824968形成單體型模塊，維吾爾族rs1010159、rs2282649、rs3824968形成單體型，rs1525119、rs10233030形成單體型，這些形成的LD模塊中，SORL1基因SNP位點(diǎn)rs3824968-rs2282649-rs1010159形成的LD模塊發(fā)現(xiàn)維吾爾族AD患者與漢族AD患者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EPHA1基因中rs1525119-rs10233030形成的LD模塊在維吾爾AD患者與漢族AD患者中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Chou等[18]研究發(fā)現(xiàn)，臺(tái)灣漢族人SORL1 的SNPs形成兩個(gè)LD區(qū)，LD模塊1是rs2070045-rs1699102，另外SNPs rs3824968-rs3737529-rs2282649-rs1010159形成一個(gè)模塊。我們可以發(fā)現(xiàn)在不同地區(qū)、不同人群中的SNP形成的LD單倍體是有差異。這些差異可能在AD致病機(jī)制中也發(fā)揮不同作用，在白人、加勒比裔西班牙人和以色列阿拉伯人，SNPs位于SORL1基因組的5′端(SNPs 8-10)與AD的相關(guān)性最強(qiáng)[19-21]。然而，SNPs靠近SORL1的3′區(qū)基因組(SNP19和SNPs 22-25)與中國(guó)、日本、非洲和美國(guó)人有更為顯著的關(guān)系[17.20-21]。亞洲群體之間的發(fā)現(xiàn)SORL1的3′區(qū)在其中的致病作用，進(jìn)一步解釋為什么最重要的單核苷酸多態(tài)性在不同的地區(qū)存在差異。

SORL1基因不同SNP位點(diǎn)，基因型分為野生型和突變型。本研究發(fā)現(xiàn)rs2282649中，維吾爾患者攜帶C等位基因較漢族AD患者攜帶T等位基因更容易患AD, rs3824968中T等位基因易導(dǎo)致維吾爾族患AD，rs1699102中T等位基因較C等位基因更容易使維吾爾族患AD，rs10233030中維吾爾AD患者更易攜帶G等位基因。在臺(tái)灣人群中rs1784933與AD/MCI易感性相關(guān)比較中發(fā)現(xiàn)等位基因G具有保護(hù)作用[18]，且在臺(tái)灣人群中未發(fā)現(xiàn)rs1699102、rs2282649不同的等位基因在AD患者中起致病或保護(hù)作用。但在另一學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)中國(guó)內(nèi)地的漢人rs1784933中G等位基因具有保護(hù)作用[22]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)SORL1基因rs2070045位點(diǎn)的G等位基因是危險(xiǎn)基因，并且該等位基因在女性人群也是危險(xiǎn)等位基因[23]。SORL1基因及EPHA1基因區(qū)域的多個(gè)位點(diǎn)的SNP,在各研究中位點(diǎn)選擇差異，各研究中研究樣本的差異，可能是各研究結(jié)果不一致的原因[24]。

綜上所述，在本研究的樣本中未發(fā)現(xiàn)SORL1基因的4個(gè)位點(diǎn)，EPHA1基因的3個(gè)位點(diǎn)與AD有關(guān)，可能原因如下：第一，AD發(fā)生機(jī)制比較復(fù)雜，不能用單一因素解釋新疆AD患者SORL1基因、EPHA1基因與疾病之間的相關(guān)性。第二，可能因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的局限性。希望未來(lái)有大樣本的不同人群研究AD遺傳基因的差異。