三七皂苷R1抑制TGF-β1/Smad3信號傳導(dǎo)對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化和炎癥細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)作用研究①

高利超 徐 兵 劉永安 陳建勇 李 佳 張 巖

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院腎病內(nèi)科，瀘州 646000)

糖尿病是世界性健康問題，具有高發(fā)病率和高死亡率，可分為1型和2型糖尿病，常伴有心血管和腎衰竭等病變，約30%的1型糖尿病可發(fā)展為終末期腎病[1]。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)在臨床上以進(jìn)行性蛋白尿、高血壓和腎臟功能丟失導(dǎo)致的水腫和尿毒癥為特點(diǎn)；在組織學(xué)上，以基底膜增厚，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)累積和細(xì)胞增生引起的系膜擴(kuò)張及最終導(dǎo)致的間質(zhì)纖維化和腎小球硬化為主要特征；DN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，氧化應(yīng)激、高血糖、轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor β,TGF-β)等生長因子活化、糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生和多種信號通路的激活在腎臟損傷的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[2,3]。研究表明，TGF-β1是已知最重要的致纖維化因子，抑制TGF-β1/Smad3信號通路對糖尿病腎病大鼠具有保護(hù)作用[4]。三七皂甙R1(Notoginsenoside R1,NGR1)是傳統(tǒng)中藥三七的特征性成分，具有包括抗細(xì)胞凋亡、自噬激活、抗炎、抑制缺血再灌注損傷、清除氧自由基等在內(nèi)的多種生物學(xué)活性[5-9]。目前，關(guān)于NGR1對糖尿病腎病大鼠腎臟纖維化、炎癥反應(yīng)及與TGF-β1/Smad3信號通路的相關(guān)性研究尚無報道。本文采用高脂飼喂聯(lián)合腹腔注射鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)的方法建立DN模型，研究NGR1對模型大鼠腎臟纖維化、炎癥反應(yīng)的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物 健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(211.2±10.5)g，購自北京維通利華公司[許可證號為SCXK (京) 2014-0001，合格證號：0015675]。飼養(yǎng)溫度18～26℃，濕度40%～70%，自由采食和飲水。

1.1.2主要試劑與儀器 NGR1標(biāo)準(zhǔn)品(貨號：N3915，純度≥98%)、STZ(貨號：V900890)購自上海Sigma公司；血清肌酐、尿素氮試劑盒購自深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；HE試劑盒購自北京博奧森公司；尿蛋白、ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所；抗體購自北京Abcam公司。雅培安妥血糖儀及試紙購自美國雅培公司；酶標(biāo)儀、-80℃冰箱購自美國Thermo公司；PCR儀、電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀購自美國伯樂公司；Gel View 6000化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購自廣州云星儀器有限公司；日本奧林巴斯 BX43-32PO1顯微鏡購自日本奧林巴斯公司。

1.2方法

1.2.1模型建立與分組 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，高脂飼喂4周聯(lián)合單次腹腔注射65 mg/kg STZ建立DN模型[10]，于STZ注射72 h后，檢測大鼠空腹血糖，選擇超過200 mg/dl的大鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。當(dāng)天，取上述空腹血糖值達(dá)標(biāo)的大鼠，按血糖值將大鼠隨機(jī)分為6組：對照組(Control組)、模型組(DN組)、NGR1低中高劑量組[DN+ NGR1 (5 mg)、DN+ NGR1 (10 mg)、DN+ NGR1 (20 mg)]和陽性對照組(DN+MET)。NGR1低中高劑量組灌胃給予對應(yīng)劑量的NGR1溶液，陽性對照組給予500 mg/kg的MET溶液，對照組和模型組給予等量的生理鹽水。每天給藥1次，連續(xù)8周。

1.2.2樣本采集 給藥結(jié)束當(dāng)日晚大鼠禁食，安放代謝籠留取24 h尿液；次日稱重空腹大鼠體質(zhì)量，麻醉后行腹主動脈采血；斷頭處死大鼠后，摘取大鼠腎臟并稱重。

1.2.3檢測腎臟指數(shù)和尿蛋白、血清肌酐和尿素氮的檢測 腎臟指數(shù)(mg/g)=雙腎重量/大鼠體質(zhì)量；如1.2.2所述收集尿液2 000 r/min離心10 min，取上清檢測尿蛋白含量；取1.2.2所述血液5 ml，于4℃條件下放置30 min，1 500 r/min離心10 min，取上清檢測血清肌酐和尿素氮含量。

1.2.4腎組織病理學(xué)觀察 取1.2.2中，各組大鼠腎組織經(jīng)過10%福爾馬林固定，酒精梯度脫水，石蠟包埋后，切成4 μm片，脫蠟后行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色，脫水，透明，固定。在光學(xué)顯微鏡下觀察腎臟組織中腎小球和腎小管的病理學(xué)改變。

1.2.5血清炎癥細(xì)胞因子含量檢測 取1.2.2所述血液，4℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清，嚴(yán)格按照試劑盒操作，檢測炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ的含量。

1.2.6免疫組織化學(xué)檢測α-SMA在腎臟中的表達(dá)情況 制作各組大鼠腎臟組織切片，經(jīng)二甲苯脫蠟30 min ×2次；酒精梯度脫水(100%酒精5 min ×2；95%、85%、75%酒精各5 min)；蒸餾水漂洗1 min；3%H2O237℃下作用10 min，抑制內(nèi)源性過氧化物酶活性；用0.01% PBS沖洗5 min×3；在37℃下用蛋白酶消化30 min，用0.01% PBS沖洗5 min ×3；在37℃下用5%山羊血清孵育1.5 h。α-SMA免疫組織化學(xué)陽性判斷方法：細(xì)胞核有棕色顆粒沉著。

1.2.7RT-PCR檢測TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)水平 根據(jù)說明書，用Trizol試劑提取腎臟總RNA，并用PrimeScript試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，以β-actin為內(nèi)參。β-actin引物：5′-AGG CCA ACC GTG AAA AGA TG和ACC AGA GGC ATA CAG GGA CAA-3′；TGF-β1引物：5′-GAC TCC TGC TGC TTT CTC C和GCG GTC CAC CAT TAG CAC-3′；Smad3引物：5′-GTC AAC AAG TGG TGG CGT GTG和GCA GCA AAG GCT TCT GGG ATA A-3′。

1.2.8Western blot檢測纖維化相關(guān)蛋白和TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)水平 冰上用含蛋白酶抑制劑的裂解液裂解各組大鼠腎組織，提取總蛋白，4℃離心收集，取上清，用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法測定蛋白濃度。100℃變性10 min，每組取等量蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉蛋白質(zhì)2 h，加入一抗(1∶500)于4℃孵育過夜。棄去一抗，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的對應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫孵育2 h。滴加ECL發(fā)光液于暗室曝光顯影，以GAPDH為內(nèi)參。根據(jù)條帶灰度值計算相對蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1NGR1對DN大鼠一般情況的影響 對照組大鼠精神狀態(tài)良好，活潑好動；模型組大鼠隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行，出現(xiàn)多飲、多尿、多食和體質(zhì)量下降的“三多一少”糖尿病典型特征，且精神狀態(tài)、皮毛光澤和運(yùn)動靈敏性也欠佳；而各治療組大鼠上述指標(biāo)均較模型組有不同程度改善。

2.2NGR1對DN大鼠腎臟功能的影響 各組大鼠腎臟指數(shù)、尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平結(jié)果如圖1 所示：與對照組相比，模型組大鼠腎臟指數(shù)、蛋白尿、血清肌酐和尿素氮水平均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，證明DN大鼠模型造模成功；與模型組相比，NGR1劑量組和陽性對照組大鼠上述指標(biāo)均有不同程度的下降，NGR1低劑量組無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組大鼠上述指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.3NGR1對DN大鼠腎臟病理學(xué)改變的影響 對各組大鼠腎組織切片進(jìn)行HE染色，結(jié)果如圖2所示，鏡下可見對照組大鼠腎組織腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，未見系膜細(xì)胞增生，細(xì)胞胞漿豐富，排列緊密；模型組大鼠腎組織可見腎小球肥大，系膜基質(zhì)增多，腎小管腫脹、空泡變性和炎癥浸潤等病理學(xué)改變；NGR1低劑量組病理學(xué)改變與模型組相似，但NGR1中高劑量組和陽性對照組可見明顯的病理學(xué)改變。

2.4NGR1對DN大鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響 ELISA檢測各組大鼠炎癥細(xì)胞因子含量水平，結(jié)果如圖3所示：與對照組相比，模型組大鼠高表達(dá)TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ(P<0.01)，各NGR1治療組大鼠上述炎癥細(xì)胞因子表達(dá)均有不同程度的降低，而NGR1低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組上述指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

2.5NGR1對DN大鼠腎臟纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響 Western blot檢測各組大鼠腎臟纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平，結(jié)果如圖4A所示：與對照組相比，模型組大鼠高表達(dá)CollagenⅣ、FN和TIMP-1蛋白，低表達(dá)MMP-9蛋白(P<0.01)，各NGR1治療組大鼠上述纖維化指標(biāo)蛋白表達(dá)均有不同程度的逆向改變，而NGR1低劑量組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，NGR1中、高劑量組和陽性對照組上述指標(biāo)存在統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

圖1 NGR1對DN大鼠腎臟功能的影響Fig.1 Effects of NGR1 on renal function in DN ratsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖2 NGR1對DN大鼠腎臟病理學(xué)改變影響(×400)Fig.2 Effects of NGR1 on renal pathological changes in DN rats(×400)

圖3 NGR1對DN大鼠炎癥細(xì)胞因子表達(dá)水平的影響Fig.3 Effects of NGR1 on expression of inflammatory cytokines in DN ratsNote: Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05，##.P<0.01.

圖4 NGR1對DN大鼠腎臟纖維化相關(guān)蛋白表達(dá)水平的影響(×400)Fig.4 Effects of NGR1 on expression of fibrosis-related proteins in kidneys of DN rats(×400)Note: A.Protein expression level of Collagen Ⅳ,FN,MMP-9 and TIMP-1 detected by Western blot;B.Expression level of α-SMA detected by immunohistochemical.Compared with the control group，**.P<0.01;compared with DN group，#.P<0.05；##.P<0.01.

圖5 NGR1對DN大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)的影響Fig.5 Effects of NGR1 on expression of TGF-β1/Smad3 signaling pathway in DN ratsNote: A.Expression level of TGF-β1 and Smad3 detected by RT-PCR;B.Protein expression level of TGF-β1 and Smad3 detected by Western blot.Compared with the control group，**.P<0.01；compared with DN group，#.P<0.05,##.P<0.01.

免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測各組大鼠腎臟纖維化標(biāo)記蛋白α-SMA表達(dá)水平，結(jié)果如圖4B所示：對照組大鼠腎臟組織基本未見α-SMA表達(dá)，而模型組大鼠可見腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)有大量α-SMA表達(dá)，NGR1低劑量組大鼠腎臟內(nèi)α-SMA表達(dá)水平與模型組程度相當(dāng)，NGR1中高劑量組和陽性對照組大鼠腎臟內(nèi)α-SMA表達(dá)水平較模型組大鼠明顯降低。

2.6NGR1對DN大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)的影響 RT-PCR檢測各組大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)情況，結(jié)果如圖5A所示：與對照組相比，模型組大鼠TGF-β1和Smad3的mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)，NGR1中高劑量組和陽性對照組TGF-β1和Smad3的mRNA表達(dá)水平較模型組均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。Western blot各組大鼠TGF-β1/Smad3信號通路表達(dá)情況，結(jié)果如圖5B所示：與對照組相比，模型組大鼠TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.01)，NGR1中高劑量組和陽性對照組TGF-β1和Smad3蛋白表達(dá)水平較模型組差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

3 討論

DN是一種嚴(yán)重的糖尿病微血管并發(fā)癥，發(fā)病不易被察覺，出現(xiàn)臨床癥狀時往往已發(fā)展成嚴(yán)重的終末腎衰竭；DN前期主要病理變化表現(xiàn)為腎小球過濾增加，并伴隨腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化及系膜增生等病理改變；臨床以持續(xù)的蛋白尿和腎功能進(jìn)行性下降為主要表現(xiàn)[11]。本文通過連續(xù)飼喂高脂飼料4周后，單次大劑量腹腔注射STZ的方法建立DN大鼠模型，之后給予NGR1連續(xù)治療8周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠表現(xiàn)出典型的“三多一少”癥狀、腎臟肥大指數(shù)和腎臟功能評價常用指標(biāo)(尿蛋白、血清肌酸酐和尿素氮)明顯上升，符合DN發(fā)展進(jìn)程表現(xiàn)，證明本文成功復(fù)制DN大鼠模型；NGR1中高劑量組(10、20 mg/kg)和陽性對照組(MET,500 mg/kg)大鼠上述指標(biāo)較模型組大鼠均有明顯的降低，且差異存在統(tǒng)計學(xué)意義，提示 20 mg/kg的NGR1可有效改善DN大鼠的腎臟功能。對大鼠腎臟組織進(jìn)行HE染色也進(jìn)一步證明建模方法的可靠性及NGR1治療對DN大鼠腎臟微結(jié)構(gòu)損傷的改善作用。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，20 mg/kg的NGR1治療能有效改善DN大鼠腎臟功能及微結(jié)構(gòu)病理損傷。

近年來的研究表明，炎癥在包括DN在內(nèi)的多種疾病中發(fā)揮著重要作用，通過破壞促炎-抗炎動態(tài)平衡可推進(jìn)疾病進(jìn)程[12，13]。研究表明，NGR1通過抑制炎癥反應(yīng)和腎臟足細(xì)胞凋亡，有效改善了DN大鼠的腎臟缺血再灌注損傷[8,9]。本文研究發(fā)現(xiàn)，NGR1中高劑量組(10、20 mg/kg)大鼠炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IL-1β和IFN-γ)血清水平明顯下調(diào)。證明足夠劑量的NGR1治療能通過降低炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，減輕炎癥損傷，進(jìn)而維持腎臟基本的微結(jié)構(gòu)完整性，實(shí)現(xiàn)對DN大鼠腎臟功能和病理損傷的改善作用。Lin等[14]研究也發(fā)現(xiàn)，DN大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IFN-γ含量均明顯升高，與本研究結(jié)果相似。

腎臟纖維化是導(dǎo)致終末腎病的主要病理學(xué)基礎(chǔ)，同時也是多種病因?qū)е碌穆阅I臟疾病進(jìn)行性發(fā)展的共同通路，TGF-β1是重要的致纖維化因子，在腎臟組織中通常由腎小球系膜細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞分泌，而Smads蛋白是目前認(rèn)為的TGF-β1受體唯一的激酶底物，介導(dǎo)其下游胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)腎臟細(xì)胞肥大、增加ECM沉積、促進(jìn)腎小球基底膜增厚等，并促進(jìn)腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化的發(fā)生[15-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，在DN模型大鼠腎臟組織中，纖維化和ECM相關(guān)蛋白(CollagenⅣ、FN、MMP-9和TIMP-1)的表達(dá)水平均受到NGR1的有效調(diào)節(jié)，證明NGR1治療能有效降低DN大鼠腎臟組織ECM沉積和纖維化發(fā)生。α-SMA在腎小管上皮細(xì)胞中的表達(dá)程度與腎小管纖維化程度呈正相關(guān)，被認(rèn)為是評估腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化及間質(zhì)纖維化的重要指標(biāo)；在糖尿病小鼠中，抑制TGF-β1、CollagenⅣ和FN表達(dá)，可預(yù)防腎小球硬化和間質(zhì)纖維化發(fā)生；另外，MMPs能促進(jìn)ECM降解，其中MMP-9與腎臟纖維化關(guān)系密切，基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)則可抑制MMPs活性，以維持ECM沉積和降解之間的平衡[18-20]。為進(jìn)一步證明NGR1抑制ECM沉積和纖維化作用與TGF-β1/Smad3信號通路活化的相關(guān)性，檢測TGF-β1、Smad3的mRNA和蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：NGR1治療DN大鼠后，該通路在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均受到抑制。綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，NGR1對DN大鼠的腎臟損傷保護(hù)作用可能與抑制TGF-β1/Smad3信號通路活化相關(guān)，但是否還有其他信號通路的參與有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本文發(fā)現(xiàn)NGR1能降低糖尿病腎病模型大鼠的腎臟肥大指數(shù)和腎臟功能損傷指標(biāo)，改善腎臟微結(jié)構(gòu)改變，抑制炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，調(diào)節(jié)ECM相關(guān)基因及信號通路表達(dá)水平，從而起到對DN大鼠的腎臟保護(hù)作用。本文旨在為DN的治療提供參考。