螺旋藻多糖對急性酒精中毒小鼠肝、心、腎、胸腺抗氧化損傷的研究

陳帥行， 馬浩天， 李潤植， 葛保勝， 崔紅利

(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所， 太谷 030801; 2. 中國石油大學(xué)(華東) 生物工程中心， 青島 266580)

急性酒精性中毒會引起體內(nèi)代謝水平失衡，致使細胞膜完整性受損，收縮蛋白功能障礙，細胞器功能失常，導(dǎo)致腎臟損傷、肝損傷以及降低機體的免疫力[1-4]。預(yù)防酒精性損傷中最為重要的一條是戒酒，戒酒可以改善肝損傷的程度。納曲酮和類固醇是一種純阿片樣物質(zhì)拮抗劑，可以控制嗜酒者對酒精的渴望，但同時會對肝細胞造成損傷，長期服用也會對患者產(chǎn)生副作用。多糖可以作為新的藥物在急性酒精誘導(dǎo)的機體損傷下，有效降低其體內(nèi)的活性氧，緩解急性酒精引起的損傷[5-8]。

螺旋藻多糖是從螺旋藻中分離出來的生物活性物質(zhì)之一，可延緩疲勞、增強機體免疫力、降低血脂和血壓水平[9-13]。螺旋藻及其產(chǎn)品還具有治療記憶力損傷、減輕了二嗪農(nóng)(DZN)的毒性作用，保護砷(AS)對大鼠睪丸氧化損傷的作用[14]，而且螺旋藻對砷誘導(dǎo)的大鼠睪丸氧化損傷具有一定的保護作用[15]，以上結(jié)果表明螺旋藻作為藥物治療有顯著的效果。近年來對其抗氧化作用的研究已經(jīng)不斷深入，但用它治療酒精性損傷的案例未見報道。本文利用50%乙醇代替酒精建立酒精心臟、胸腺、腎臟、肝的酒精損傷模型，鈍頂螺旋藻多糖為治療藥物，以聯(lián)苯雙酯作為陽性對照來研究螺旋藻多糖對小鼠急性酒精性腎臟、心臟、胸腺及肝損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 材料

兩月齡雄性小鼠30只，體重(22±2)g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，標準嚙齒類動物飼養(yǎng)籠、飼料(蘇州新區(qū)楓橋凈化設(shè)備有限公司)、鈍頂螺旋藻多糖(純度 98%) 購自西安斯諾特生物技術(shù)有限公司、聯(lián)苯雙酯片(北京協(xié)和藥廠H50021197)；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(C009-3)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶試劑盒(C010-3)、丙二醛試劑盒(A003-1)、過氧化氫酶試劑盒(A007-2)和谷胱甘肽試劑盒(A006-1)總蛋白定量試劑盒(A405-3)均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 小鼠醉酒和酒醒鑒定參考文獻[16]。在第22天除正常組外，均灌胃12 mL/kg的50%乙醇，灌胃后，將其背向下放置鼠籠內(nèi)，其背向下姿勢保持30 s以上，判定為醉酒，12 h后100%小鼠酒醒，處死，取肝、心、腎及胸腺組織，研磨取上清備用。

1.2.2 動物分組和模型建立

30只小鼠隨機分組為空白組(生理鹽水)、模型組(生理鹽水)、陽性對照組(聯(lián)苯雙酯150 mg/kg·d)、低劑量螺旋藻多糖組(100 mg/kg·d)、高劑量螺旋藻多糖PSP組(300 mg/kg·d)，每天灌胃1次，共灌胃21 d，實驗期間提供全價的顆粒飲料和飲用水，第22天除空白對照組外，其余4組均用(12 mL/kg)50%乙醇灌胃建立急性酒精性腎臟、心臟、胸腺、肝臟損傷模型，空白小組灌等體積的生理鹽水。12 h后(無小鼠死亡)每組小鼠均頸椎脫臼處死，解剖取腎臟、心臟、脾臟及胸腺測定抗氧化指標。

1.2.3 血清中 ALT和AST的測定

小鼠摘眼球取血，血液室溫下放置10 min，自然凝集后，3000 r/min 離心10 min，分裝血清、備用。血清中 ALT、AST 測定照試劑盒操作。

1.2.4 組織勻漿和酶液制備

將解剖好的臟器放置-20 ℃保存，以便測定組織抗氧化指標，準確稱取1 g肝、心、腎、胸腺組織，使用9%的生理鹽水沖洗組織表面的血液，拭干，冰浴條件下用手術(shù)刀切碎組織，研磨至勻漿，加入生理鹽水，移入到1.5 mL離心管中，在4 ℃條件下3500 r/min離心，取上清液用于測定抗氧化指標。

1.2.5 檢測方法

測試CAT、GSH、MDA、ALT及AST指標的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所，測試方法參考試劑盒說明書。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)重復(fù)3次，使用DPS統(tǒng)計軟件，LSD法對數(shù)據(jù)進行分析，以ANOVA(P<0.05)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，使用Origin8軟件繪制統(tǒng)計圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻多糖對急性酒精中毒小鼠肝、心、腎及胸腺中CAT含量的影響

CAT可以使過氧化氫還原成水和分子氧，清除體內(nèi)的過氧化氫，避免細胞受損，而活性氧濃度大于一定量時，酶的作用就會減弱。如圖1所示，模型組小鼠腎臟、心臟、胸腺、肝臟的CAT活力明顯低于空白對照組(10%～20%)，且顯著差異(P<0.05)，說明造模成功。陽性對照組的CAT含量升高，均達到空白組水平，且差異不顯著，說明給藥成功。在腎臟組織中，多糖組能夠顯著提高CAT活力，可達到陽性對照組水平，且與多糖劑量呈現(xiàn)非濃度依賴性，在心臟、胸腺、肝臟組中能夠一定程度恢復(fù)CAT活力，但達不到陽性對照組水平(70%、65%和80%)，且與多糖劑量呈現(xiàn)濃度正相關(guān)。其中高劑量螺旋藻多糖組小鼠的各組織CAT水平均達到空白組的90%，幾乎接近陽性對照組水平，且差異不顯著。低劑量螺旋藻多糖組小鼠的各組織中CAT含量也達到空白組水平的75%左右。以上結(jié)果說明螺旋藻多糖有效提高急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及肝損傷的CAT活性，增強了小鼠機體的抗氧化能力。

A：腎臟；B：心臟；C：胸腺；D：肝臟

圖1螺旋藻多糖對小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟CAT含量的影響的含量

Figure 1 Effect of PSP on CAT contents in kidney， heart， thymus and liver of mice (x±s,n=6)

2.2 螺旋藻多糖對急性酒精中毒小鼠肝、心、腎及胸腺中GSH含量的影響

GSH 是一種小分子肽，具有抗氧化的功能從而可以清除自由基。如圖2所示,模型組小鼠各組織的GSH含量明顯低于空白對照組，說明急性酒精灌胃(12 mg/kg)會降低腎臟、心臟、胸腺和肝臟中GSH的含量，且差異顯著(P<0.05)，說明造模成功。陽性對照組的GSH含量升高，均達到空白組水平，且差異不顯著，說明給藥成功。高劑量多糖組能夠提高腎臟、心臟、肝臟組織中GSH活力，達到空白組水平，且差異不顯著;在胸腺組織中，高劑量多糖組未達空白組水平，差異顯著(P<0.05)。低劑量多糖組達到陽性對照水平的40%～60%，遠低于空白組水平且差異顯著(P<0.05)。實驗結(jié)果說明螺旋藻多糖可顯著提高急性酒精性小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟的GSH含量，提高機體的抗氧化能力，對急性酒精性中毒起到顯著的保護作用。

A：腎臟；B：心臟；C：胸腺；D：肝臟

圖2螺旋藻多糖對小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟GSH含量的影響

Figure 2 Effect of PSP on GSH contents in kidney, heart,
thymus and liver of mice (x±s,n= 6)

2.3 螺旋藻多糖對急性酒精中毒小鼠肝、心、腎及胸腺中MDA含量的影響

MDA 是脂質(zhì)過氧化最重要的產(chǎn)物之一，反映膜的損傷程度，其在組織的含量與細胞損傷程度成正相關(guān)，所以在機體衰老抗性生理研究中，MDA是評價細胞膜過氧化程度的重要指標。由圖3可見，模型組小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟的MDA含量平均是空白對照組的3倍，說明造模成功；與模型組相比，陽性對照組中各組織的MDA含量降低至正常水平，且差異不顯著，說明給藥成功。在腎臟、心臟、胸腺和肝臟組織中，低劑量多糖組能夠一定程度恢復(fù)MDA活力，但無法達到陽性對照組水平。高劑量多糖組清除MDA效果優(yōu)于低劑量多糖組，且治療效果在肝臟中最接近陽性對照水平且差異不顯著。以上結(jié)果說明螺旋藻多糖能有效改善急性酒精對小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟氧化損傷的保護能力。

2.4 螺旋藻多糖對急性酒精中毒小鼠肝ATL和AST含量的影響

ALT和AST是存在于肝細胞內(nèi)的代謝酶類，在肝損傷的情況下ALT和AST的含量會上升，所以常用ATL和AST作為急性肝細胞損害的敏感標志，同時也是臨床肝功能檢驗的常用指標。如圖4所示，模型組小鼠肝臟的ALT和AST含量明顯高于空白組，且差異顯著(P<0.05)，說明造模成功；陽性對照組的ALT和AST含量接近空白組，說明給藥成功。低劑量多糖組中，小鼠肝臟中的ALT和AST含量均有不同程度下降，高劑量螺旋藻多糖中ALT和AST均降低至陽性對照水平，差異不顯著，且治療效果與多糖劑量呈現(xiàn)濃度正相關(guān)。說明螺旋藻多糖能夠提高急性酒精引起損傷的抗氧化水平，對酒精性肝臟損傷具有一定的保護作用。

A：腎臟；B：心臟；C：胸腺；D：肝臟

圖3螺旋藻多糖對小鼠腎臟、心臟、胸腺及肝臟MDA含量的影響的含量

Figure 3 Effect of PSP on MDA contents in kidney， heart， thymus and liver of mice (x±s,n= 6)

A：ATL； B：AST

圖4PSP對小鼠肝臟ALT和AST含量的影響

Figure 4 Effect of PSP on ALT and AST contents in liver of mice (x±s,n= 6)

3 討論與結(jié)論

飲酒過量會引起機體組織的急性和慢性酒精中毒，短時間內(nèi)攝入過多的乙醇，在體內(nèi)代謝過程中會產(chǎn)生氧化應(yīng)激作用[18-21]，機體組織會釋放大量的活性自由基，這些自由基可以促使膜氧化、加速細胞的衰老和解體，從而使細胞的正常功能受損，喪失正常功能，造成機體代謝紊亂[22-24]。

本實驗通過使用鈍頂螺旋藻多糖建立急性酒精組織損傷模型，測定各組中小鼠組織中MDA、GSH、CAT以及肝臟中ALT和AST的含量變化，探討螺旋藻多糖對急性酒精性中毒引起的肝臟、腎臟、心臟、胸腺的損傷的保護作用。結(jié)果顯示,造模后小鼠各組織中MDA含量明顯高于空白對照組，心臟、肝臟、腎臟及胸腺組織中CAT 、GSH的活性均明顯低于空白對照組。其機制可能是乙醇引起小鼠體內(nèi)自由基含量增多，進而引起生物膜受損、MDA含量增加，同時消耗體內(nèi)大量CAT和GSH以抵御自由基引起的損傷，使其活力下降，導(dǎo)致機體防御系統(tǒng)平衡失調(diào)，引起器官細胞發(fā)生脂質(zhì)過氧化，增強細胞膜通透性，膜表面受體受損，進而影響機體的免疫功能，與急性酒精損傷機理的結(jié)果相同。攝入螺旋藻多糖的小鼠,多糖高劑量組腎臟 MDA 含量在P<0.05水平上有顯著性恢復(fù)，接近空白對照組水平，而在肝臟、心臟、胸腺中顯著性較低，這可能是因為4種器官不同功能所造成的，胸腺自身的免疫功能可以減少酒精帶來的傷害；在多糖高劑量組的腎臟中CAT和GSH 活性接近空白水平，且顯著性差異明顯高于心臟、肝臟、胸腺。而心臟、肝臟、胸腺勻漿三者的 CAT和GSH 活性雖低于腎臟組織，但隨著多糖劑量的上升， CAT和GSH的活性逐漸上升,呈一定的量效關(guān)系，這可能是螺旋藻多糖提高內(nèi)源性抗氧化防御體系實現(xiàn)的。已有研究表明，枸杞多糖與黃芪多糖[25]聯(lián)用可以有效清除MDA含量及促進GSH含量升高；黑牛肝菌多糖[26]可以降低MDA含量，提高SOD抗氧化水平；植物多糖[27]通過提高細胞內(nèi)SOD、CAT、GSH 等抗氧化物水平及清除積累的MDA，可以提高細胞的抗氧化活性，降低細胞的氧化損傷程度，鐵皮楓斗多糖[28]能夠顯著降低血清中AST和ALT活性，減少肝臟功能損傷。與上述多糖結(jié)果相似，本實驗結(jié)果顯示模型組中AST和ALT含量2倍于空白組，螺旋藻多糖組中AST和ALT活性下降接近空白組水平，呈一定的量效關(guān)系，且差異不顯著。螺旋藻多糖對預(yù)防急性酒精中毒引起的肝臟、腎臟、心臟、胸腺的損傷具有明顯的保護作用。相較人工合成的藥物，螺旋藻多糖作為天然的抗氧化劑，幾乎不會對機體產(chǎn)生副作用，有望開發(fā)為綠色的保健食品。