三種不同劑型四君子制劑對脾氣虛證大鼠血清SOD活性和MDA含量影響及以方測證研究*

孫豪嫻，孫貴香，鄧琳蓉，張 婷，肖 丹，厲佳俊

湖南中醫(yī)藥大學(xué)(長沙 410208)

顆粒劑膏是現(xiàn)在臨床上運(yùn)用最新的制藥技術(shù)出現(xiàn)的一種新型膏劑，區(qū)別于傳統(tǒng)湯劑與傳統(tǒng)膏劑，顆粒劑膏不僅具備了膏滋的緩補(bǔ)作用，還結(jié)合了顆粒劑藥物口感好、煎煮方便等優(yōu)點(diǎn)。但對于顆粒劑膏與傳統(tǒng)膏、傳統(tǒng)飲片湯劑之間的療效是否存在差異目前還未見詳細(xì)研究報(bào)道。因此，本研究從四君子湯、傳統(tǒng)四君子膏、顆粒四君子膏出發(fā)，以脾氣虛證模型大鼠為研究對象，主要從大鼠體重、肛溫、血清SOD活性水平、MDA水平等方面對比三組不同四君子制劑之間的作用差別，旨在對顆粒劑膏的療效進(jìn)行評估，為顆粒劑膏能否運(yùn)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級SD大鼠(180±20g)共50只，雌雄各半，體重(200±20)g，購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)，合格證號：SYXK(湘)2013-0005。飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)溫度控制在20～22℃，相對濕度維持在50%～60%。所用飼料和墊料均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 試藥：大鼠超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒(Andygene biotechnology公司)；大黃制劑液，四君子湯，成品顆粒劑四君子膏、傳統(tǒng)四君子膏均按照四君子湯比例由深圳華潤三九醫(yī)藥有限公司制造提供。

1.3 儀器：JE1002電子天平(精密度：0.01 g)、WMY-01數(shù)字溫度計(jì)、低溫高速離心機(jī)、EL34oi型全自動(dòng)酶標(biāo)儀、微量式移液器、室內(nèi)游泳槽、冰箱等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組：將50只大鼠依次編號，采用國際上通用的編號表計(jì)，隨機(jī)分為5組，即正常組、模型組、四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組，每組均10只大鼠。

2.2 藥液制備：傳統(tǒng)四君子膏、顆粒四君子膏藥液：參照《人與動(dòng)物用藥量換算表》，按照體表面積折算等效劑量。四君子膏服用方法為成人2次/d，每次一調(diào)匙(約30 g)，則體重200 g的大鼠每日服用約1.16 g四君子膏。按照該劑量將傳統(tǒng)四君子膏劑、顆粒劑四君子膏劑加純凈蒸餾水稀釋配制灌胃藥液。四君子湯組藥液：以《太平惠民和劑局方》為依據(jù)：人參、茯苓、白術(shù)(炒)各9 g，甘草(炙)6 g，組方成藥，煎煮兩次，同樣依據(jù)以上換算法濃縮配制藥液。大黃制劑液：以成人每日服用大黃量為6 g換算，濃縮制備藥液。

2.3 造模：采用飲食失節(jié)、耗氣破氣、勞倦過度法復(fù)制脾氣虛證大鼠模型[1]。飲食失節(jié)：正常組大鼠每日正常飲水、進(jìn)食及活動(dòng)，其余四組大鼠隔日進(jìn)食，自由飲水；耗氣破氣：于每天上午9點(diǎn)給予正常組大鼠灌胃0.9%的Nacl，余四組予大黃制劑液灌胃；勞倦過度：除正常組外其他組大鼠每日下午15點(diǎn)負(fù)重10%，于水深50 cm，水溫(22±2)℃的室內(nèi)游泳槽中游泳，以力竭為度(大鼠鼻尖沒入水面10 s)。

2.4 給藥：采取邊造模邊給藥的方法，于每日下午16點(diǎn)，四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組分別予以各組制備藥液，正常組、模型組則予以等量0.9%的Nacl溶液。連續(xù)28 d。

2.5 觀察指標(biāo)：①實(shí)驗(yàn)全程觀測動(dòng)物的毛色、精神狀態(tài)、糞便情況、游泳時(shí)間、食物量、飲食量等變化，比較各組間癥狀與體征的區(qū)別。②大鼠體重與肛溫的測定：每兩天稱量一次各組大鼠的體重，并且對各組大鼠的肛溫進(jìn)行測量，并記錄數(shù)據(jù)。③大鼠血清SOD、MDA水平測定：造模給藥結(jié)束后次日，各組大鼠稱重后水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，放置凝后于低溫下以3000 r/min的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心15 min，采用ELISA法測大鼠血清中SOD活性和MDA含量，測量方法按照試劑盒的說明書進(jìn)行。

結(jié) 果

1 一般情況 正常組大鼠飲食、飲水正常，毛發(fā)有光澤，活動(dòng)較多，反應(yīng)靈敏；模型組大鼠于第4、5天開始排泄不成形大便，第9、10天開始出現(xiàn)拉尾排便，且排便次數(shù)增多，食量、飲水量減少，后出現(xiàn)扎堆、蜷縮，反應(yīng)較遲鈍，毛發(fā)無光澤，隨著時(shí)間的推移，力竭游泳的時(shí)間逐漸縮短；四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組大鼠一般情況表現(xiàn)接近正常組。

2 對大鼠體重、肛溫的影響 造模前，大鼠的體重與肛溫組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。造模后，與正常組相比，其余四組大鼠的體重與肛溫都有所下降 (P<0.05)。與模型組相比，四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組大鼠的體重及肛溫均有所升高 (P<0.05)。三組四君子制劑組間比較提示，四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組三組大鼠的肛溫與體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1、表2。

表1 各組大鼠造模前后體重變化(g)

表2 各組大鼠造模前后肛溫變化(℃)

3 對血清SOD活性和MDA含量的影響 與正常組相比，模型組大鼠的SOD活性水平降低，MDA水平升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與模型組相比，四君子湯、傳統(tǒng)四君子膏、顆粒四君子膏組大鼠血清SOD活力均有所提高(P<0.05)，血清MDA濃度均低于模型組(P<0.05)；三組四君子制劑組間相互比較，四君子湯組、傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組，三組大鼠之間的SOD活性水平、MDA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠SOD活性水平、MDA水平的比較

注：與正常組比較,*P<0.05；與模型組比較,△P<0.05；與四君子湯組比較,▲P<0.05；與傳統(tǒng)四君子膏組比較,□P<0.05

討 論

縱觀脾氣虛證的造模方法，目前運(yùn)用的形式多樣化，有耗氣破氣法、飲食失節(jié)法、勞倦過度法、利血平法等，但大部分造模方法存在穩(wěn)定性較差、恢復(fù)較快等問題[1]。諸多學(xué)者研究表明，多因素復(fù)合建立起的動(dòng)物模型具有良好的穩(wěn)定性[2]。因此，本實(shí)驗(yàn)參考中醫(yī)理論中致病因素的內(nèi)容，采取飲食失節(jié)加耗氣破氣加勞倦過度法的方法復(fù)制脾氣虛證大鼠模型。造模后，模型組大鼠相繼出現(xiàn)食少納差、便溏倦怠、神疲遲鈍等脾氣虛證的表現(xiàn)，同時(shí)其反應(yīng)細(xì)胞損傷程度的指標(biāo)MDA的含量，及能夠還原過氧化物，保護(hù)細(xì)胞不受自由基損傷的指標(biāo)SOD的活性水平[3-4]較正常組存在明顯改變，提示脾氣虛證大鼠存在氧化損傷，其組織細(xì)胞清除氧自由基的能力下降。

四君子湯出自于宋代的《太平惠民和劑局方》，全方由人參、白術(shù)、茯苓、甘草四藥組成，方中人參甘溫，補(bǔ)元?dú)?，益中氣，白術(shù)溫脾燥濕，茯苓淡滲，健脾除濕，甘草益胃和中，調(diào)和諸藥[5-6]。因選藥平和，方中均為中和之品，故名曰君子[7]，該方具有益氣健脾的功效，是治療脾氣虛證的基礎(chǔ)方[8-9]。對比模型組，四君子湯組大鼠在灌胃四君子湯后其飲食、大便、精神狀態(tài)得到明顯改善，其血清中的SOD活性水平增高，MDA含量減少，說明四君子湯能夠增加大鼠的活性氧清除機(jī)制，緩解氧自由基的損害，對造模后的大鼠具有治療性作用。本實(shí)驗(yàn)建立的大鼠模型符合脾氣虛證模型。證明運(yùn)用飲食失節(jié)、耗氣破氣、勞倦過度法的方法復(fù)合建立脾氣虛證大鼠模型符合中醫(yī)理論，與相應(yīng)的中醫(yī)證候一致，并經(jīng)得起藥物反證，說明該造模方法是切實(shí)可行的。

中藥顆粒劑的應(yīng)用始于20世紀(jì)70年代，隨著制備技術(shù)的不斷提高和制備工藝的不斷完善，顆粒劑在臨床上的使用頻率也越來越高[10]。何佳奇等[11]對2012年至2016年在浙江省有中藥配方顆粒生產(chǎn)銷售的企業(yè)和使用中藥配方顆粒的醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)2012年至2016年5年，中藥配方顆粒在浙江省醫(yī)療機(jī)構(gòu)的銷售額呈逐年遞增趨，該結(jié)果提示配方顆粒在臨床上的使用頻率也逐年增長。沈光輝等[12]對重慶市某社區(qū)醫(yī)院2015年1月至2017年8月中藥配方顆粒和小包裝飲片臨床消費(fèi)情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)中藥配方顆粒在該院門診部處方和金額中的占比在逐年遞增，得出中藥配方顆粒已逐漸被大眾接受和認(rèn)可的結(jié)論。不僅如此，顆粒劑既具備傳統(tǒng)湯劑吸收快、作用迅速的特點(diǎn)，又克服了傳統(tǒng)湯劑煎煮不便、服用量大、易霉變等不足[13]，在臨床上藥材劑型選擇中扮演著越來越重要的角色。

膏劑是一種將飲片藥物用水再三煎煮，去滓濃縮后加蜂蜜或冰糖收膏制成的呈半流體狀的劑型，是中醫(yī)常用八大劑型中的重要組成部分[14]。《山海經(jīng)》言其：“言味好皆滑為膏，如指內(nèi)容，以為物之精粹，如指作用，以滋養(yǎng)膏潤為長”，近代名醫(yī)秦伯未云膏方：“蓋煎熬藥汁成脂溢而所以營養(yǎng)五臟六腑之枯燥虛弱者”[15]，指出了膏劑的緩慢滋養(yǎng)作用，長期服用，不僅可以療病祛疾，還具有補(bǔ)益虛羸、改善體質(zhì)等作用。

顆粒四君子膏是由參苓術(shù)草這四味主藥按照一定的比例煉制而成。在制作上，對比傳統(tǒng)飲片膏，顆粒四君子膏的制作原料選用配方顆粒，制作主要包含溶解、濃縮、收膏三大步驟，省去了傳統(tǒng)膏劑制作前期浸泡、一煎、二煎、過篩等繁瑣的工藝，節(jié)約了人力物力[16]。在功效上，傳統(tǒng)四君子膏組、顆粒四君子膏組大鼠的體重、肛溫、血清SOD活性水平、MDA含量較模型組均有變化，說明四君子膏在對脾氣虛證大鼠的情況改善上存在較好的療效，進(jìn)一步驗(yàn)證了其益氣健脾的作用。組間比較發(fā)現(xiàn)，在體重和肛溫上，兩組的均值都低于正常組，且顆粒四君子膏組與四君子湯組大鼠的體重與肛溫值較接近，稍高于傳統(tǒng)四君子膏組，但組間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明傳統(tǒng)四君子膏與顆粒四君子膏在對大鼠體重和肛溫的影響上效應(yīng)相同。對比組間血清SOD活性和MDA的含量，兩者均較模型組存在差異，提示四君子膏可以提高脾氣虛證模型大鼠的SOD活力，降低MDA濃度。雖然二者在數(shù)值上存在上下小幅度的偏差，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明傳統(tǒng)四君子膏與顆粒四君子膏在對大鼠血清SOD活性和MDA的含量的影響上效應(yīng)相同。提示在一定程度上傳統(tǒng)四君子膏與顆粒四君子膏均可抑制大鼠體內(nèi)細(xì)胞的過氧化反應(yīng)，保護(hù)其不受氧自由基的損傷。

綜上可知，傳統(tǒng)四君子膏與顆粒四君子膏均有較好的益氣健脾的作用，對于脾氣虛證的治療具有較好的效果，且兩者在療效上無明顯差異，與四君子湯的效果相比也無明顯區(qū)別。因此在臨床處方劑型上，我們可以根據(jù)患者自身的疾病及需求情況，考慮是否選擇膏劑對其進(jìn)行治療；在膏劑的制作上，我們亦可以結(jié)合患者的顧慮喜好，考慮是否選擇顆粒劑來進(jìn)行膏劑的制備。醫(yī)者不僅需要做到“用藥如用兵”，還需要針對患者的具體的情況選用不同的中藥制劑，以充分發(fā)揮各自的優(yōu)勢，取得理想的療效。