白藜蘆醇對(duì)糖尿病小鼠腎臟自噬水平及腎間質(zhì)纖維化的影響*

趙俊琳， 張瑩瑩， 段玲弟， 趙思琪， 阮媛媛， 彭 燦， 張 帆， 郭 兵

（貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室，貴州省常見(jiàn)慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng)550025）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種目前在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率呈持續(xù)增長(zhǎng)的慢性?xún)?nèi)分泌紊亂性疾病，而糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是DM較為常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD）及死亡的主要原因之一［1］。腎小管間質(zhì)纖維化是DN發(fā)展至ESRD的主要病理改變之一，其中腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在促進(jìn)腎間質(zhì)纖維化中扮演著重要角色［2］，但是其具體發(fā)生機(jī)制迄今尚未充分闡明。自噬是一種保守的蛋白降解過(guò)程，細(xì)胞利用溶酶體清除衰老的蛋白質(zhì)及受損的細(xì)胞器，對(duì)維持自身穩(wěn)態(tài)和細(xì)胞完整性有重要意義。既往研究表明，DN大鼠腎組織中的自噬水平顯著受到抑制［3］，而提高其自噬水平能顯著抑制腎纖維化及DN的發(fā)生發(fā)展［4］，表明自噬與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［5］。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）別名虎杖苷元，廣泛存在于葡萄等植物中，具有抗腫瘤、抗心血管疾病、抗組織纖維化等多方面的生物藥理活性［6-8］。Res可以防治DN的發(fā)展［4，7-9］，但其潛在的機(jī)制還不完全清楚。為此本項(xiàng)工作采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構(gòu)建1型DM小鼠模型，觀察予以Res干預(yù)后對(duì)DM小鼠腎臟纖維化病變及自噬水平的影響，旨在進(jìn)一步明確Res對(duì)DN腎間質(zhì)纖維化的作用，探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物

健康清潔級(jí)雄性6周齡C57BL/6小鼠24只，體重（20±5）g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司購(gòu)買(mǎi)，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0002。正常飼養(yǎng)在25℃恒溫的設(shè)施中，人工光照、陰暗各12 h，給予標(biāo)準(zhǔn)的清潔級(jí)飼料，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 主要試劑與儀器

STZ（Sigma）；Res（純度＞98%；VETEC）用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的羧甲基纖維素鈉配制成混懸液后備用；抗β-actin抗體（普美生物）；抗α-SMA和抗E-cadherin抗體（Abcam）；抗IV型膠原（collagen type IV，Col IV）抗體（Sigma）；抗微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）和抗Snail1抗體（Cell Signaling Technology）；抗beclin-1抗體（Proteintech）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔和羊抗小鼠IgG（博士德）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天生物研究所）；聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜 和 Whatman 3MM濾紙（Millipore）；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit（Thermo）；TB GreenPremix Ex TaqTMII（TaKaRa）；組織研磨器（新芝）；AU680全自動(dòng)生化分析儀（Beckman Coulter）；Scope A1正 置 顯微鏡（Zeiss）；凝膠成像系統(tǒng)和熒光定量PCR儀（Bio-Rad）。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的制備及分組 將24只C57-BL/6小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分為正常對(duì)照（normal control，NC）組、DM組和Res組，每組8只。后兩組造模前稱(chēng)重，禁食6 h，乙醚麻醉，腹腔注射溶于無(wú)菌檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.5，0.01 mol/L）的STZ（55 mg·kg-1·d-1），連續(xù)5 d，復(fù)制DM小鼠模型。NC組予腹腔注射等體積STZ溶媒枸櫞酸鈉緩沖液。尾靜脈采血測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），以FBG≥16.7 mmol/L且穩(wěn)定1周者為造模成功。成模8周后，Res組采取灌胃方式予以Res干預(yù)，Res溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉中，灌胃劑量為10 mg·kg-1·d-1，每日灌胃1次，現(xiàn)配現(xiàn)用。DM組和NC組予等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%的羧甲基纖維素鈉，每日灌胃1次，連續(xù)給藥12周后處死所有小鼠。期間所有小鼠予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，每周監(jiān)測(cè)1次血糖和體重。

3.2 血、尿及腎組織采集 處死前1 d收集24 h尿液并記錄尿量，離心后取部分上清用于檢測(cè)尿蛋白；處死前禁食6 h，乙醚麻醉稱(chēng)重后，眼眶取血，1 467×g離心10 min分離血清檢測(cè)生化指標(biāo)。取血后剪開(kāi)腹腔暴露雙側(cè)腎臟，在冰上輕柔去除腎臟外包膜及周?chē)窘M織，記錄雙側(cè)腎臟重量，取部分組織固定于4%的中性甲醛，做成石蠟切片后行病理檢測(cè)，其余部分切開(kāi)腎臟并去除腎髓質(zhì)，-80℃超低溫冷凍保存，用于提取蛋白和RNA分別行Western blot和realtime PCR檢測(cè)。以腎重（mg）/體重（kg）比值作為腎臟指數(shù)（kidney index，KI）。

3.3 生化指標(biāo)檢測(cè) 用葡萄糖氧化酶法測(cè)FBG，氧化酶法測(cè)血清肌酐（serum creatinine，SCr），免疫比濁法測(cè)尿白蛋白排泄率（urinary albumin excretion rate，UAER），鄰苯三酚紅鉬法測(cè)尿總蛋白（urinary total protein，UTP）。以UTP乘以24 h尿量計(jì)算24 h UTP。以UAER乘以24 h尿量計(jì)算24 h UAER。

3.4 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 取部分腎組織固定于4%的中性甲醛，經(jīng)包埋、固定，做成3μm厚的石蠟切片，脫蠟后行HE和Masson染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察各組腎組織的形態(tài)學(xué)變化。

3.5 Western blot法檢測(cè)各組腎組織中纖維化指標(biāo)、EMT指標(biāo)及自噬標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平 稱(chēng)取0.2 g腎皮質(zhì)組織于1.5 mL高壓滅菌過(guò)的EP管內(nèi)，加入1 mL組織蛋白裂解液（RIPA∶PMSF=97∶3），管內(nèi)放入磁珠，經(jīng)組織研磨機(jī)充分研磨成液體。4℃、13 201×g離心，取上清，BCA法蛋白定量，根據(jù)濃度加入適量上樣緩沖液，充分混勻后，100℃沸水中加熱10 min。上樣，經(jīng)SDS-PAGE分離，以300 mA電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，TBST洗膜，10 min，3次，然后分別加 I抗［β-actin（1∶4 000）、LC3（1∶1 000）、beclin-l（1∶1 000）、Col IV（1∶500）、α-SMA（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 Snail1（1∶1 000）］，4℃孵育過(guò)夜。次日回收I抗，TBST洗膜后加入相應(yīng)的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的II抗（1∶5 000），常溫孵育1 h，洗膜，放入ECL顯影液（1∶1）中，避光混勻，Bio-Rad凝膠成像儀曝光，Image Lab 5.1軟件選中條帶并分析灰度值，結(jié)果用目的蛋白與β-actin相對(duì)表達(dá)量表示。

3.6 Real-time PCR檢測(cè)α-SMA、E-cadherin和Col IV的mRNA表達(dá) 取0.1 g腎組織皮質(zhì)部分加1 mL TRIzol提取小鼠腎組織RNA，于核酸蛋白分析儀260/280 nm測(cè)定RNA的濃度及純度后，根據(jù)Therom試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后按照TaKaRa TB GreenPremix Ex TaqTMII 20μL體系試劑盒操作，應(yīng)用DNAMAN軟件設(shè)計(jì)α-SMA、E-cadherin、Col IV及β-actin引物，由上海生物工程有限公司合成，用Bio-Rad CFX96TM熒光定量PCR分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)采用熔解曲線分析評(píng)價(jià)PCR結(jié)果的可靠性。PCR程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 10 s，55℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；72℃10 s。以β-actin為內(nèi)參照，待測(cè)基因的相對(duì)表達(dá)量以2-ΔΔCt表示。ΔΔCt=［Ct目的基因（待測(cè)樣品）-Ct內(nèi)參照（待測(cè)樣品）］-［Ct目的基因（校正樣品）-Ct內(nèi)參照（校正樣品）］。引物序列見(jiàn)表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers used in real-time PCR

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)都以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組小鼠代謝及生化指標(biāo)比較

DM組FBG、KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均顯著高于NC組（P＜0.05），Res組KI、SCr、24 h UAER及24 h UTP均顯著低于DM組（P＜0.05），而DM組和Res組FBG無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)表2。

2 各組腎組織的病理變化

HE及Masson染色可見(jiàn)，NC組小鼠腎小管結(jié)構(gòu)較清晰，上皮細(xì)胞排列整齊，基底膜較完整，間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及膠原沉積不顯著；與NC組相比，DM組小鼠腎小球充血擴(kuò)張，部分腎小管上皮細(xì)胞空泡、壞死、萎縮脫落，腎小管管腔擴(kuò)張，腎小管及腎間質(zhì)周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)伴有顯著的藍(lán)色膠原纖維沉積；與DM組相比，Res組小鼠腎臟病變有所減輕，腎小球充血較輕，腎小管間質(zhì)纖維化病變亦減輕，膠原沉積減少，見(jiàn)圖1。

表2 各組代謝及生化指標(biāo)比較Table 2.The kidney index（KI），fasting blood glucose（FBG），24-hour urinary albumin excretion rate（24 h UAER），24-hour urine total protein（24 h UTP）and serumcreatinine（SCr）in each group（Mean±SD.n=8）

Figure 1.The histological changes of the renal tissues in each group.圖1 各組腎組織的形態(tài)學(xué)觀察

3 各組腎組織中纖維化指標(biāo)Col IV及EMT相關(guān)指標(biāo)α-SMA、E-cadherin和Snail1的表達(dá)水平

DM組腎組織中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表達(dá)較NC組顯著上調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)較NC組顯著下調(diào)（P＜0.05）；而Res組腎組織中Col IV、α-SMA和Snail1蛋白表達(dá)較DM組顯著下調(diào)，E-cadherin蛋白表達(dá)較DM組顯著上調(diào)（P＜0.05），見(jiàn)圖2A。DM組腎組織中Col IV和α-SMA的mRNA表達(dá)較NC組顯著增高，而E-cadherin的mRNA表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與DM組比較，Res組E-cadherin的mRNA表達(dá)增高（P＜0.05），而Col IV和α-SMA的mRNA表達(dá)降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2B。

4 各組腎組織中自噬相關(guān)指標(biāo)beclin-1和LC3-II的蛋白表達(dá)水平

與NC組相比，DM組自噬標(biāo)志蛋白beclin-1蛋白表達(dá)減少，LC3-II/LC3-I比值下降（P＜0.05）。與DM組相比，Res組beclin-1蛋白表達(dá)顯著增多，LC3-II/LC3-I比值升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

討 論

DN是ESRD的主要病因之一［1］，其病理改變主要為腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化，而腎間質(zhì)纖維化的主要表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞損傷及大量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的沉積。腎小管上皮細(xì)胞的EMT在促進(jìn)ECM的沉積、腎間質(zhì)纖維化及DN的發(fā)生與發(fā)展中起著重要的作用［2，9］，其中轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail1可能作為EMT的始動(dòng)因子發(fā)揮著關(guān)鍵作用［10］。Snail1可以與E-cadherin啟動(dòng)子區(qū)E盒結(jié)合，抑制E-cadherin的表達(dá)，同時(shí)還可以誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)。在高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞中，促進(jìn)上皮細(xì)胞Snail1的表達(dá)能促進(jìn)EMT的發(fā)生，而抑制Snail1的表達(dá)則能抑制EMT的發(fā)生［11-12］。本實(shí)驗(yàn)中DM組的生化指標(biāo)和病理形態(tài)學(xué)均提示糖尿病腎病腎間質(zhì)纖維化動(dòng)物模型復(fù)制成功。與NC組相比，DM組中α-SMA、Col IV和Snail1的表達(dá)增加；E-cadherin的表達(dá)減少（P均＜0.05），說(shuō)明在這個(gè)過(guò)程中發(fā)生了纖維化病變及EMT。

自噬是細(xì)胞內(nèi)溶酶體依賴(lài)性蛋白降解的兩種途徑之一［13］，在代謝、退行性和惡性疾病等許多生理和病理情況下具有重要作用［14-15］。Huang等［8］檢測(cè)到db/db小鼠腎組織中的自噬水平明顯受到抑制，其中beclin-1是自噬啟動(dòng)的關(guān)鍵蛋白，有文獻(xiàn)報(bào)道在DN大鼠模型及高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞模型中beclin-1的表達(dá)及自噬水平均明顯降低［5，16］。我們的研究結(jié)果顯示，隨著纖維化病變的進(jìn)展，DM組小鼠腎組織中beclin-1和LC3-II蛋白表達(dá)水平較NC組顯著下調(diào)，自噬水平減弱。這表明自噬不足可能參與了糖尿病腎纖維化的發(fā)生發(fā)展，而上調(diào)自噬水平可能作為DN治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)［5］。另外，增加beclin-1的表達(dá)能提高細(xì)胞自噬水平，抑制EMT的發(fā)生［17］。本研究結(jié)果顯示，與NC組相比，DM小鼠腎組織的beclin-1表達(dá)減少而Snail1表達(dá)水平顯著升高，纖維化病變明顯，提示beclin-1調(diào)控的自噬與EMT關(guān)系密切。

Figure 2.The protein and mRNA expression levels of fibrosis index collagen type IV（Col IV）and EMT-related indexesα-SMA，E-cadherin and Snial1 in renal tissues of each group.A：the protein levels of Col IV，α-SMA，E-cadherin and Snial1 were determined by Western blot.B：the mRNA levels of Col IV，α-SMA and E-cadherin were determined by real-time PCR.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCgroup；#P＜0.05，**P＜0.01 vs DMgroup.圖2 各組腎組織中纖維化指標(biāo)Col IV及EMT相關(guān)指標(biāo)α-SMA、E-cadherin和Snial1的蛋白和mRNA表達(dá)水平

Figure 3. The protein levels of beclin-1 and LC3 IIin renal tissues of each group.Mean±SD.n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs NCGroup；##P＜0.05 vs DM Group.圖3 Western blot顯示各組腎組織中自噬相關(guān)指標(biāo)beclin-1和LC3-II的蛋白表達(dá)水平

Res是一種來(lái)源于花生、葡萄、桑葚等植物的天然多酚類(lèi)化合物，具有抗腫瘤、抗氧化、延緩衰老等功效，有很好的食用價(jià)值和藥用價(jià)值。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外研究表明Res具有防治DN的作用［4，18-19］，但是具體機(jī)制尚不明確。He等［19］發(fā)現(xiàn)Res能抑制高糖培養(yǎng)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。在DN大鼠模型中，Res可通過(guò)恢復(fù)腎組織自噬水平改善腎功能［4］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DM小鼠接受Res干預(yù)后，自噬水平上調(diào)，纖維化病變程度顯著減輕。與DM組相比，beclin-1表達(dá)水平顯著升高，而Snail1表達(dá)減少，纖維化病變及EMT減輕。以上研究結(jié)果提示Res可能通過(guò)促進(jìn)beclin-1的表達(dá)，上調(diào)自噬水平，促進(jìn)Snail1的降解，減輕腎臟纖維化，抑制DM小鼠腎間質(zhì)纖維化及EMT的發(fā)生發(fā)展，從而發(fā)揮保護(hù)腎臟的作用。

綜上所述，Res對(duì)DN的保護(hù)作用，可能是通過(guò)上調(diào)beclin-1介導(dǎo)的自噬水平，下調(diào)Snail1的表達(dá)，從而延緩腎臟纖維化的進(jìn)程，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用。但是在DN中，beclin-1與Snail1之間的具體關(guān)系還不是很清楚，有待深入研究。