葫蘆素E通過抑制MAPKs/NF-κB通路減輕哮喘小鼠氣道炎癥*

姜京植， 徐 暢， 王重陽， 李良昌， 李 莉， 李俊峰， 延光海

（延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，吉林省過敏性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林延吉133002）

哮喘是呼吸系統(tǒng)一種常見的疾病，是世界醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為的4大頑癥之一，其主要特征是嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道炎癥、黏液生成增加和氣道高反應(yīng)性［1］。哮喘與相關(guān)1型輔助性T細(xì)胞（Th1）/Th2豐度失衡有著密切的關(guān)系［2］。哮喘上調(diào)Th2細(xì)胞產(chǎn)生的白細(xì)胞介素（interlukin，IL）-4、IL-5和 IL-13［3］。Th1細(xì)胞因子，包括干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）和IL-12參與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫應(yīng)答。這些細(xì)胞因子通過對(duì)抗Th2介導(dǎo)的免疫反應(yīng)來減少IgE合成，從而抑制哮喘的發(fā)展［4］。當(dāng)Th1/Th2豐度動(dòng)態(tài)平衡被破壞時(shí)，疾病就會(huì)發(fā)生。研究顯示，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）和核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路的激活在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮作用［5］。因此，MAPKs和NF-κB信號(hào)通路可作為哮喘重要的治療分子靶點(diǎn)?？梢酝ㄟ^抑制MAPKs和NF-κB信號(hào)通路的方法來治療哮喘。

葫蘆素E（cucurbitin E，CuE）是從葫蘆中分離得到的一種中藥化學(xué)成分。近年來有研究表明，葫蘆素E具有抗炎、抗腫瘤和抗氧化等多種藥理作用［6］。這些發(fā)現(xiàn)促使我們推測(cè)，葫蘆素E可能是一種很好的預(yù)防和治療過敏性哮喘的候選藥物。為了解決這一問題，我們研究葫蘆素E對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 材料

1.1 動(dòng)物及分組 清潔級(jí)BALB/c小鼠（7周齡）40只，雌性，購(gòu)于延吉市健康科學(xué)中心，飼養(yǎng)于延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照（control）組、模型（model）組、葫蘆素E低劑量（low-dose CuE）組、葫蘆素E高劑量（high-dose CuE）組和地塞米松（dexamethasone，Dexa）組，每組8只。實(shí)驗(yàn)前，小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下用水和標(biāo)準(zhǔn)食品飼養(yǎng)1周。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均按照延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與利用機(jī)構(gòu)委員會(huì)（延吉市）批準(zhǔn)的指導(dǎo)方針進(jìn)行。

1.2 藥品試劑與儀器 葫蘆素E購(gòu)于Sigma；卵清蛋白（ovalbumin，OVA）購(gòu)于Sigma；氫氧化鋁購(gòu)于Pierce；抗磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）抗體（sc135642）、抗磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase 1/2，p-ERK1/2）抗體（sc7976）、抗磷酸化 p38 MAPK（phosphorylated p38 MAPK，p-p38 MAPK）抗體（sc101759）、抗p65抗體（ab16502）、抗磷酸化p65（phosphorylated p65，pp65）抗體（ab53489）和 β-actin抗體（ab8226）購(gòu)于Santa Cruz及Abcam；IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海帝肯公司；BCA蛋白試劑盒購(gòu)于Rainbio。超聲波霧化器為OMRON產(chǎn)品；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)為Bio-Rad產(chǎn)品。

2 方法

2.1 模型制備 模型組、葫蘆素E低劑量組、葫蘆素E高劑量組和地塞米松組小鼠第1、7和14天腹腔注射致敏液200μL（致敏液的組成為10μg卵清蛋白，1 mg氫氧化鋁佐劑和生理鹽水）。對(duì)照組用等量生理鹽水代替。從第21～23天，致敏小鼠暴露于1%OVA的氣溶膠中20 min。支氣管激發(fā)實(shí)驗(yàn)在排氣塑料室（18 cm×14 cm×8 cm）進(jìn)行。氣溶膠粒子直徑約3～5μm。對(duì)照組暴露于霧化吸入的PBS中。治療組從第17天起，每只小鼠灌胃CuE（100或200 mg/kg），每日1次，連續(xù)7 d。地塞米松組在暴露于1%OVA氣溶膠刺激前1 h腹腔注射地塞米松，自第21天起，每天注射1次。最后一次注射后，小鼠24 h內(nèi)被處死。

2.2 支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 左側(cè)肺以生理鹽水（37℃）灌洗，收集BALF，2 500 r/min離心10 min?；厥占?xì)胞進(jìn)行瑞氏染色，光鏡下分類計(jì)數(shù)炎癥細(xì)胞數(shù)量。

2.3 肺組織病理學(xué)分析 小鼠肺組織用4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋。對(duì)肺切片進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）和高碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色。光鏡檢查。HE染色觀察反映支氣管炎癥的肺組織形態(tài)學(xué)改變。PAS染色評(píng)價(jià)杯狀細(xì)胞增生。測(cè)定氣道上皮中PAS染色陽性細(xì)胞的百分比，以估計(jì)粘液的產(chǎn)生量。在200倍放大顯微鏡視野下，隨機(jī)選取各切片，進(jìn)行光強(qiáng)度分析。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 按照制造商的說明書，采用特異性ELISA試劑盒檢測(cè)BALF中IL-4、IL-5、IL-13和IFN-γ。然后，用微板閱讀器在450 nm處測(cè)量吸光度。

2.5 Western blot分析 小鼠肺組織在樣品緩沖液中溶解后變性。由BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度。由SDS-PAGE分離等量的蛋白質(zhì)樣品。分離后蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到NC膜上。再用5%脫脂奶粉溶液封閉，并在4℃下與抗體共同孵育過夜。沖洗后，將膜與辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ⅱ抗在室溫下孵育2 h，用ECL檢測(cè)試劑檢測(cè)蛋白條帶。

2.6 免疫組化 石蠟切片進(jìn)行免疫組化分析。即經(jīng)脫蠟固定后，加入抗NF-κB p65抗體和Ⅱ抗孵育，之后染色封片，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以各組積分吸光度均值與對(duì)照組的比值表示。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，選用單因素方差分析（one-way ANOVA）統(tǒng)計(jì)方法，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 葫蘆素E對(duì)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響

與對(duì)照組比，模型組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著升高；經(jīng)葫蘆素E或地塞米松處理后，這些細(xì)胞的數(shù)量顯著減少（P＜0.05），見圖1。此結(jié)果表明葫蘆素E可減少OVA誘導(dǎo)哮喘小鼠BALF中相關(guān)炎癥細(xì)胞的數(shù)量。

Figure 1.The effect of CuEon the numbers of inflammatory cells in BALFof the mice.Mean±SD.n=7.*P＜0.05 vs model group.圖1 葫蘆素E對(duì)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞數(shù)量的影響

2 葫蘆素E對(duì)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

與正常組比，模型組BALF中炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-5及IL-13含量明顯增高（P＜0.05），而IFN-γ含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比，葫蘆素E高劑量組和地塞米松組IL-4、IL-5及IL-13細(xì)胞因子含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組比，葫蘆素E低劑量組IL-4及IL-13細(xì)胞因子含量明顯降低（P＜0.05），而IL-5含量無明顯變化（P＞0.05）；與模型組比高、低劑量葫蘆素E組或地塞米松組IFN-γ含量明顯增高。結(jié)果見圖2。

3 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織病理學(xué)表現(xiàn)的影響

用HE染色法測(cè)定肺切片中炎癥細(xì)胞數(shù)，正常組未見異常；模型組與正常組比，氣道周圍有大量浸潤(rùn)性炎癥細(xì)胞（P＜0.05）；葫蘆素E高劑量組和地塞米松組炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型組（P＜0.05）。用PAS染色測(cè)定杯狀細(xì)胞的產(chǎn)生，正常組的上皮杯狀細(xì)胞產(chǎn)生和黏液分泌正常。模型組PAS陽性細(xì)胞百分率明顯高于正常組（P＜0.05），而葫蘆素E組和地塞米松組則氣道上皮杯狀細(xì)胞產(chǎn)生和黏液分泌明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果見圖3。

4 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織MAPKs信號(hào)通路活性的影響

與正常組比，模型組肺部p-JNK、p-ERK1/2及pp38 MAPK的含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比葫蘆素E高劑量組或地塞米松組，肺部上述指標(biāo)含量明顯降低（P＜0.05），但葫蘆素E處理組上述指標(biāo)含量仍高于正常組（P＜0.05）。結(jié)果見圖4。

Figure 2.The effect of CuE on inflammatory cytokines content in BALF of mice.ELISA was used to detect the levels of IL-4，IL-5，IL-13 and IFN-γ in BALF.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.圖2 葫蘆素E對(duì)小鼠BALF中炎癥細(xì)胞因子含量的影響

Figure 3.The effect of CuEon lung histomorphological lesions in the mice（×100）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.圖3 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織病理表現(xiàn)的影響

Figure 4.The effect of CuEon MAPKs signaling pathway activity in lung tissues of mice.Theprotein levelsof p-JNK，p-ERK1/2 and pp38 MAPK were determined by Western blot.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.圖4 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織MAPKs信號(hào)通路活性的影響

5 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織NF-κB信號(hào)通路活性的影響

用Western blot方法檢測(cè)p-p65蛋白的水平，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組肺部p-p65含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比，葫蘆素E高劑量組，肺部p-p65含量明顯降低（P＜0.05），見圖5A。用免疫組化的方法檢測(cè)p-p65蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，模型組較正常組肺部p-p65含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組比，葫蘆素E組肺部p-p65含量降低（P＜0.05），見圖5B。

討 論

在本研究中，我們利用OVA誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型來探索葫蘆素E對(duì)過敏性氣道炎癥的影響。以地塞米松為標(biāo)準(zhǔn)參考藥物，比較葫蘆素E抗哮喘活性。首先觀察了葫蘆素E對(duì)哮喘小鼠肺部炎癥的影響。結(jié)果表明，葫蘆素E明顯降低了哮喘小鼠BALF的炎癥細(xì)胞數(shù)量、抑制了肺組織炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示，葫蘆素E明顯減輕了OVA誘導(dǎo)小鼠的肺泡損傷。既往研究也顯示葫蘆素E對(duì)炎癥具有一定療效，王力先等［7］發(fā)現(xiàn)葫蘆素E具有潛在免疫調(diào)節(jié)作用。喬靜等［8］發(fā)現(xiàn)葫蘆素E對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)有影響。

細(xì)胞因子如IL-4、IL-5、IL-13及IFN-γ在慢性變應(yīng)性炎癥的進(jìn)展中是必需的。據(jù)我們所知，過敏性哮喘表現(xiàn)為Th2細(xì)胞活性被激活，Th1細(xì)胞活性降低，發(fā)病機(jī)制為Th1/Th2細(xì)胞因子失衡［9］。Th2細(xì)胞釋放IL-4、IL-5和IL-13等Th2型細(xì)胞因子，促進(jìn)哮喘的發(fā)展。然而，Th1細(xì)胞因子，如IFN-γ，則抑制了哮喘氣道炎癥反應(yīng)。結(jié)果表明，葫蘆素E能明顯降低BALF中IL-4、IL-5和IL-13的含量，提高IFN-γ的含量。因此，葫蘆素E可能通過誘導(dǎo)Th1/Th2平衡免疫反應(yīng)而減輕哮喘小鼠氣道炎癥反應(yīng)。

Figure 5.The effect of CuEon NF-κBsignaling activity in the lung tissues of mice（×100）.A：p-p65 protein level was determined by Western blot；B：p-p65 protein expression was detected by immunohistochemical staining.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs model group.圖5 葫蘆素E對(duì)小鼠肺組織NF-κB信號(hào)通路活性的影響

研究顯示，MAPKs和NF-κB信號(hào)通路的激活在哮喘發(fā)病過程中發(fā)揮作用。MAPKs信號(hào)通路在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，MAPKs信號(hào)通路主要包括JNK、ERK1/2和p38 MAPK介導(dǎo)的3條級(jí)聯(lián)反應(yīng)。有研究表明哮喘動(dòng)物MAPKs信號(hào)通路較正常動(dòng)物活性增強(qiáng)。本研究顯示，模型組小鼠肺部p-JNK、p-ERK1/2及p-p38 MAPK含量較正常組明顯升高，這與既往報(bào)道相一致［10］。本研究中，高劑量葫蘆素E組明顯降低了哮喘小鼠肺部p-JNK、p-ERK1/2及pp38 MAPK含量，表明高劑量葫蘆素E可抑制OVA誘導(dǎo)的MAPK信號(hào)通路過度激活。目前已知，p38是MAPK家族控制炎癥反應(yīng)最重要的成員，它可由LPS、滲透性應(yīng)激和紫外線照射而激活?；罨膒38 MAPK可磷酸化IκB，導(dǎo)致IκB降解，進(jìn)而激活NF-κB。其它研究也顯示哮喘動(dòng)物NF-κB通路活性較正常動(dòng)物增加［11］，與本研究結(jié)果一致。本研究顯示，模型組p-p65表達(dá)升高，表明NF-κB通路激活，高劑量葫蘆素E使哮喘小鼠p-p65表達(dá)較模型組明顯降低，表明葫蘆素E可明顯抑制NF-κB通路活性。

如前所述，OVA引起了小鼠炎性因子分泌以及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路激活。與文獻(xiàn)報(bào)道一致，上述炎癥因子的過度分泌及通路的激活，可引起肺部炎癥加劇，肺泡損傷，并引起氣道重塑［12］。針對(duì)此，大量研究以藥物對(duì)哮喘進(jìn)行干預(yù)，旨在降低炎癥因子的過度分泌及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路的過度激活。結(jié)果表明，能作用于上述靶點(diǎn)的藥物，可明顯減輕哮喘病變。

Shang等［13］發(fā)現(xiàn)葫蘆素 E 通過抑制 HMGB1-TLR4-NF-κB信號(hào)通路，減輕脂多糖誘發(fā)的支氣管上皮細(xì)胞損傷、炎癥和MUC5AC的表達(dá)。本文進(jìn)行了動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。這樣，使葫蘆素E在哮喘中作用的研究更具有說服力。葫蘆素E對(duì)哮喘中的MAPK信號(hào)通路的影響是這篇文章中沒有進(jìn)行論述的。本研究中，葫蘆素E明顯降低了OVA引起的炎癥因子分泌及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路激活，同時(shí)減輕了小鼠肺部炎癥以及肺泡損傷，理論上推測(cè)小鼠哮喘的好轉(zhuǎn)可能與葫蘆素E抑制炎癥因子水平及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。在既往報(bào)道中，雖然有眾多的中藥提取物表現(xiàn)出了一定的抗哮喘作用，但與陽性對(duì)照藥地塞米松比較，多數(shù)提取物均未達(dá)到或優(yōu)于地塞米松的療效［14］。與此類似，本研究中葫蘆素E雖然明顯抑制了炎癥因子分泌及MAPKs/NF-κB信號(hào)通路活性，但其各數(shù)據(jù)仍未達(dá)到正常水平。因此，葫蘆素E僅有部分緩解哮喘氣道炎癥作用。

總之，葫蘆素E可明顯緩解哮喘小鼠肺部炎癥反應(yīng)，同時(shí)抑制了MAPKs和NF-κB信號(hào)通路活性。故推測(cè)，葫蘆素E減輕哮喘小鼠氣道炎癥與抑制MAPKs/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。