肺癌細胞外泌體GPI-錨定蛋白組學研究

吳微波, 廖 海, 周大鵬

(1. 西南交通大學 生命科學與工程學院， 成都 610036； 2. 同濟大學 醫(yī)學院， 上海 200082)

腫瘤是威脅人類生命的重大疾病之一，一旦發(fā)展到晚期，病人的生存率、生活質(zhì)量均明顯降低。因此，腫瘤的早期診斷對于癌癥的治療、預后等都有非常大的意義。1983年，外泌體首次于綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1987年Johnstone將其命名為“exosome”[1]。外泌體作為一種細胞外囊泡，可以運輸包括蛋白質(zhì)和核酸在內(nèi)的許多生物活性分子，這些分子調(diào)節(jié)靶細胞的基因表達和細胞功能。因此，外泌體介導的自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌效應可用于治療[2]。研究表明，腫瘤外泌體可以促進腫瘤的侵襲和遷移，且與腫瘤的發(fā)育和形成有關[3-5]。因此，外泌體作為腫瘤診斷標記物具有很大可行性。

GPI錨定蛋白作為一類在生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導等起重要作用，同時又參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要分子[6-8]，必然與癌癥息息相關。GPI-anchor的核心結(jié)構(gòu)在迄今研究的所有物種中都是保守的[9-10], 其與包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥的發(fā)育和形成有重要關系，且有報道稱GPI錨定蛋白可以作為癌癥診斷的標記物[11]。有報道指出，外泌體可以作為疾病的治療工具和生物標記物[3]，但是診斷的靶點尚不明確，目前GPC1等癌癥診斷標記物并不一定適用于外泌體，所以需要找到新的GPI錨定蛋白作為外泌體標記物來診斷癌癥。德國癌癥研究中心的一項研究表明，CD24可以作為外泌體的標記物來檢測外泌體[12]。所以我們推測，可以通過GPI錨定蛋白作為外泌體的標記物，進而診斷腫瘤。

我們從Uniprot數(shù)據(jù)庫獲取了人GPI錨定蛋白數(shù)據(jù)，并在肺癌病人和健康人的基因表達mRNA陣列數(shù)據(jù)中篩選出差異表達的GPI錨定蛋白。然后利用DIA定量技術(shù)對NCI-H838非小細胞肺癌細胞系膜蛋白和外泌體蛋白豐度進行定量并篩選出其中的GPI錨定蛋白。

1 材料與方法

1.1 不同類型肺癌mRNA陣列數(shù)據(jù)來源

所有肺癌類型的mRNA陣列數(shù)據(jù)均來自www.genome.wi.mit.edu/MPR/lung[13]。如之前所述，所有數(shù)據(jù)由一個簡單的R包使用RLE (relative log expression) 箱線圖和NUSE (normalized unscaled standard error) 箱線圖計算[14]。共216例，其中4例因在過程質(zhì)量控制中表現(xiàn)異常而丟棄。剩下的212個陣列數(shù)據(jù)包括以下患者:150個腺癌，20個支氣管類癌，5個小細胞肺癌，21個鱗狀肺癌，16個健康個體(表1)。

1.2 人GPI錨定蛋白來源

人GPI錨定蛋白數(shù)據(jù)來源于Uniprot數(shù)據(jù)庫，搜索關鍵詞為GPI-anchor (KW-0336), 最終得到173種GPI錨定蛋白(表2)。GPI錨定蛋白通過GPI-anchor或者GPI-like-anchor連接到膜的磷脂雙分子層。GPI-anchor連接到磷脂酰肌醇基團的復合物，GPI-like-anchor連接到磷脂酰肌醇基團的GPI-anchor類似物，兩者作用一樣，使蛋白C端附著在膜上。

1.3 外泌體的提取和鑒定

NCI-H838細胞從ATCC (America Type Culture Collection) 購買，用含10%胎牛血清(Life Technologies，Carlsbad，CA，USA) 的RPMI-1640培養(yǎng)基 (Life Technologies，Carlsbad，CA，USA)在5% CO2，37 ℃條件下培養(yǎng)。提取外泌體前，NCI-H838細胞在10 cm培養(yǎng)皿中用無血清RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h，使融合度達到90%～100%。收集培養(yǎng)基，4 ℃條件下3000 r/min離心10 min以去除分離的細胞。隨后，將培養(yǎng)基在4 ℃條件下10 000 r/min離心30 min以去除大的細胞外囊胞。收集上清，用0.22 μm濾管 (Millipore, Burlington, MA, USA) 過濾以去除細胞微泡和受到污染的凋亡體。在4 ℃條件下，用貝克曼L-80XP超速離心機(Beckman Coulter，Brea，CA，USA)以45Ti型固定角轉(zhuǎn)子100 000 r/min離心2 h來分離上清。小心移除上清，用70 mL預冷PBS重懸，4 ℃條件下，在45Ti型固定角轉(zhuǎn)子中100 000 r/min離心2 h。小心移除上清，用200 μL預冷PBS重懸收集外泌體。

用中科院細胞生物學研究所掃描電子顯微鏡(Quanta 250 SEM，F(xiàn)EI，USA)鑒定外泌體。取20 μL外泌體懸液作為樣品，用不同固定液依次固定：2.5%戊二醛1.5 h、1%鋨酸固定液1 h、2%單寧酸15 min和1%鋨酸固定液0.5 h(每次固定后用0.1 mol/L磷酸緩沖液漂洗3次，每次10 min)。固定完成后，依次用不用濃度乙醇進行脫水處理：30%乙醇5 min，50%乙醇5 min，70%乙醇10 min，80%乙醇10 min，95%乙醇15 min，最后用100%乙醇(無水硫酸鈉處理)處理2次，每次15 min。之后用臨界點干燥法進行干燥，經(jīng)過噴金處理后用掃描電鏡進行觀察。

1.4 膜蛋白和外泌體蛋白的提取

利用膜蛋白提取試劑盒(Thermo Scientific，USA，Cat:89842)來提取蛋白，按照使用說明操作。之后用Bradford法測定蛋白濃度，然后用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并用銀染試劑盒(索萊寶，Cat：G7210)染色以初步鑒定蛋白。

1.5 質(zhì)譜分析方法和數(shù)據(jù)分析

每個樣品取135 μg，用FASP(filter-aided sample preparation)法進行蛋白質(zhì)酶解。將每個樣品中等量的消化多肽制成混合樣品，用改良的High-pH RP法分成3個組分[14]。之后采用NanoDrop 2000測定樣品肽濃度以保證上樣量一致，用于質(zhì)譜的起始蛋白量均為 2 μg。上述分級得到的3個多肽樣本使用DDA(Date Dependent Acquisition，數(shù)據(jù)依賴采集)進行數(shù)據(jù)采集，每個樣本采集一次，采集結(jié)果作為構(gòu)建數(shù)據(jù)庫使用。肽段混合物在EasynLC LC1200系統(tǒng)(San Jose，Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)中用國產(chǎn)色譜柱C18(3 μm, 75 μm × 15 cm)以600 nL/min的速率進行分離。采用DIA法分析兩種樣品，同時加入等量索引保留時間標準(iRT，Biognosys)[15]。使用Proteome Discoverer 2.1(San Jose，Thermo Fisher，Waltham，MA，USA)針對人類uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(9606)搜索DDA原始文件。將利用Proteome Discoverer 2.1進行數(shù)據(jù)依賴性采集的搜索結(jié)果用Spectronaut 10 (Biognosys, Schlieren, Switzerland)轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜庫中。

在Spectronaut 10.0中應用以下設置：峰值檢測，動態(tài)iRT，啟用；矯正因子1；啟用動態(tài)評分細化和MS1評分；干擾校正和歸一化交叉相關(總峰面積)，啟用。在質(zhì)譜庫中確定碎片離子的數(shù)量，并且所有碎片離子都是鑒定和定量所必需的。Spectronaut利用加入的標準iRT肽進行m/z和保留時間校準。對于我們的數(shù)據(jù)集，m/z耐受性在4 mg/L的范圍內(nèi)，中值保留時間提取窗口為8 min。所有結(jié)果均通過Q值0.01(相當于肽水平上FDR為1%)進行篩選。所有其他設置都設置為默認值。將Spectronaut輸出文件中每種蛋白的肽峰面積(由Spectronaut計算的碎片離子峰面積的總和)相加來計算蛋白質(zhì)豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 外泌體及蛋白的提取和鑒定

如圖1所示，A、B分別為放大15 000和30 000倍電鏡圖，外泌體在電子顯微鏡下清晰可見，說明成功提取到NCI-H838細胞系外泌體。 外泌體大小不一，多為盤狀囊泡結(jié)構(gòu)。圖2為NCI-H838細胞膜和外泌體蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖，該圖表明成功提取到蛋白樣品。

圖1 NCI-H838細胞外泌體Figure 1 Exosomes from NCI-H838 cells

圖2 NCI-838細胞膜蛋白和外泌體蛋白SDS-PAGE凝膠電泳圖Figure 2 SDS-PAGE gel electrophoresis of membrane and exosome protein from NCI-838 cell line

2.2 GPI錨定蛋白數(shù)據(jù)

利用Uniprot數(shù)據(jù)庫的173種人GPI錨定蛋白數(shù)據(jù)在TCGA來源的肺癌病人進行篩選，得到114種GPI錨定蛋白，其中43種有明顯表達差異(P≤0.05)。在得到這些數(shù)據(jù)之后，利用質(zhì)譜技術(shù)對非小細胞肺癌細胞膜蛋白和外泌體蛋白進行了DIA定量，然后在NCI-H838細胞定量結(jié)果中進行篩選。結(jié)果(表1)顯示共得到19種GPI錨定蛋白，其中存在于外泌體的有15種。

EX：Exosome；MP：Membrane protein

圖3樣本相互之間相關性
Figure 3 Correlation analysis between exosome and membrane proteins

利用蛋白質(zhì)組學分析軟件ProteomeDiscoverer 2.1對DDA采集的數(shù)據(jù)進行蛋白質(zhì)鑒定分析，鑒定結(jié)果作為DIA定量數(shù)據(jù)庫使用，檢索數(shù)據(jù)庫采用Uniprot網(wǎng)站下載的Human數(shù)據(jù)庫(數(shù)據(jù)庫編號9606)，數(shù)據(jù)庫中加入了11條人工合成多肽的氨基酸序列信息，搜庫引擎使用Sequest HT。為了去除假陽性結(jié)果，數(shù)據(jù)檢索采用正反庫檢索策略，檢索結(jié)果在多肽層次以及蛋白層次均進行了過濾以保證鑒定結(jié)果的可靠性。使用Spectronaut軟件將上述DDA采集的數(shù)據(jù)構(gòu)建為定量數(shù)據(jù)庫，然后將采集的DIA原始數(shù)據(jù)與該定量數(shù)據(jù)庫進行比對，抽提各個蛋白質(zhì)特異性肽段的定量色譜峰面積，以此作為蛋白質(zhì)相對豐度表征，并對各個樣本中的蛋白質(zhì)豐度進行比較，篩選差異表達蛋白。

樣本相互之間的相關性分析結(jié)果(圖3)顯示，組內(nèi)樣本相關性非常高，接近1，這顯示了良好的重復性。圖 4則進一步說明了樣本組內(nèi)重復性較高，此外，從聚類圖中可以看出EX(exosome)與MP(membrane protein)樣本的表達差異較大，EX蛋白種類明顯少于MP。

EX：Exosome；MP：Membrane protein

圖4聚類分析圖
Figure 4 Clustering analysis of exosome and membrane proteins

表1 NCI-H838細胞系GPI錨定蛋白定量結(jié)果

注：表中數(shù)值1表示在外泌體中未發(fā)現(xiàn)該蛋白或者其含量極少可以忽略不計

2.3 可作為腫瘤診斷標記物的GPI錨定蛋白

如表2所示，在NCI-H838細胞系外泌體中有定量且在TCGA數(shù)據(jù)庫mRNA陣列數(shù)據(jù)中存在的GPI錨定蛋白共11種，其中在肺癌病人和健康個體之間有明顯表達差異的有7種，分別是： MSLN、CPM、SMPDL3B、HYAL2、EFNA5、RECK和GPC1。由圖5可以看出，上述7種蛋白在外泌體和細胞膜的表達量差異較大，另外，GPC1、CPM、MSLN、RECK、SMPDL3B、EFNA5和HYAL2在外泌體與細胞膜的含量比值分別約為11.7、3.8、12.7、6.0、14.7、3.4和15.4，蛋白豐度差異性較大，在檢測相應蛋白在外泌體中含量時受到的影響可能較小。

2.4 GPI錨定蛋白的O-糖基化

糖基化是細胞內(nèi)最豐富的翻譯后修飾之一。在正常生理條件下，細胞外蛋白的O-糖基化對結(jié)構(gòu)和功能都是至關重要的。但是惡性腫瘤會干擾O-糖基化通路和改變短O-聚糖的表達，這也是其最常見和最顯著的特征[16-17]。GPI錨定蛋白作為一類在生長發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導等起重要作用，同時又參與腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的重要分子[6-8]，其O-糖基化對于腫瘤也必然具有重要意義。如表3所示，在114種肺癌GPI錨定蛋白mRNA陣列數(shù)據(jù)中，19種有O-糖基化修飾存在，其中8種有連續(xù)O-糖基化修飾。

表2 NCI-H838細胞系外泌體和TCGA數(shù)據(jù)庫肺癌病人共有GPI錨定蛋白

注：AVE_PATIENTS為肺癌病人mRNA陣列數(shù)據(jù)；AVE_NORM為健康個體mRNA陣列數(shù)據(jù)；PATIENTS-NORM表示基因在肺癌病人和健康個體的表達差異

表3 TCGA數(shù)據(jù)庫中有O-糖基化修飾的GPI錨定蛋白Table 3 GPI-anchored proteins with O-glycosylation modifications in TCGA database

圖5篩選的7種GPI錨定蛋白在NCI-H838細胞膜和外泌體中的定量
Figure 5 Quantification of the 7 screened GPI-anchored proteins in NCI-H838 cell membranes and exosomes

在NCI-H838細胞系外泌體15種GPI錨定蛋白中，CD55、GPC1、RECK和RTN4RL2 4種有O-糖基化修飾，其中RECK和RTN4RL2有連續(xù)O-糖基化修飾。但是同時存在于肺癌病人GPI錨定蛋白mRNA陣列數(shù)據(jù)中的只有GPC1、RECK和CD55 3種。

3 討論

腫瘤蛋白的O-糖基化修飾對腫瘤的轉(zhuǎn)移有影響[18-21]，通過相關糖基轉(zhuǎn)移酶或分子伴侶等調(diào)節(jié)O-糖基化可影響腫瘤轉(zhuǎn)移[22-24]?？赡茏鳛榉伟┰\斷標記物的7種GPI錨定蛋白中，只有GPC1和RECK有O-糖基化修飾，其中RECK具有連續(xù)O-糖基化修飾。RECK可以影響腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[25-26]，這意味著其具有作為腫瘤治療工具的潛力。有報道稱可利用RECK的小分子催化劑來抑制非小細胞肺癌的生長、發(fā)育和轉(zhuǎn)移[27]，我們的結(jié)果顯示這一結(jié)論或許也適用于其他肺癌甚至其他癌癥。GPC1可以作為外泌體標記物來進行腫瘤的早期診斷[28]。2015年，Melo及其團隊利用免疫印跡、質(zhì)譜、生物信息分析等方法，證明了GPC1陽性循環(huán)外泌體具有作為胰腺癌診斷標記物的潛力。GPC1在包括胰腺癌和乳腺癌在內(nèi)的許多癌癥中過表達[29-31]，其在肺癌病人和健康個體中表達有明顯差異，且大量存在于外泌體中。不過，本文數(shù)據(jù)表明GPC1在肺癌病人體內(nèi)的表達是下降的，具體原因尚不明確。

RECK和GPC1一樣，在肺癌病人體內(nèi)的表達量下降，另外5種在肺癌病人體內(nèi)的表達量則上升。值得注意的是，除了具有作為腫瘤診斷標記物的潛力之外，RECK、CPM和MSLN還具有作為腫瘤治療工具的可能性，其中CPM和MSLN更是被大家看好[27, 32-35]。結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)以及之前的研究，我們可以得出結(jié)論，篩選的7種GPI錨定蛋白有作為外泌體標記物來診斷癌癥的潛力。但是，由于數(shù)據(jù)來源于肺癌病人，所以是否適用于其他癌癥則需要進一步驗證。另一方面，檢測時外泌體的來源(血液、尿液等)同樣需要進一步研究。

致謝：感謝潘登提供技術(shù)支持，同時感謝北京明德正康科技有限公司和上海透景生命科技股份有限公司在質(zhì)譜分析和外泌體檢測方面的幫助。