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    miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞增殖和遷移的影響*

    2020-06-09 02:42:04杜喜風(fēng)胡志輝景敏潔王雅婷蘭麗珍
    中國(guó)病理生理雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:螢光乳頭狀試劑盒

    杜喜風(fēng), 胡志輝, 景敏潔, 王雅婷, 蘭麗珍

    (山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,山西太原030001)

    甲狀腺乳頭狀癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)是最常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤,且近年來(lái)其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)。約有10%~15%的PTC患者常出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā),導(dǎo)致其標(biāo)準(zhǔn)治療的效果較差,預(yù)后不佳[1]。因此,研究PTC形成和發(fā)展的分子機(jī)制是十分必要的,對(duì)尋找PTC治療新藥,提高PTC患者的預(yù)后具有重要意義。

    微小RNA(microRNA,miRNA,miR)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中由基因組編碼的長(zhǎng)度約22個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,通過(guò)和靶基因mRNA堿基完全或不完全配對(duì)進(jìn)而誘導(dǎo)沉默復(fù)合體降解mRNA或阻礙其翻譯,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖和代謝等基本的生理過(guò)程[2]。大量研究已經(jīng)證實(shí),異常表達(dá)的 miRNA 如 miR-105[3]、miR-300[4]等能夠從轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控各種致癌或抑癌基因的表達(dá),從而調(diào)控多種惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。近期研究發(fā)現(xiàn),miR-206 在多種癌癥中如乳腺癌[5]、肝癌[6]、胃癌[7]、喉癌[8]等有異常表達(dá),表明它與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn),miR-206的表達(dá)量在PTC組織中較正常組織中低。但miR-206對(duì)PTC具體生物功能及機(jī)制尚未闡明。

    肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)的受體c-Met是原癌基因編碼的一種190 kD的蛋白,是具有確定的致癌特性的受體酪氨酸激酶,在正常細(xì)胞發(fā)育和腫瘤發(fā)生中起重要作用。c-Met與HGF結(jié)合后,引起受體酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的自磷酸化,激活蛋白激酶,導(dǎo)致酪氨酸殘基磷酸化并激活PI3K/Akt/mTOR通路[10]。異常激活的c-Met/Akt/mTOR信號(hào)通路與甲狀腺癌、宮頸癌等多種惡性細(xì)胞的增殖和遷移密切相關(guān)[11-12]。然而,在PTC中,miR-206能否通過(guò)抑制c-Met/Akt/mTOR信號(hào)通路而發(fā)揮抑癌作用,鮮有相關(guān)報(bào)道。本研究旨在研究miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)PTC細(xì)胞增殖和遷移的影響并探索其可能的機(jī)制,為PTC臨床靶向治療篩選新的分子干預(yù)靶點(diǎn)。

    材料和方法

    1 主要試劑

    人甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞株購(gòu)自歐洲細(xì)胞培養(yǎng)中心。DMEM/F12培養(yǎng)液購(gòu)自HyClone;澳洲胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購(gòu)自 CellMax;LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen;TRIzol試劑購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;CCK-8和BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;Transwell小室購(gòu)自Corning;hsa-miR-206模擬物(hsa-miR-206 mimic)和陰性對(duì)照無(wú)關(guān)序列均購(gòu)自上海吉瑪基因;反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自GeneCopoeia;實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒ChamQTMUniversal SYBR?qPCR Master Mix購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega;抗 c-Met、p-Met、AKT、p-AKT、mTOR、pmTOR和β-actin抗體均購(gòu)自上海生工。

    2 主要方法

    2.1 K1細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 K1細(xì)胞用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。將實(shí)驗(yàn)分為3組,即空白(blank)組(未行任何轉(zhuǎn)染)、陰性對(duì)照(miR-NC)組(轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照序列miR-NC)和實(shí)驗(yàn)組(miR-206 mimic組;轉(zhuǎn)染miR-206 mimic)。在轉(zhuǎn)染前1 d,對(duì)細(xì)胞株進(jìn)行傳代,且更換為無(wú)雙抗的培養(yǎng)基,計(jì)數(shù)9.0×105個(gè)K1細(xì)胞均勻接種于6孔板中培養(yǎng),待細(xì)胞匯合度約70%時(shí),再行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。按照LipofectamineTM3000使用說(shuō)明書,吸取miR-206 mimic和miR-NC(濃度均為50μmol/L)各4μL,溶解于100 μL Opti-MEM培養(yǎng)液為A液,同時(shí)吸取LipofectamineTM3000試劑4μL,溶解于100μL Opti-MEM培養(yǎng)液為B液,均靜置5 min。A液和B液混合,室溫靜置20 min后加入細(xì)胞培養(yǎng)板中,總體積為2 mL。于37℃、含5%CO2的孵箱中培養(yǎng)6 h后,更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    2.2 RT-qPCR實(shí)驗(yàn) 采用TRIzol法提取上述各組細(xì)胞的總RNA,測(cè)定RNA的濃度及純度后,按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-OneTMmiRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以此cDNA為模板,采用RT-qPCR試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以檢測(cè)miR-206表達(dá)量。引物均購(gòu)自上海生工。miR-206的上游引物序列為5′-TGGAATGTAAGGAAGTGTGTGG-3′,下 游 引 物 序 列 為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′;內(nèi)參照U6的上游引物序列 為 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,下游引物序列為 5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。反應(yīng)體系包括:Universal SYBR?qPCR Master Mix試劑10μL,模板cDNA 2μL,上、下游引物(濃度均為10 μmol/L)各0.4μL,無(wú)RNA酶的雙蒸水7.2μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性30 s;95℃10 s,60℃30 s,共40個(gè)循環(huán)。結(jié)果得出Ct值,采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組miR-206的相對(duì)表達(dá)水平,以檢驗(yàn)轉(zhuǎn)染效果。

    2.3 CCK-8和活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的增殖能力 將轉(zhuǎn)染24 h后的各組K1細(xì)胞分別接種于96孔板,細(xì)胞密度為每孔3×103個(gè),每孔100μL,每組設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。分別將細(xì)胞培養(yǎng)0、24、48和72 h后,終止培養(yǎng);向各孔中加入10μL CCK-8溶液,繼續(xù)培養(yǎng)1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)450 nm處的吸光度(A450)。以時(shí)間為橫坐標(biāo),A450值為縱坐標(biāo),繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。用0.04%臺(tái)盼藍(lán)對(duì)各組消化后的細(xì)胞染色,進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)(活細(xì)胞數(shù)=總細(xì)胞數(shù)-著色的死細(xì)胞數(shù)),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)3次。

    2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 收集上述轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組K1細(xì)胞,計(jì)數(shù)2×104個(gè)細(xì)胞,用200μL無(wú)血清培養(yǎng)基重懸,加入Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板的小室上室,下室加入500μL含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。在37℃、含5%CO2的孵箱中孵育24 h后,取出Transwell小室,用棉簽輕輕拭去微孔膜上層的細(xì)胞,用4%多聚甲醛溶液固定下層細(xì)胞20 min,PBS洗3次;再用0.1%結(jié)晶紫染色液室溫染色10 min,PBS洗3次;小室干燥后置于光學(xué)顯微鏡下觀察,隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照、計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞。以穿膜細(xì)胞的相對(duì)數(shù)目表示腫瘤細(xì)胞的遷移能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.5 雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-206對(duì)c-Met基因的靶向作用 用TargetScan 7.1(www.targetscan.org/vert_71/)預(yù)測(cè) miR-206 與其靶基因 3′端非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′UTR)的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)GenePharma合成野生型(pGL3-c-Met-3′UTR WT)和突變型(pGL3-c-Met-3′UTR MUT)c-Met螢光素酶報(bào)告載體。將K1細(xì)胞接種在24孔板中培養(yǎng)過(guò)夜,待細(xì)胞密度約90%時(shí),使用LipofectamineTM3000將 pGL3-c-Met-3′UTR WT 或 pGL3-c-Met-3′UTR MUT與miR-206 mimic或miR-NC共同轉(zhuǎn)染至K1細(xì)胞,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,轉(zhuǎn)染48 h后,按雙螢光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書提供的方法,在單光子檢測(cè)儀上檢測(cè),計(jì)算相對(duì)螢光素酶活性。相對(duì)螢光素酶活性=螢火蟲螢光素酶活性值/海腎螢光素酶活性值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    2.6 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白的表達(dá)水平 收集轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組K1細(xì)胞,用RIPA蛋白裂解液抽提細(xì)胞全蛋白,冰上靜置30 min,離心后取上清液。BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。將SDS-PAGE分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)到聚偏二氟乙烯膜上。使用含5%脫脂奶粉和Tween 20的磷酸鹽緩沖液室溫封閉,分別加入對(duì)應(yīng)I抗,4℃過(guò)夜孵育;加入HRP標(biāo)記的II抗。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法通過(guò)Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)成像,采用Quantity One分析軟件測(cè)定目的蛋白與相應(yīng)內(nèi)參照(β-actin)的灰度值,取其比值即為目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    應(yīng)用SPSS23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 轉(zhuǎn)染后實(shí)驗(yàn)組K1細(xì)胞中miR-206的相對(duì)表達(dá)量升高

    K1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后,RT-qPCR結(jié)果顯示,與空白組和陰性對(duì)照組相比較,實(shí)驗(yàn)組miR-206的相對(duì)表達(dá)量顯著升高(P<0.01),見圖1。

    Figure 1.The expression level of miR-206 in the PTC K1 cells transfected with miR-206 mimic.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖1 miR-206在甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞中的表達(dá)水平

    2 過(guò)表達(dá)miR-206抑制K1細(xì)胞的增殖能力

    CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的實(shí)驗(yàn)組中K1細(xì)胞的活力較空白組和陰性對(duì)照組明顯受到抑制(P<0.01),見圖2A。在活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)中,實(shí)驗(yàn)組存活K1細(xì)胞的數(shù)目較空白組和陰性對(duì)照組均明顯減少(P<0.01),見圖2B。

    3 過(guò)表達(dá)miR-206抑制K1細(xì)胞的遷移能力

    Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,培養(yǎng)24 h后實(shí)驗(yàn)組的遷移細(xì)胞數(shù)明顯低于空白組和陰性對(duì)照組(P<0.01),見圖3。這表明過(guò)表達(dá)miR-206可抑制K1細(xì)胞的遷移能力。

    Figure 2.The effect of miR-206 over-expression on the proliferation ability of PTCK1 cells.A:the cell viability was measured by CCK-8 assay;B:the living cell numbers were counted by the method of Trypan blue exclusion.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖2 miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K 1細(xì)胞增殖能力的影響

    Figure 3.The effect of miR-206 over-expression on the migration ability of PTC K1 cells(crystal violet staining,×100).Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖3 miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞遷移能力的影響

    4 K1細(xì)胞中miR-206靶向調(diào)控c-Met基因

    通過(guò)TargetScan 7.1軟件檢索miR-206的靶基因,發(fā)現(xiàn)c-Met基因的3′UTR上存在1個(gè)潛在的miR-206結(jié)合位點(diǎn),見圖4A。雙螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)結(jié)果顯示,在K1細(xì)胞中,與空白組(0.97±0.07)和陰性對(duì)照組(0.96±0.03)相比,miR-206過(guò)表達(dá)能夠顯著抑制野生型c-Met3′UTR的相對(duì)螢光素酶活性(0.51±0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);當(dāng)c-Met基因3′UTR中的miR-206結(jié)合位點(diǎn)發(fā)生突變后,miR-206過(guò)表達(dá)對(duì)靶基因的抑制作用消失,即miR-206 mimic轉(zhuǎn)染組的相對(duì)螢光素酶活性(0.99±0.08)與空白組和陰性對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05),見圖4B。以上結(jié)果充分說(shuō)明,miR-206通過(guò)與c-Met基因的3′UTR相互作用,負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達(dá)。

    Figure 4.c-Met gene was directly targeted by miR-206 in PTC K1 cells.A:schematic diagram of c-Met 3′UTR targeted by miR-206;B:luciferase activity of the WTc-Met 3′UTR was dramatically inhibited in miR-206 mimic group.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖4 c-Met是miR-206的靶基因

    5 過(guò)表達(dá)miR-206可抑制K1細(xì)胞c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活

    Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-206 mimic的K1細(xì)胞中,p-Met、p-AKT和p-mTOR的蛋白水平與空白組和陰性對(duì)照組相比均明顯降低(P<0.01),而其總蛋白均未見明顯改變,見圖5。這提示miR-206過(guò)表達(dá)可抑制c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活,進(jìn)而抑制K1細(xì)胞的增殖和遷移能力。

    Figure 5.The protein levels of c-Met,p-Met,AKT,p-AKT,mTOR and p-mTOR after transfection with miR-206 mimic in PTCK1 cells.Mean±SD.n=3.**P<0.01 vs blank group or miR-NCgroup.圖5 轉(zhuǎn)染miR-206 mimic后,各組K1細(xì)胞中c-Met/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

    討 論

    甲狀腺癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤之一,女性發(fā)病率較男性高。而PTC為最常見的甲狀腺癌病理類型,約占甲狀腺癌的84%,它起源于濾泡上皮細(xì)胞,易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移[13]。miRNA是一類與惡性腫瘤密切相關(guān)的基因調(diào)控因子,且前期研究表明,多種miRNA在PTC細(xì)胞中均表達(dá)異常。miR-138-5p可能通過(guò)依賴性抑制LRRK2進(jìn)而抑制PTC細(xì)胞增殖[14];miR-497通過(guò)直接靶向調(diào)節(jié)AKT3抑制PTC細(xì)胞的活力和遷移[15]。盡管許多研究者對(duì)miRNA在PTC發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用進(jìn)行了大量研究,但由于其復(fù)雜性,PTC具體發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。

    研究表明,miR-206可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡等基本過(guò)程[16]。在許多人類惡性腫瘤中,miR-206發(fā)揮抑癌因子作用,例如在兒童急性髓系白血病中,miR-206通過(guò)靶向細(xì)胞周期蛋白D1發(fā)揮抑癌作用[17];在前列腺癌細(xì)胞中,miR-206 與 ANXA2 mRNA結(jié)合可能調(diào)控EMT信號(hào)通路,從而抑制其侵襲轉(zhuǎn)移[18]。本研究通過(guò)對(duì)PTCK1細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-206 mimic,發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組miR-206的相對(duì)表達(dá)量較空白組和陰性對(duì)照組顯著升高,表明轉(zhuǎn)染成功。采用CCK-8和活細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力,以及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力,發(fā)現(xiàn)K1細(xì)胞的增殖和遷移能力均明顯受到抑制,表明miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞增殖和遷移能力。

    PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是膜受體信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要途徑之一,在細(xì)胞增殖、遷移以及凋亡等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[19]。c-Met與HGF相結(jié)合后,細(xì)胞內(nèi)發(fā)生自身磷酸化,可激活PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路,誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生增殖、遷移等生物學(xué)反應(yīng)[20]。Zheng等[7]發(fā)現(xiàn) miR-206 可通過(guò)調(diào)控 c-Met基因表達(dá),抑制胃癌細(xì)胞的增殖及遷移。在肝癌中,miR-206亦可靶向調(diào)控功能靶點(diǎn)c-Met和Cdk6,以介導(dǎo)其抑癌作用[21]。有研究表明,95%以上的PTC組織中發(fā)現(xiàn)c-Met蛋白高表達(dá)[22]。本研究結(jié)果顯示,在K1細(xì)胞中,miR-206通過(guò)與c-Met基因的3′UTR相互作用,進(jìn)而負(fù)調(diào)控靶基因c-Met的表達(dá);且證實(shí)過(guò)表達(dá)miR-206后,p-Met、p-AKT和p-mTOR蛋白表達(dá)水平均降低。這提示K1細(xì)胞的增殖和遷移能力受到抑制,可能是由過(guò)表達(dá)miR-206降低c-Met蛋白的表達(dá)水平,進(jìn)而抑制下游AKT/mTOR信號(hào)通路的激活所致。

    綜上所述,miR-206可抑制甲狀腺乳頭狀癌K1細(xì)胞的增殖和遷移能力,其作用機(jī)制可能與miR-206抑制c-Met/AKT/mTOR信號(hào)通路激活有關(guān)。這不僅為研究miR-206抑制PTC增殖和轉(zhuǎn)移的具體機(jī)制提供了新的實(shí)驗(yàn)依據(jù),而且miR-206/c-Met或可成為PTC臨床靶向治療中一個(gè)新的分子干預(yù)靶點(diǎn)。

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