上調(diào)TAM受體對實驗性腦脊髓膜炎Th細(xì)胞作用的研究①

李曉玲 張 博 張亞嵐 劉 會 孫夢嬌 王滿俠

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，蘭州 730030)

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎性脫髓鞘疾病，一種自身具有易緩解、復(fù)發(fā)的臨床特點，女性的發(fā)病率高于男性，是引起青壯年神經(jīng)功能障礙最主要的神經(jīng)系統(tǒng)疾病[1,2]。實驗性變態(tài)反應(yīng)性腦脊髓膜炎模型(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是目前公認(rèn)的MS的理想動物模型，能較好地模擬人類MS的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸過程[3]。Tyro3、Axl和Mer受體酪氨酸激酶簡稱 TAM受體，屬于受體酪氨酸激酶亞家族，是Tyro3、Axl和Mer基因表達(dá)的產(chǎn)物。具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖和介導(dǎo)細(xì)胞黏附、遷移 、吞噬、凋亡等多種生物學(xué)功能[4]。TAM受體是單次跨膜蛋白，由神經(jīng)細(xì)胞黏附分子的胞外配體結(jié)合域、跨膜區(qū)和有酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的胞內(nèi)區(qū)組成，所以該家族受體既有黏附分子的特點，又有酪氨酸激酶的活性。TAM受體共同的配體是S蛋白(ProS)和生長停滯特異性基因6(growth arrest specific 6，Gas6)[5]。在表達(dá)TAM受體的細(xì)胞中，可以通過磷酸肌醇3-激酶PI3K/AKT和JAK/STAT通路促進(jìn)細(xì)胞存活和增殖，同時抑制炎癥的發(fā)展[6]。本實驗采用EAE模型予以雷帕霉素(rapamycin，Rap)腹腔注射，上調(diào)TAM受體，觀察淋巴細(xì)胞相關(guān)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步探討其在MS發(fā)生、發(fā)展過程中的免疫保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級C57BL/6小鼠36只，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量16～18 g，購自甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物研究中心，飼養(yǎng)于甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗室(甘肅 蘭州)。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對照組、EAE模型組、雷帕霉素組，每組12只。已通過蘭州大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會審核。

1.1.2儀器與試劑 VORTEX-6型旋渦混合器購自吉林貝爾儀器公司；D1008型小型低速離心機(jī)購自北京大龍公司；Light Cycler96 型RT-PCT儀購自Roche；MOG35-55購自CS Bio公司；完全弗氏佐劑購自Chondrex公司；雷帕霉素購自Lc labaratories；結(jié)核菌素H37Ra購自DIFCO公司；百日咳毒素購自LBL公司；RT-PCR所需Trizol試劑、All-in-One-qPCR Mix、All-in-one qPCR Primer均購自Fulengen公司；IL-17、IFN-酶聯(lián)免疫試劑盒購自Neobio公司。

1.2方法

1.2.1EAE模型制備 0.9%的生理鹽水將MOG35-55稀釋至10 mg/ml，加入等體積的完全弗氏佐劑和等量的結(jié)核菌素H37Ra，使結(jié)核桿菌H37Ra的濃度為4 mg/ml，用注射器抽吸成油包水狀，制成誘導(dǎo)抗原乳劑。于小鼠脊柱兩旁分4點皮下注射0.1 ml乳劑，之后分別在免疫當(dāng)天及48 h分兩次腹腔注射百日咳毒素0.5 ml作為免疫增強(qiáng)劑。

1.2.2雷帕霉素組模型制備 從EAE模型誘導(dǎo)的第10天開始，每日一次，給予雷帕霉素(2 mg/kg)連續(xù)腹腔注射10 d。

1.2.3數(shù)據(jù)采集 從免疫后第1天開始，采用雙盲法由2名觀察者每天稱量小鼠體質(zhì)量，采用國際通用的5分評分制對小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分：無任何癥狀；1分：尾部張力消失，可見輕度步態(tài)笨拙；2分:一側(cè)后下肢無力，被動翻身后可以恢復(fù)；3分：雙后肢癱瘓，被動翻身后不能恢復(fù)，但給予刺激后可以挪動；4分：雙后肢癱瘓伴前肢癱瘓；5分：瀕死狀態(tài)或死亡。

1.2.4RT-PCR(real-time reverse transcription) 三組小鼠分別于后免疫第7天、14天、21天、30天取腦室旁腦組織標(biāo)本，無菌操作，70 mg腦組織加入1 ml Trizol試劑，提取總RNA。合成cDNA，PCR 擴(kuò)增建立,建立20 μl反應(yīng)體系：2×All-in-One qPCR Mix 10 μl,不同濃度的模板cDNA 2 μl,All-in-One qPCR Primer 2 μl,滅菌蒸餾水補至20 μl。反應(yīng)條件：95℃10 min個循環(huán)，95℃10 s，60℃20 s，72℃15 s，40個循環(huán)。

1.2.5酶聯(lián)免疫法 EAE組小鼠分別于后免疫第7天、14天、21天、30天心臟取血，分離血清，酶聯(lián)免疫法測定IL-17、IFN-γ含量。具體方法參照試劑盒說明書。

2 結(jié)果

2.1小鼠臨床癥狀評分與體質(zhì)量變化 EAE組小鼠平均發(fā)病時間為(7.7±0.67)d，21 d時達(dá)高峰。發(fā)病時食欲下降，體質(zhì)量減輕，皮毛不光滑，伴有神經(jīng)功能缺損癥狀，起病時尾部張力下降，身體向一側(cè)傾倒，雙側(cè)后肢無力，逐漸前肢無力，嚴(yán)重時死亡。EAE組小鼠14 d神經(jīng)功能評分為(2.10±1.58)分，21 d神經(jīng)功能評分為(2.93±1.43)分，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，圖1)。EAE組小鼠14 d體質(zhì)量(16.28±0.23)g，21 d時體質(zhì)量(15.96±0.45)g,30 d 時體質(zhì)量為(18.28±0.41)g。14 d組與21 d組和30 d相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。正常對照組與EAE組相比，在15 d、21 d、30 d，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖1 EAE組小鼠神經(jīng)功能評分變化趨勢圖 Fig.1 Changes of neurological function scores in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) group

圖2 正常對照組、EAE組體質(zhì)量變化趨勢圖Fig.2 Weight between control group and EAE group

TimeIFN-γIL-1714 d275.29±37.42227.12±17.3721 d 344.78±24.111)301.07±10.182)30 d134.99±7.99162.07±17.19t2.411.93P0.000.35

Note:1)P<0.01 vs 14 d;2)P<0.05 vs 14 d.

圖3 IFN-γ、IL-17在21 d時雷帕霉素組與EAE組相比Fig.3 Level of IFN-γ and IL-17 between EAE and rapamycin group at 21 dNote: **.P<0.01.

2.2IL-17、IFN-γ的檢測結(jié)果(表1) ELISA試劑盒檢測IL-17、IFN-γ的表達(dá)。EAE組血清中IL-17 21 d濃度明顯高于14 d和30 d濃度，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。IFN-γ濃度在21 d時最高，與14 d和30 d組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。雷帕霉素組21 d時的IFN-γ、IL-17與EAE組比較均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖3)。

圖4 EAE組Tyro3、Mer、Axl的RT-PCR結(jié)果Fig.4 Expression of Tyro3，Mer，Axl by RT-PCR in EAE groupNote: *.P<0.05,**.P<0.01, ***.P<0.001.

圖5 TAM在21 d時雷帕霉素組與EAE組比較Fig.5 Expression of TAM between the EAE and rapamycin group at 21 dNote: **.P<0.01,***.P<0.001.

2.3EAE組TAM受體RT-PCR結(jié)果 Tyro3的表達(dá)較正常對照組在14 d時略有下降，21 d時升高，30 d時達(dá)到最高，較正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A)。Mer的表達(dá)逐漸升高，在30 d時達(dá)到最高，較正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4B)。Axl的表達(dá)在14 d、21 d時均較對照組下降，在30 d時有明顯的升高，較正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C)。

2.4雷帕霉素組RT-PCR結(jié)果 第21天時雷帕霉素組Tyro3、Axl、Mer均較同一時間點EAE組升高，兩組相比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖5)。

2.5相關(guān)性分析 21 d時EAE組Tyro3、Axl、Mer的mRNA水平與小鼠神經(jīng)功能評分負(fù)相關(guān)(r=-0.648,P=0.013,r=-0.325,P=0.024,r=-0.381,P=0.020)。

3 討論

MS是一種細(xì)胞免疫和體液免疫共同參與導(dǎo)致的以腦和脊髓白質(zhì)損傷為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，脫髓鞘是其發(fā)病過程中關(guān)鍵的病理表現(xiàn)，其發(fā)病機(jī)制涉及多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的異常，其中主要包括激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子(janus kinase/signal transducer and activator of transcription,JAK/STAT)、NF-κB、p38MAPK、IL-2/IL-2R通路等[7-9]。TAM受體在神經(jīng)系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制中的研究尚不多見,尤其是在MS中的研究[10]。TAM受體屬于受體酪氨酸激酶亞家族之一，廣泛地表達(dá)于哺乳動物免疫、血液、生殖和神經(jīng)系統(tǒng)的多種細(xì)胞中[11]。共同的配體是Gas6和ProS[12-15]。MS是一種脫髓鞘性自身免疫病，在Axl或Gas6小鼠飲食中添加cuprizone，神經(jīng)脫髓鞘癥狀明顯加重，且恢復(fù)期凋亡細(xì)胞的清除和髓鞘再生都延遲[16]。因此，TAM受體與MS的炎性脫髓鞘密切相關(guān)。在本研究建立的EAE模型中，根據(jù)RT-PCR的結(jié)果可以看到Tyro3、Mer的表達(dá)逐漸升高，在30 d時達(dá)到最高，較正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。Axl的表達(dá)在14 d、21 d 時均較對照組下降，在30 d時有明顯的升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。EAE組21 d時神經(jīng)功能癥狀最重，體質(zhì)量變化明顯，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。由此可見，21 d時Tyro3、Axl、Mer的mRNA水平與小鼠神經(jīng)功能呈負(fù)相關(guān),在EAE的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要的作用。基因敲除的Tyro3-/-Axl-/-Mer-/-小鼠(TAM小鼠)容易患有自身免疫性疾病，TAM受體可以調(diào)控天然免疫，下調(diào)促炎因子INF-ɑ介導(dǎo)的JAK/STAT1信號通路，從而抑制天然免疫[17]。本研究發(fā)現(xiàn)EAE模型小鼠被MOG35-55免疫后，Tyro3、Axl、Mer的水平均開始上調(diào)，而IL-17、IFN-γ在21 d時達(dá)到最高，之后逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。這說明在MS的發(fā)病機(jī)制中TAM受體通過抑制天然免疫發(fā)揮了免疫保護(hù)作用,抑制了脫髓鞘的發(fā)生。

雷帕霉素(Rap)是從吸水鏈霉菌中分離出來的一種新的大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑[18]。近年的研究發(fā)現(xiàn)它有一定的神經(jīng)保護(hù)、神經(jīng)營養(yǎng)及抗衰老作用[19]。它作為經(jīng)典的自噬誘導(dǎo)劑，同時也是針對哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)特異性的抑制劑，在EAE模型中的研究比較多見[20]。大部分研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可抑制 AKT/niTOR/P70s6k通路激活自噬活性發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21，22]。本研究在免疫后第10天開始予以雷帕霉素治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與EAE組比較雷帕霉素組腦室旁腦組織中Tyro3、Axl、Mer的表達(dá)水平均上調(diào)。這說明在EAE模型上予以雷帕霉素治療可以上調(diào)TAM受體的表達(dá)，尤其是Axl水平，其發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)髓鞘的再生。TAM受體通過INF-α受體相互作用，激活JAK/STAT信號通路，誘導(dǎo)SOCS1和 SOCS3產(chǎn)生，抑制炎癥發(fā)展[23]。IFN-γ由Th1細(xì)胞分泌，IL-17則是由Th17細(xì)胞分泌的炎癥因子[24，25]。Th1 細(xì)胞通過分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-12 等細(xì)胞因子引起髓鞘的破壞[26，27]。Th17細(xì)胞功能亢進(jìn)，分泌的炎癥因子IL-17、IL-23、IL-21等起到促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用[28]。通過比較可見雷帕霉素也可以抑制Th1細(xì)胞的活化以及Th17細(xì)胞功能的亢進(jìn)，減輕髓鞘的破壞，更好地發(fā)揮免疫抑制作用，調(diào)控MS發(fā)病機(jī)制中的天然免疫，明顯促進(jìn)EAE小鼠神經(jīng)功能癥狀的恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn)TAM受體的上調(diào)可以在EAE小鼠腦組織的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮免疫抑制作用，促進(jìn)髓鞘修復(fù)。同時雷帕霉素可以進(jìn)一步通過促進(jìn)Tyro3、Axl、Mer的表達(dá)，抑制EAE小鼠的炎性脫髓鞘，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。本研究進(jìn)一步探討了雷帕霉素的新的作用機(jī)制，為其在MS免疫調(diào)節(jié)治療提供研究基礎(chǔ)。