基于比濁法的桿菌肽定量測(cè)定方法優(yōu)化

王志新 劉洋 周景波 宏丹 魯雷震 寧亞維 賈英民

（1. 河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院 河北省發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，石家莊 050018；2. 北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，

北京 100048）

抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP），是一種普遍存在于動(dòng)植物及微生物體內(nèi)的具有抗菌生物活性的小分子多肽類物質(zhì)的總稱［1］。相關(guān)研究表明，抗菌肽的抗菌機(jī)制和抗生素的不同，相較于抗生素而言，其不易產(chǎn)生耐藥性，且抗細(xì)菌、真菌病毒以及腫瘤［2］。近幾年，關(guān)于抗菌肽作為抗生素理想替代品的研究引發(fā)了學(xué)者們的極大興趣［3］。

抗菌肽種類多樣，常見的有植物防御素、天蠶素、桿菌肽、乳酸鏈球菌素、多黏菌素B 等［4］，桿菌肽是其中較為重要的一種。桿菌肽（Bacitracin）是由地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌等微生物通過發(fā)酵合成的短肽類抗菌素，可有效抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和部分革蘭氏陰性菌，具有抗菌譜廣的特點(diǎn)［5］。1943年，美國(guó)哥倫比亞大學(xué)研究人員首次從患者的脛骨創(chuàng)傷污染物中分離得到產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的地衣芽孢桿菌，并經(jīng)發(fā)酵獲得了桿菌肽的成品［6］。1960 年，美國(guó)批準(zhǔn)將桿菌肽作為飼料添加劑，這使得桿菌肽的開發(fā)和應(yīng)用得到了快速發(fā)展［7］。隨著科學(xué)的不斷進(jìn)步，人們對(duì)桿菌肽特性的了解也越來(lái)越深入，桿菌肽的應(yīng)用必將會(huì)隨著研究的不斷深入而更加廣泛［8］。國(guó)外桿菌肽定量測(cè)定方法常采用微生物檢定法，如管碟法、濁度法以及高效液相色譜定量測(cè)定法［9-10］， 且這些方法均已被國(guó)際藥典和各國(guó)藥典收錄［11-13］。國(guó)內(nèi)常用的方法參考藥典，有管碟法、濁度法 等［14-15］，但是藥典中沒有對(duì)試驗(yàn)菌的初始濃度和培養(yǎng)時(shí)間等因素的具體規(guī)定［16］。因此，如何準(zhǔn)確的測(cè)定桿菌肽的抗菌活性就成為了一個(gè)有待解決的問題。

長(zhǎng)期以來(lái)，管碟法由于不需要特殊材料，成本低［17］，而成為測(cè)定抗菌物質(zhì)活性最常用的方法，但是該法耗時(shí)長(zhǎng)、對(duì)操作人員經(jīng)驗(yàn)要求較高、人為影響因素多。與管碟法相比，比濁法有靈敏度高、耗時(shí)短、易操作、采用液體培養(yǎng)法無(wú)擴(kuò)散因素影響、人為因素少等優(yōu)點(diǎn)［18］。比濁法是利用抗菌物質(zhì)在液體培養(yǎng)基中對(duì)指示菌生長(zhǎng)的抑制作用，其渾濁程度與活菌數(shù)的增加、菌體質(zhì)量的增加等存在著直接的關(guān)系，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小來(lái)表示對(duì)實(shí)驗(yàn)菌生長(zhǎng)抑制的程度［19］。《中國(guó)藥典》2005 年版抗生素微生物檢定法新增了濁度法測(cè)定方法［20］。1952 年，Berridge 和 Barrett［21］首次應(yīng)用微孔比濁法來(lái)測(cè)定抗生素效價(jià)，經(jīng)過不斷改進(jìn)，該法已成為可以定量測(cè)定抗菌物質(zhì)的一種方法［22］，但是，必須使用酶標(biāo)儀這一條件限制了微孔比濁法的廣泛應(yīng)用，若可以利用分光光度計(jì)比濁法必然會(huì)極大提高其應(yīng)用普遍性［23］。

本實(shí)驗(yàn)采用分光光度計(jì)比濁法，以桿菌肽和沙門氏菌為例，以重復(fù)性和精密度作為指標(biāo)，對(duì)比濁法試驗(yàn)中所涉及的指示菌初始濃度、桿菌肽溶液與菌懸液的比例、培養(yǎng)時(shí)間的影響進(jìn)行探討，并對(duì)各影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定其定量測(cè)定的最佳試驗(yàn)條件。同時(shí)，采用桿菌肽和大腸桿菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)，期望得到重復(fù)性好、精密度高、具有高適用性的桿菌肽定量測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 沙門氏菌ATCC 14028、大腸桿菌ATCC 44752、金黃色葡萄球菌ATCC 25923：購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，加水至1 000 mL，115℃滅菌30 min。

1.1.3 試劑 桿菌肽（效價(jià)＞60 U/mg）：上海麥克林生化科技有限公司；磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）：取磷酸氫二鉀2 g 與磷酸二氫鉀8 g，加水至1 000 mL，115℃滅菌30 min。

1.1.4 儀器設(shè)備 紫外可見分光光度計(jì)：美國(guó)Thermo 公司；超凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫?fù)u床：上海智城分析儀器制造公司。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備 將活化后的沙門氏菌菌株以1%的接種量接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至穩(wěn)定期，10 000 r/min 離心5 min 取菌體，用生理鹽水洗滌3 次，將菌體重懸于生理鹽水中，再按一定比例加入液體培養(yǎng)基備用。

1.2.2 桿菌肽溶液的配制 準(zhǔn)確稱取桿菌肽100 mg，溶于10 mL 磷酸緩沖液中配制成10 mg/mL 的母液，再精確吸取適量母液，用磷酸緩沖液稀釋成不同濃度備用。

1.2.3 培養(yǎng)方式選擇 按照1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法制備初始濃度相同的菌懸液，37℃，分別靜置培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)4 h，比較細(xì)菌生長(zhǎng)情況。

1.2.4 桿菌肽濃度與吸光度線性關(guān)系的驗(yàn)證 在各試驗(yàn)管內(nèi)加入含有沙門氏菌懸液的培養(yǎng)基9.0 mL，再分別加入各濃度桿菌肽溶液1.0 mL，立即搖勻，每一劑量采用3 個(gè)試管，于37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)4 h，取出，立即于紫外分光光度計(jì)600 nm 處測(cè)定吸光度；同時(shí)另取2 支試管分別加入磷酸緩沖液1.0 mL，再分別加入含有沙門氏菌懸液的培養(yǎng)基9.0 mL，其中一支試管與上述各管同法操作作為細(xì)菌生長(zhǎng)情況的陽(yáng)性對(duì)照，另一支立即混勻，作為吸光度測(cè)定的空 白液。

以桿菌肽終濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以O(shè)D600為縱坐標(biāo)，繪制抗菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600之間的線性關(guān)系，驗(yàn)證二者之間是否存在線性關(guān)系。

1.2.5 抑菌測(cè)定方法的優(yōu)化

1.2.5.1 指示菌初始濃度優(yōu)化 按照1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法分別制備初始濃度為106、107、108CFU/mL 的菌懸液，然后按照1.2.4 的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)

1.2.5.2 桿菌肽溶液與菌懸液比例優(yōu)化 按照1.2.1的實(shí)驗(yàn)方法制備指示菌初始濃度為107CFU/mL 的菌懸液，調(diào)整桿菌肽溶液與菌懸液比例分別為1∶1、1∶4、1∶9，其余條件然后按照1.2.4 的實(shí)驗(yàn)方法 進(jìn)行。

1.2.5.3 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化 按照1.2.1 的實(shí)驗(yàn)方法制備指示菌初始濃度為107CFU/mL 的菌懸液，調(diào)整培養(yǎng)時(shí)間分別為4 h、6 h、8 h，其余條件按照1.2.4 的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。

以上優(yōu)化，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行，每個(gè)平行重復(fù)3 次。建立桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與吸光度之間的線性回歸方程，以回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2、斜率、截距以及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為依據(jù)，進(jìn)行方法重復(fù)性、精密度、準(zhǔn)確度的優(yōu)化。

1.2.6 驗(yàn)證試驗(yàn) 為進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)的可行性，選用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 培養(yǎng)方式選擇

指示菌初始濃度保持一致，其他培養(yǎng)條件一樣，分別振蕩和靜置培養(yǎng)相同時(shí)間，比較OD600的變化情況，結(jié)果見圖1。振蕩培養(yǎng)相較于靜置培養(yǎng)OD 值增量明顯，靜置培養(yǎng)OD 值增量太小，會(huì)導(dǎo)致后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差較大，因此培養(yǎng)方式選擇振蕩培養(yǎng)。

2.2 桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600線性關(guān)系的驗(yàn)證

圖1 振蕩培養(yǎng)和靜置培養(yǎng)OD 增量比較

本實(shí)驗(yàn)參考中國(guó)藥典，采用比濁法，利用桿菌肽在液體培養(yǎng)基中對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的抑制作用，通過測(cè)定培養(yǎng)后細(xì)菌濁度值的大小，尋找合適的桿菌肽濃度，使桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與吸光度OD 值呈現(xiàn)線性關(guān)系，結(jié)果見圖2 和表1。結(jié)果表明，在桿菌肽溶液終濃度為0.4-0.8 mg/mL 濃度范圍內(nèi)，桿菌肽濃度的對(duì)數(shù)值與OD600之間存在良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到 0.99 以上。3 次重復(fù)測(cè)定的結(jié)果相對(duì)偏差均較小，可見其準(zhǔn)確性和精密度較好。

圖2 桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600 的線性關(guān)系

表1 桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結(jié)果分析

2.3 抑菌測(cè)定方法的優(yōu)化

2.3.1 指示菌初始濃度優(yōu)化 分別制備106、107、108CFU/mL 的菌懸液，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，繪制桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600之間的線性回歸方程，結(jié)果見圖3。不同的指示菌初始濃度對(duì)斜率、截距及線性相關(guān)系數(shù)的結(jié)果見表2。

圖3 指示菌初始濃度對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028的影響

表2 指示菌初始濃度對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028的結(jié)果分析

當(dāng)指示菌初始濃度為106、108CFU/mL 時(shí)，線性關(guān)系較差，線性相關(guān)系數(shù)均低于0.99，且當(dāng)指示菌初始濃度為106CFU/mL 時(shí)，截距的RSD%超出范圍；當(dāng)指示菌濃度為107CFU/mL 時(shí)，斜率和截距的相對(duì)偏差均較小，線性相關(guān)系數(shù)為0.991 4，精密度良好，因此選擇107CFU/mL 為最佳指示菌初始濃度。另外由圖3 可以看出，指示菌初始濃度太高，抑制作用不明顯；指示菌初始濃度太低，低濃度的桿菌肽就可以完全抑制菌體的生長(zhǎng)。

2.3.2 桿菌肽溶液與菌懸液比例優(yōu)化 桿菌肽溶液與菌懸液比例分別為1∶1、1∶4、1∶9，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，繪制桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600之間的線性回歸方程，結(jié)果見圖4。不同的桿菌肽溶液與菌懸液比例對(duì)斜率、截距及線性相關(guān)系數(shù)的結(jié)果見表3。當(dāng)桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶1、1∶4 時(shí)，線性關(guān)系較差，精密度差，且截距的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差超出范圍；當(dāng)桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶9 時(shí)，線性關(guān)系系數(shù)為0.991 5，斜率和截距的相對(duì)偏差均較小，因此選擇桿菌肽溶液與菌懸液的最佳比例為1∶9。

2.3.3 培養(yǎng)時(shí)間優(yōu)化 培養(yǎng)時(shí)間分別為4 h、6 h、8 h，進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，繪制桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600之間的線性回歸方程，結(jié)果見圖5。不同的培養(yǎng)時(shí)間對(duì)斜率、截距及線性相關(guān)系數(shù)的結(jié)果見表4。

圖4 桿菌肽與菌懸液比例對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的影響

表3 桿菌肽與菌懸液比例對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結(jié)果分析

圖5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的影響

表4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的結(jié)果分析

當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為6 h 和8 h 時(shí)，線性關(guān)系較差，線性相關(guān)系數(shù)均低于0.99，且此時(shí)截距的RSD%超出范圍；當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為4 h 時(shí)，斜率和截距的相對(duì)偏差均較小，線性相關(guān)系數(shù)為0.992 6，精密度良好，因此選擇4 h 為最佳培養(yǎng)時(shí)間。

實(shí)驗(yàn)所用的菌懸液必須新鮮配制，否則實(shí)驗(yàn)誤差大，因?qū)嶒?yàn)菌放置一段時(shí)間后，細(xì)胞老化死亡，但濁度不會(huì)因此改變，從而影響實(shí)驗(yàn)時(shí)的活菌數(shù)［24］。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

采用大腸桿菌ATCC 44752 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 對(duì)上述建立的抑菌定量測(cè)定方法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果見圖6、7 和表5、6。

圖6 大腸桿菌驗(yàn)證試驗(yàn)的桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600 的線性關(guān)系

圖7 金黃色葡萄球菌驗(yàn)證試驗(yàn)的桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與OD600 的線性關(guān)系

通過大腸桿菌驗(yàn)證試驗(yàn)，可以得出，桿菌肽溶液終濃度為0.2-0.6 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，OD600為0.1-0.6，桿菌肽濃度的對(duì)數(shù)值與OD600之間存在良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到 0.99 以上；通過金黃色葡萄球菌驗(yàn)證試驗(yàn)，可以得出，桿菌肽溶液終濃度為0.003-0.007 mg/mL 范圍內(nèi)時(shí)，OD600為0.0-0.4，桿菌肽濃度的對(duì)數(shù)值與OD600之間存在良好的線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到 0.99，以上得出結(jié)果表明精密度和重復(fù)性均良好，驗(yàn)證了此方法的可行性。

表5 桿菌肽抑制大腸桿菌ATCC 44752 的結(jié)果分析

表6 桿菌肽抑制金黃色葡萄球菌ATCC 25923 的結(jié)果分析

3 討論

比濁法與管碟法相比，采用液體培養(yǎng)基，無(wú)擴(kuò)散因素的影響；試驗(yàn)培養(yǎng)3-4 h，當(dāng)天就可獲得結(jié)果，具有快速靈敏、精密度好的優(yōu)點(diǎn)［25］。比濁法常用于抗生素的抑菌性能研究中。潘強(qiáng)等［26］建立了比濁法測(cè)定可利霉素片效價(jià)的方法，以金黃色葡萄球菌為試驗(yàn)菌，菌懸液添加量為0.5%，溫度為（37±0.5）℃，培養(yǎng)時(shí)間3.5-4.0 h 測(cè)定，抗生素線性最佳濃度范圍為6.4-15.7 U/mL。周志敏等［27］采用比濁法測(cè)定氯霉素效價(jià)，氯霉素溶液在3-8 U/mL 濃度范圍內(nèi)，濃度與吸收度呈良好的線性關(guān)系。國(guó)內(nèi)該方法一般用于抗生素的效價(jià)測(cè)定中，而進(jìn)行抗菌肽的定量測(cè)定的研究還較少。佟斌等［28］建立了硫酸多黏菌素E 的比濁法快速測(cè)定方法，當(dāng)硫酸多黏菌素E 的效價(jià)為30-100 U/mL 時(shí)，試驗(yàn)菌液接種濃度為5%，培養(yǎng)時(shí)間為4 h，吸光度對(duì)數(shù)值與硫酸多黏菌素E 效價(jià)具有良好的線性關(guān)系。目前，國(guó)內(nèi)采用比濁法測(cè)定桿菌肽抑菌活性的研究較少，還未形成完善的定量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

4 結(jié)論

通過比濁法優(yōu)化，獲得桿菌肽抑制沙門氏菌ATCC 14028 的最佳測(cè)定條件：指示菌的初始濃度為107CFU/mL，桿菌肽終濃度為0.4-0.8 mg/mL，桿菌肽溶液與菌懸液比例為1∶9，培養(yǎng)時(shí)間為4 h。在此條件下，線性關(guān)系良好，R2達(dá)到0.99 以上，為進(jìn)一步驗(yàn)證此方法的可行性，選用大腸桿菌ATCC 44752 和金黃色葡萄球菌ATCC 25923 進(jìn)行研究，結(jié)果重復(fù)性好，精密度高。

本研究建立的基于桿菌肽濃度對(duì)數(shù)值與吸光度之間線性關(guān)系的定量測(cè)定方法具有快速準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、普適性高等特點(diǎn)，可以廣泛應(yīng)用于桿菌肽的相關(guān)研究。