miR-133靶向NLRP3對(duì)小鼠Kupffer細(xì)胞炎性活化的影響*

徐秀亮， 楊江華， 盛皓宇， 梁曼曼， 陳 聰， 魯 稻， 江啟貴

（1池州市人民醫(yī)院感染科，安徽池州247000；2皖南醫(yī)學(xué)院附屬弋磯山醫(yī)院感染病科，安徽蕪湖241001）

庫(kù)普弗細(xì)胞（Kupffer cells，KCs）是肝臟中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的單核-巨噬細(xì)胞群，可吞噬異物，可生成炎癥因子導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，其持續(xù)激活可促使非酒精性脂肪性肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）等發(fā)生［1］。而NAFLD可誘發(fā)肝臟脂肪變性和脂肪纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝癌，危害嚴(yán)重［2］。因此，減輕KCs介導(dǎo)的肝損傷可緩解疾病。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）參與炎癥、肝細(xì)胞損傷和肝纖維化等過(guò)程［3］，肝損傷和肝纖維化的乙型肝炎肝組織中miR-133高表達(dá)可能會(huì)介導(dǎo)慢性炎癥影響疾病進(jìn)程［4］，但miR-133在KCs中的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)分離小鼠KCs，并經(jīng)脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)，探究 miR-133在KCs炎性活化中的作用。

材料和方法

1 動(dòng)物

清潔級(jí)BALB/c小鼠，雄性，6～9周，體重（15～22）g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK（京）2017-0021，飼養(yǎng)條件：溫度（21±1）℃、濕度（50±10）%，光照/黑暗（12 h/12 h），自由飲水飲食。

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)池州市人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核并批準(zhǔn)。

2 藥品、試劑及儀器

LPS（貨號(hào)為 L4391-1MG）購(gòu)自 Sigma；miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC、miR-133 mimic、Lipofectamine 2000、核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）3′UTR-WT和NLRP3 3′UTR-MUT均由廣州銳博生物設(shè)計(jì)并合成；引物由上海生工生物有限公司合成。TIANscript RT Kit（貨號(hào)為 KR104）和 miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號(hào)為KR211）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒、兔抗鼠NLRP3抗體、兔抗鼠含胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC）抗體、兔抗鼠caspase-1抗體和兔抗鼠GADPH抗體均購(gòu)自Abcam，貨 號(hào) 分 別 為 ab9722、ab1793、ab214185、ab175449、ab1872和ab181602；雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)為D0010）由北京索萊寶科技有限公司生產(chǎn)。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）儀由ABI生產(chǎn)，型號(hào)為7500；全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)自深圳市三利化學(xué)有限公司，型號(hào)為ZF-388。

3 方法

3.1 小鼠肝臟KCs的分離和培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前DMEM培養(yǎng)液添加10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素混勻，置于4℃冰箱中制成DMEM完全培養(yǎng)液待用。采用膠原酶原位灌注加雙層梯度離心法獲得小鼠KCs［5］：麻醉小鼠分離消化肝臟，200目濾網(wǎng)過(guò)濾后加100μL PBS稀釋，1∶1加50%等滲Percoll溶液（stock isotonic Percoll，SIP）制成25%SIP，150×g離心15 min，分層由上往下為細(xì)胞碎片層、25%SIP層、KCs層、50%SIP層和其它層，小心吸取KCs置于新的EP管中，PBS稀釋，1 200 r/min離心5 min，沉淀為KCs。KCs置于DMEM完全培養(yǎng)液中，在37℃、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，細(xì)胞分離6 h后加碳素墨水（終體積分?jǐn)?shù)為0.5%）再培養(yǎng)1 h，于顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬情況。

3.2 細(xì)胞分組 將經(jīng)鑒定正確的細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，分為正常（control）組、模型（model）組、miR-133 inhibitor對(duì)照（miR-133 inhibitor NC）組、miR-133 inhibitor組、miR-133 mimic對(duì)照（miR-133 mimic NC）組和miR-133 mimic組。除正常組外，其余各組添加1 mg/L LPS誘導(dǎo)［6］，各組參照Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)分別轉(zhuǎn)染miR-133 inhibitor NC、miR-133 inhibitor、miR-133 mimic NC和miR-133 mimic，培養(yǎng)24 h鑒定各組細(xì)胞中miR-133水平。

3.3 RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞中miR-133和NLRP3的mRNA水平 細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit、TIANscript RT Kit將其逆轉(zhuǎn)錄成第1鏈cDNA。miR-133的上游引物序列為5'-CAGCTGGTTGAAGGGGACCAAA-3′，下游引物序列為5'-GGTGGCTTATGTTTGTAATCCC-3′；U6的上游引物序列為5'-ATATGGACGCTTCAATT-3′，下游引物序列為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；NLRP3的上游引物序列為 5'-GACCATCGGCCGGACTAAAA-3′，下游引物 序 列 為 5'-CTTGCACACTGGTGGGTTTG-3′；GAPDH的上游引物序列為5'-GGTTGTCTCCTGCGACTTCA-3′，下 游 引 物 序 列 為 5'-CCCTAGGCCCCTCCTGTTAT-3′。RT-qPCR 體系：10 μL 2×SYBR qPCR Mix，1 μL cDNA（40 ng/L），上、下游引物（10μmol/L）各0.5μL，8μL ddH2O。反應(yīng)條件：94℃120 s；95℃ 40 s，62℃ 35 s，共 45 個(gè)循環(huán)。2-ΔΔCt法計(jì)算miR-133和NLRP3相對(duì)表達(dá)水平。

3.4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中炎癥因子IL-1β和TNF-α水平 鑒定成功各組細(xì)胞，收集細(xì)胞培養(yǎng)液，300×g離心5 min收集上清，分裝置于4℃冰箱待用。嚴(yán)格按照小鼠IL-1β和TNF-αELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)上清液中IL-1β和TNF-α水平。

3.5 Westerm blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中NLRP3、ASC和caspase-1蛋白水平 按3.2培養(yǎng)細(xì)胞并鑒定成功，每孔加200μL蛋白裂解液冰上裂解15 min，10 000×g離心20 min，上清為總蛋白。凝膠電泳分離蛋白質(zhì)后轉(zhuǎn)膜；5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；加入各種Ⅰ抗（抗NLRP3、ASC、caspase-1和GADPH抗體），4℃孵育過(guò)夜；加入相應(yīng)Ⅱ抗，室溫孵育1 h。DAB顯色試劑盒避光顯色，全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)拍照和定量分析。

3.6 雙螢光素酶鑒定miR-133與NLRP3的靶向關(guān)系 用TargetScan查找NLRP3 mRNA的3′-UTR與miR-133結(jié)合位點(diǎn)。設(shè)計(jì)合成NLRP3的3′UTR-WT和 3′UTR-MUT，分別與 miR-133 mimic 或 miR-133 mimic NC共轉(zhuǎn)染，雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組螢光素酶相對(duì)活性。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）描述，兩兩比較采用SNK-q法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 LPS對(duì)KCs的影響

培養(yǎng)4 h的KCs呈圓形，細(xì)胞邊緣有較強(qiáng)的折光現(xiàn)象；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)至24 h時(shí)KCs呈星形，細(xì)胞開(kāi)始向周圍伸展；培養(yǎng)至72 h時(shí)KCs呈長(zhǎng)梭形，體積較24 h時(shí)較大，邊界清晰，見(jiàn)圖1A。細(xì)胞中可見(jiàn)大量黑色顆粒，該顆粒是添加碳素墨水后的碳顆粒，證明該細(xì)胞具有較強(qiáng)的吞噬功能，該細(xì)胞即為KCs，見(jiàn)圖1B。與正常組相比，模型組細(xì)胞中miR-133水平降低（P＜0.05）；與模型組、miR-133 inhibitor對(duì)照組和miR-133 mimic對(duì)照組相比，miR-133 inhibitor組細(xì)胞中miR-133水平降低（P＜0.05），miR-133 mimic組細(xì)胞中miR-133水平升高（P＜0.05），見(jiàn)圖1C。

2 miR-133在LPS作用于KCs后對(duì)炎癥的影響

與正常組相比，模型組細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平、培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05）；與模型組、miR-133 inhibitor對(duì)照組和miR-133 mimic對(duì)照組相比，miR-133 inhibitor組細(xì)胞中NLRP3 mRNA水平、培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平升高（P＜0.05），miR-133 mimic組細(xì)胞中 NLRP3 mRNA水平、培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平及NLRP3和caspase-1蛋白水平降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 雙螢光素酶驗(yàn)證miR-133與NLRP3的靶位點(diǎn)

TargetScan分析發(fā)現(xiàn)，NLRP3 mRNA 的 3′-UTR含有miR-133序列保守堿基。螢光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與 miR-133 mimic NC+3′UTR-WT 組相比，miR-133 mimic+3′UTR-WT組細(xì)胞螢光素酶相對(duì)活性下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

討 論

Figure 1.Influence of LPSon KCS.A：the shape of KCs（scale bar=100μm）；B：identification of KCs（scale bar=50μm；black arrows indicate carbon particles）；C：expression level of miR-133 in cells of each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.圖1 LPS對(duì)KCs的影響

miRNA靶向mRNA參與炎癥反應(yīng)應(yīng)用廣泛，可直接降解靶基因mRNA或抑制靶基因翻譯實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄后的基因沉默［7-9］，其中miR-133屬常見(jiàn)miRNA，包括miR-133a和miR-133b兩個(gè)成員，miR-133a在肝纖維化中具有抗纖維化作用，對(duì)肝臟起保護(hù)作用［10］；在炎癥誘導(dǎo)的大腸癌中表達(dá)下調(diào)，可能參與從腸道炎癥到癌變過(guò)程［11］。miR-133b在肝癌中水平降低，在肝損傷期間產(chǎn)生新的肝細(xì)胞反應(yīng)中起著作用［12］；在變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻粘膜中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-133b通過(guò)靶向NLRP3可改善鼻摩擦、打噴嚏的頻率以及細(xì)胞因子TNF-α、IL-4、IL-5和IFN-γ水平從而緩解變應(yīng)性炎癥和過(guò)敏癥狀［13］。推測(cè)miR-133影響疾病發(fā)生。本研究顯示，與正常組相比，模型組細(xì)胞中miR-133水平降低，提示miR-133在LPS誘導(dǎo)的KCs炎癥中表達(dá)下調(diào)，可能參與NAFLD炎癥及肝損傷過(guò)程，但其具體機(jī)制尚不清楚。與miR-133 inhibitor對(duì)照組相比，miR-133 inhibitor組細(xì)胞中miR-133水平降低；與miR-133 mimic對(duì)照組相比，miR-133 mimic組細(xì)胞中miR-133水平升高，本研究miR-133轉(zhuǎn)染成功。miR-133轉(zhuǎn)染情況不同，可能影響靶基因表達(dá)從而影響參與疾病反應(yīng)。

NLRP3屬目前研究較多的炎癥小體，NLRP3炎癥小體激活誘導(dǎo)肝臟炎癥和纖維化的介質(zhì)［14-15］，在LPS誘導(dǎo)的小鼠炎癥性肝損傷中抑制NLRP3表達(dá)可降低肝臟中IL-1β、IL-18、IL-6和TNF-α水平，緩解炎癥，減輕肝損傷［16］。本研究顯示，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中NLRP3 mRNA和蛋白水平升高，提示LPS誘導(dǎo)可激活NLRP3，活化后的NLRP3發(fā)揮致炎作用。進(jìn)一步研究TargetScan預(yù)測(cè)檢測(cè)到NLRP3 mRNA的3′UTR含有miR-133序列保守堿基，螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-133與NLRP3存在直接靶向結(jié)合位點(diǎn)，miR-133可通過(guò)直接靶向NLRP3而發(fā)揮作用。NLRP3激活后募集ASC并活化caspase-1，進(jìn)而發(fā)揮致炎作用［17］。caspase-1可促進(jìn)分泌IL-1β和TNF-α的分泌，從而加重炎癥反應(yīng)［18］。IL-1β在NAFLD中高表達(dá)，高水平IL-1β可增加NAFLD實(shí)質(zhì)損害和脂肪性肝炎［19］；抑制TNF-α可改善NAFLD腸道微生態(tài)系統(tǒng)，可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)血糖，脂質(zhì)代謝和保護(hù)肝臟免受NAFLD損害［20］。本研究表明，與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞中caspase-1蛋白水平及細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-1β和TNF-α水平升高，炎癥反應(yīng)劇烈；降低miR-133水平可激活NLRP3，增加caspase-1活化，加重炎癥反應(yīng)；升高miR-133水平則降低炎癥因子IL-1β和TNF-α各水平，減弱炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)KCs的保護(hù)。

綜上所述，miR-133在KCs炎癥活化中低表達(dá)，增加miR-133水平可通過(guò)靶向NLRP3減輕小鼠KCs炎癥，實(shí)現(xiàn)對(duì)KCs的保護(hù)作用。本文首次證實(shí)miR-133在LPS誘導(dǎo)的KCs中低表達(dá)，高表達(dá)miR-133可通過(guò)靶向NLRP3發(fā)揮抑制炎癥作用。但本文只在細(xì)胞水平上初步探討miR-133在KCs中的作用情況，是否對(duì)臨床是否有意義尚需深入研究。

Figure 2.The effect of miR-133 on inflammation of KCs after LPSinduction.A：the mRNA expression level of NLRP3 in cells of each group；B：the levels of IL-1β and TNF-α in cell culture medium of each group；C：the protein levels of NLRP3，ASC and caspase-1 in each group.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs model group；△P＜0.05 vs miR-133 inhibitor NCgroup；□P＜0.05 vs miR-133 mimic NCgroup.圖2 miR-133在LPS作用于KCs后對(duì)炎癥的影響

Figure 3.Target relationship verification between miR-133 and NLRP3.A：TargetScan prediction results；B：luciferase experimental verification results.Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs miR-133 mimic NC+3′UTR-WTgroup.圖3 miR-133與NLRP3的靶向關(guān)系驗(yàn)證