妊娠期脂多糖暴露通過激活子代小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)大鼠孤獨癥樣行為*

俸 笛，陳保林，肖 露，楊 亭，陳 潔，孫五慶

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒童營養(yǎng)研究中心，國家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，兒童營養(yǎng)與健康重慶市重點實驗室，兒童發(fā)育疾病研究教育部重點實驗室，兒童發(fā)育重大疾病國家國際科技合作基地，重慶400014）

孤獨癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是1943年由Kanner提出的一組以社會交往障礙以及重復(fù)刻板行為為特征的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾?。?］。盡管ASD的患病率在世界范圍內(nèi)呈逐年上升趨勢［2］，但其具體發(fā)病機制尚不清楚，防治方法非常受限，給ASD患兒的家庭帶來了嚴重的負擔(dān)。臨床研究表明妊娠期間的母源性免疫激活（maternal immune activation，MIA）會對發(fā)育中的胎兒產(chǎn)生影響，增加其子代患自閉癥的風(fēng)險［3］。

小膠質(zhì)細胞是腦內(nèi)重要的免疫細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷的主要防御細胞［4］。一般認為小膠質(zhì)細胞有兩種不同的表型，即具有促炎功能的M1型和具有免疫抑制功能的M2型［5］。有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥細胞因子的增加及小膠質(zhì)細胞的持續(xù)激活可能導(dǎo)致機體呈慢性炎癥狀態(tài)，引起神經(jīng)損傷及發(fā)育障礙［6］。同時有學(xué)者發(fā)現(xiàn)孤獨癥患者大腦中存在免疫功能異常［7］。Toll樣受體 4（Toll-like receptor 4，TLR4）是一種跨膜受體，在腦組織中主要表達于神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞上，參與小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等的產(chǎn)生和分泌［8］。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是TLR4的特異性配體，通過脂多糖結(jié)合蛋白（lipopolysaccharide-binding protein，LBP）介導(dǎo)與CD14的結(jié)合，激活TLR4信號通路［9］。大鼠孕期腹腔注射LPS可模擬人類妊娠期感染，是一種較常見的MIA動物模型［10］，通過對其子代的行為學(xué)檢測，可觀察子代是否存在社會交往障礙、重復(fù)刻板等孤獨癥樣行為。因此，本研究利用LPS誘導(dǎo)妊娠期MIA大鼠模型，檢測仔鼠孤獨癥樣行為，分析小膠質(zhì)細胞不同亞型及TLR4表達水平的變化，探討小膠質(zhì)細胞表型與孤獨癥樣行為的相關(guān)性。同時體外培養(yǎng)N9小膠質(zhì)細胞系，利用TLR4抑制劑TAK242，探討小膠質(zhì)細胞分型與TLR4的聯(lián)系。

材料和方法

1 實驗動物

SPF級健康雌性8周齡Sprague-Dawley（SD）大鼠24只，體質(zhì)量190～210 g，購買自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號為SCXK（渝）2018-0003，飼養(yǎng)于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院IVC（individually ventilated caging）級實驗動物中心，使用許可證號為SYXK（渝）2017-0012。所有動物實驗流程通過重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心實驗動物倫理委員會核準(zhǔn)。

2 實驗主要試劑

LPS（Sigma）；TLR4、離子鈣結(jié)合銜接分子 1（ionized calcium-binding adaptor molecule-1，IBA-1）、iNOS、精氨酸酶1（arginase-1，Arg-1）和GAPDH引物序列（北京華大公司）；總mRNA提取試劑盒和RIPA裂解液（BioTeke）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒（TaKaRa）；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（Bio-Rad）；抗IBA-1和iNOS抗體（Abcam）；抗Arg-1抗體（Genetex）；抗TLR4抗體（Santa Cruz）；IL-10及TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（RayBiotech）；LBP ELISA 試劑盒（Arigobio）。

3 實驗方法

3.1 實驗動物分組及模型構(gòu)建 參照Fernández等［11］及本實驗室已發(fā)表文獻［12-13］的方法構(gòu)建孤獨癥樣行為的大鼠模型。雌雄大鼠1∶1放入籠子過夜，第2天早晨觀察到陰栓的雌鼠記為懷孕第1天（gestation day 1，G1），并將其單獨飼養(yǎng)。如圖1所示，將24只孕鼠隨機平分成LPS組和磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）組（n=12），在G9.5時LPS組孕鼠腹腔注射100μg/kg LPS，PBS組腹腔注射等體積PBS。腹腔注射24 h后，每組孕鼠隨機抽取3只收集孕鼠血清檢測LBP及TNF-α，驗證模型構(gòu)建是否成功。每組剩余9只孕鼠待其自然生產(chǎn)（每只孕鼠產(chǎn)仔8～10只），本研究中每只母鼠哺乳8只仔鼠，即每組仔鼠共72只（n=72）。為排除不同行為學(xué)測試可能對大鼠腦組織產(chǎn)生影響，每組隨機抽取42只子代大鼠在生后第42～56天分別進行三箱社交實驗（n=14）、嗅覺適應(yīng)/去適應(yīng)實驗（n=14）及曠場實驗（n=14），每組剩余的30只仔鼠用于real-time PCR、Western blot、免疫熒光等實驗。

Figure 1.Diagramillustrating the experimental protocols in the rats in vivo.圖1 動物體內(nèi)實驗流程圖

3.2 生物標(biāo)本的采集及處理 孕鼠G9.5腹腔注射LPS或PBS24 h后，麻醉后股動脈取全血約2 mL，血標(biāo)本靜置0.5 h后以1 000×g離心15 min，留取上清，凍存于-80℃冰箱。各組子代大鼠8周齡時麻醉后冰上取腦前額葉皮質(zhì)，凍存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

3.3 N9細胞培養(yǎng)及處理 從液氮中取出N9細胞系，迅速復(fù)蘇后種于10 cm的培養(yǎng)皿中，加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液（內(nèi)含1%青霉素及鏈霉素），在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)液。待細胞傳至P3代后種于6孔板中，分為3組：（1）對照（control）組；（2）LPS組；（3）TAK242+LPS組。其中第3組予以50μmol/L TAK242干預(yù)4 h后加入3 mg/L LPS處理12 h，第2組則加入同等體積DMSO（TAK242的溶劑）處理4 h后予以3 mg/L LPS處理12 h。

3.4 real-time PCR檢測 提取前額葉皮質(zhì)或N9細胞總mRNA，將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在Bio-Rad實時熒光定量PCR儀上進行qPCR擴增。各目的基因以GAPDH為內(nèi)參照。IBA-1的上游引物序列為5′-TGGATGGGATCAACAAGCAC-3′，下游引物序列為5′-GGAGCCACTGGACACCTCTC-3′；Arg-1 的上游引物序列為5′-GGGAAGGTAATCATAAGCCAGA-3′，下游引物序列為5′-CCCAGATGACTTTTATGCGATG-3′；iNOS 的 上 游 引 物 序 列 為 5′-CGCTACACTTCCAACGCAACA-3′，下游引物序列為 5′-GAACAATCCACAACTCGCTCCA-3′；TLR4的上游引物序列為5′-TAGCCGCTCTGGCATCAT-3′，下游引物序列為 5′-GCATTGTCCTCCCACTCG-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CCTGGAGAAACCTGCCAAG-3′，下游引物序列為5′-CACAGGAGACAACCTGGTCC-3′。

3.5 Western blot檢測 取出凍存的前額葉皮質(zhì)腦組織，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE進行蛋白分離，恒流濕轉(zhuǎn)法冰上轉(zhuǎn)膜，BSA封閉，I抗孵育4℃過夜，PBST漂洗3次后加入相應(yīng)II抗室溫孵育1 h，PBST漂洗后ECL發(fā)光顯影。

3.6 ELISA檢測 采用ELISA測定母鼠血清LBP和TNF-α及子代大鼠前額葉皮質(zhì)中TNF-α和IL-10的含量，實驗步驟嚴格按照說明書操作。

3.7 組織免疫熒光染色 各組大鼠8周齡時行心臟灌注，將腦組織完整剝離放入4%多聚甲醛中固定，3 d后移入含30%蔗糖的4%多聚甲醛脫水，組織沉底后行冰凍切片。0.3%的Triton X-100打孔20 min，BSA封閉。I抗（抗IBA-1抗體，1∶500）4℃過夜。PBS漂洗3次后加入對應(yīng)的熒光II抗，室溫避光孵育1 h，PBS室溫避光洗3次后，滴加抗熒光淬滅劑，蓋上蓋玻片。在Nikon自動生物熒光顯微鏡下避光拍照。

3.8 行為學(xué)檢測

3.8.1 三箱社交實驗 采用透明塑料三箱，正式實驗前一天將大鼠依次從中間箱放入，讓其適應(yīng)5 min。測試當(dāng)天，陌生鼠箱放入一只同齡、同性別大鼠，玩具箱放入一個玩具，將被試大鼠再次從中間箱相同位置放入，ANY-maze軟件及配套攝像系統(tǒng)將自動記錄其在陌生鼠箱、玩具箱和中間箱的運動軌跡及時間，每只大鼠測試5 min。

3.8.2 嗅覺適應(yīng)/去適應(yīng)實驗 測試兩組大鼠對水、鼠尿和啤酒的興趣，采用一個干凈干燥的箱子作為觀察箱，被測大鼠放入觀察箱內(nèi)，使其依次嗅含有水、鼠尿和啤酒3種液體的棉簽，每種棉簽依次更換3支，每只大鼠共嗅9支棉簽。每支棉簽觀察時間3 min，分別記錄測試大鼠嗅不同棉簽的總時間。

3.8.3 曠場實驗 使用長寬高為50 cm×50 cm×45 cm的黑色塑料箱，依次將被試大鼠從測試箱正中間放入，每只大鼠測試時間10 min。在ANY-maze軟件上將測試區(qū)域劃分為9個相等面積的正方形區(qū)域（1個中間區(qū)和8個周圍區(qū)），攝像系統(tǒng)記錄其運動軌跡和跨線數(shù)。觀看錄像記錄每只大鼠在箱內(nèi)自梳理的時間。

3.9 細胞免疫熒光染色 將細胞爬片高溫消毒后加入24孔板中，在此接種上N9細胞，經(jīng)TAK242處理及LPS刺激后去除原培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定，PBST（含0.2%的Triton X-100）打孔，BSA封閉。I抗［抗TLR4抗體（1∶100）、抗iNOS抗體（1∶250）及抗Arg-1抗體（1∶400）］4℃孵育過夜，PBS漂洗3次后加入對應(yīng)的熒光II抗，室溫避光孵育1 h，PBS室溫避光洗3次后加入DAPI 20 min，清洗3次后取出蓋玻片，倒扣于滴加了抗熒光淬滅劑的載玻片上，Nikon熒光顯微鏡觀察。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 母鼠血清LBP及TNF-α水平變化

妊娠期予以LPS腹腔注射的母鼠血清LBP濃度較PBS組顯著升高（P＜0.01），同時伴有炎癥因子TNF-α分泌水平顯著增加（P＜0.05），見圖2。

Figure 2.The levels of serum LBP（A）and TNF-α（B）in the pregnant rats with different treatments.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖2 妊娠期不同處理組孕鼠血清LBP及TNF-α分泌水平

2 子代大鼠前額葉皮質(zhì)TLR4和IBA-1的表達變化

妊娠期給予LPS處理后的仔鼠前額葉皮質(zhì)中TLR4的mRNA和蛋白表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖3A、C；LPS組仔鼠前額葉皮質(zhì)中IBA-1的mRNA和蛋白表達水平也較PBS組顯著升高（P＜0.05），見圖3B、D。

3 子代大鼠前額葉皮質(zhì)iNOS和Arg-1的表達變化

LPS組仔鼠前額葉皮質(zhì)中iNOS的mRNA表達水平顯著高于PBS組（P＜0.05），而Arg-1的mRNA表達水平卻顯著低于PBS組（P＜0.05），見圖4A、B。同時Western blot結(jié)果顯示，LPS組iNOS的蛋白表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.05），而Arg-1的蛋白表達水平卻較PBS組降低（P＜0.01），進一步比較顯示，LPS組子代大鼠前額葉皮質(zhì)中iNOS/Arg-1表達水平比值較PBS組顯著增加（P＜0.01），見圖4C。

4 子代大鼠前額葉皮質(zhì)TNF-α及IL-10水平變化

ELISA結(jié)果顯示，LPS組仔鼠前額葉皮質(zhì)TNF-α表達水平較PBS組顯著升高（P＜0.01），而IL-10濃度卻較PBS組顯著降低（P＜0.01），見圖5A、B。

5 子代大鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞形態(tài)學(xué)變化

免疫熒光結(jié)果顯示，PBS組小膠質(zhì)細胞的胞體濃縮，多向分支豐富且明顯，而LPS組的小膠質(zhì)細胞分支消失，胞體增大、松散；統(tǒng)計分析每20個小膠質(zhì)細胞內(nèi)有分支的細胞數(shù)，結(jié)果表明LPS組具有分支的小膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著少于PBS組（P＜0.01），見圖5C。

6 行為學(xué)實驗

Figure 3.The mRNA（A，B）and protein（C，D）expression levels of TLR4（A，C）and IBA-1（B，D）in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖3 LPS組及PBS組子代大鼠前額葉皮質(zhì)中TLR4和IBA-1表達水平的變化

三箱社交實驗中，LPS組仔鼠停留在陌生鼠箱的時間顯著低于PBS組（P＜0.01），而在玩具箱的時間卻顯著高于PBS組（P＜0.01）；嗅覺適應(yīng)/去適應(yīng)實驗分別比較兩組大鼠嗅蒸餾水、鼠尿和啤酒3種棉簽的時間，觀察到LPS組的子代大鼠嗅同齡陌生大鼠尿液的時間少于PBS組（P＜0.01），而嗅蒸餾水及啤酒的時間無顯著差異；曠場實驗中，LPS組仔鼠在測試中跨線數(shù)顯著低于PBS組（P＜0.01），同時LPS組仔鼠在曠場中自梳理毛發(fā)時間卻顯著高于對照組（P＜0.01），見表1。

7 TAK 242處理后LPS誘導(dǎo)的N9細胞TLR4、iNOS及Arg-1表達的變化

LPS組TLR4的mRNA表達水平顯著高于control及TAK242+LPS組（P＜0.01或P＜0.05），同時iNOS的mRNA表達水平較其它兩組也有顯著升高，但Arg-1的mRNA表達水平則顯著下降（P＜0.01），見圖6A。與LPS組相比，TAK242+LPS組的TLR4熒光強度顯著降低（P＜0.01），見圖6B。免疫熒光雙染觀察顯示，LPS組小膠質(zhì)細胞中的iNOS高表達，以M1型為主，而TAK242+LPS組中則Arg-1高表達，以M2型為主；量化分析表明LPS組iNOS熒光強度顯著高于control組及TAK242組（P＜0.01），而Arg-1熒光強度則顯著降低（P＜0.01），進一步將iNOS/Arg-1比值進行比較，顯示LPS組iNOS/Arg-1比值顯著高于control及TAK242+LPS組（P＜0.01），見圖6C。

討 論

當(dāng)妊娠期間免疫系統(tǒng)被激活時，再與其它遺傳和/或環(huán)境因素相結(jié)合，就有可能會增加特定神經(jīng)發(fā)育障礙的發(fā)病風(fēng)險，這一觀點已逐漸達成共識［14］。過去30年的流行病學(xué)研究證實，女性妊娠期暴露于感染、炎癥以及分娩時的高危因素均會增加子代神經(jīng)發(fā)育性精神疾?。ㄈ缇穹至寻Y、孤獨癥）的風(fēng)險［15］。此外，動物模型研究表明，懷孕期間母體過度免疫反應(yīng)與子代生后大腦的變化及其行為發(fā)育存在密切的聯(lián)系［15］。孤獨癥兒童社會交流及交往障礙是最重要的癥狀，而嚙齒動物的社會交往問題主要表現(xiàn)為與同伴動物互動減少，對社會氣味（如鼠尿）［16］興趣降低，因此三箱社交實驗及嗅覺適應(yīng)/去適應(yīng)實驗是評估嚙齒動物社交能力的經(jīng)典方法［17-22］。本研究中，我們觀察到孕鼠LPS暴露后其子代大鼠與同伴交流的興趣顯著低于PBS組，而對玩具的興趣卻顯著升高，同時對社會性氣味的興趣顯著減少，提示母鼠妊娠期LPS暴露增加了其仔鼠社會交往障礙的風(fēng)險。孤獨癥另一癥狀為重復(fù)刻板性行為，這可以通過大鼠的自梳理行為來檢測［17-19］，同時大鼠在陌生環(huán)境中的活動和探索行為可以反映孤獨癥常伴有的焦慮等情緒問題［18-20］。曠場實驗結(jié)果顯示，妊娠期LPS暴露的仔鼠在陌生環(huán)境中的自主行為和探究行為減少，焦慮增加，而重復(fù)刻板行為增多。上述行為學(xué)結(jié)果表明妊娠期LPS暴露的母鼠所產(chǎn)仔鼠具有的孤獨癥樣行為與ASD兒童臨床表現(xiàn)基本一致。

Figure 4.The changes of iNOSand Arg-1 expression levels in the prefrontal cortex of the pups in LPSgroup and PBSgroup.A：the mRNA level of iNOS；B：the mRNA level of Arg-1；C：the protein levels of iNOSand Arg-1 and the ratio of iNOSto Arg-1.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PBSgroup.圖4 LPS組及PBS組子代大鼠前額葉皮質(zhì)中iNOS和Arg-1表達水平的變化

人群研究結(jié)果表明，在LPS刺激下，ASD患兒血清TLR4表達及IL-1β、IL-6和TNF-α含量較正常對照組增加［23］，且IL-6及TNF-α的表達水平與孤獨癥核心癥狀及異常行為的嚴重程度呈正相關(guān)［24］。同時觀察到孤獨癥患者大腦尸檢標(biāo)本中炎性細胞因子增加［7］，且免疫不耐受而導(dǎo)致的過敏、對疫苗過度反應(yīng)、嚴重感染和未確診的自身免疫性疾病等在ASD患者中更常見［25］。這些證據(jù)均提示免疫功能異常可能與孤獨癥密切相關(guān)。在本研究的動物模型中，我們也觀察到了具有孤獨癥樣行為的大鼠腦組織內(nèi)存在炎性細胞因子TNF-α增加、抗炎細胞因子IL-10減少、小膠質(zhì)細胞激活等免疫異?，F(xiàn)象，與上述人群中的研究結(jié)果相一致。Toll樣受體（Toll-like receptors，TLRs）表達在多種固有免疫細胞表面，在免疫激活過程中起著重要作用［26］。孕婦在妊娠期暴露于病原體或未知的損傷信號時，通過TLRs信號通路，特別是TLR4 信號通路，誘導(dǎo)先天免疫反應(yīng)［27-28］。LPS 是TLR4的特異性配體，通過LBP介導(dǎo)與CD14的結(jié)合，激活TLR4/NF-κB信號通路，參與炎癥應(yīng)答［29］。在本研究中，妊娠期腹腔注射LPS后，母鼠血清LBP及TNF-α表達均較PBS組升高，同時仔鼠前額葉皮質(zhì)中TLR4表達水平也顯著升高，表明妊娠期LPS處理激活了母鼠免疫反應(yīng)及子代大鼠腦組織中TLR4信號通路。TLR4在腦組織中主要表達于小膠質(zhì)細胞，它參與了小膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，并導(dǎo)致IL-1β、TNF-α、iNOS等的產(chǎn)生和分泌［8］。有研究顯示，使用TLR4信號通路抑制劑TAK242可抑制膿毒癥腦病小鼠腦內(nèi)小膠質(zhì)細胞的活化，從而改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能［30］。本研究中，我們觀察到母鼠孕期LPS暴露后仔鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)小膠質(zhì)細胞的數(shù)量增多，并伴有促炎細胞因子TNF-α分泌增加及抗炎細胞因子IL-10分泌減少，結(jié)合仔鼠前額葉皮質(zhì)內(nèi)TLR4表達增加，推測LPS誘導(dǎo)的MIA模型可能通過子代TLR4信號通路激活了前額葉皮質(zhì)內(nèi)的小膠質(zhì)細胞。

Figure 5.The changes of TNF-α（A）and IL-10（B）levels and observation of microglial branches（C）in the prefrontal cortex of pups in PBSgroup and LPSgroup.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=4.**P＜0.01 vs PBSgroup.圖5 不同處理組仔鼠前額葉皮質(zhì)中TNF-α和IL-10的表達及小膠質(zhì)細胞分支的觀察

表1 妊娠期不同處理仔鼠成年期相關(guān)行為學(xué)測試Table 1.The associated behavior tests of the pups treated by different challenge during gestation period（Mean±SD.n=14）

Figure 6.The changes of TLR4，iNOSand Arg-1 expression levels in the N9 cells induced by LPSafter TAK242 treatment.A：the mRNA levels of TLR4，iNOSand Arg-1 in the N9 cells；B：the immunofluorescence staining of TLR4 in the N9 cells；C：the immunofluorescence observation of iNOSand Arg-1 in the N9 cells.The scale bar=50 μm.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs LPSgroup.圖6 TAK 242處理后LPS誘導(dǎo)的N9細胞中TLR4、iNOS及Arg-1表達的變化

小膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要免疫細胞，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷及免疫激活的第一道防御［4］。小膠質(zhì)細胞參與突觸修剪，清除功能異常的突觸以保持大腦的正常功能［31］。Rodriguez等［32］的研究顯示，ASD患者存在突觸修剪錯誤，小膠質(zhì)細胞參與了ASD的發(fā)病。Morgan等［33］將ASD患者死后大腦用小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物（IBA-1和HLA-DR）進行免疫染色，觀察到ASD患者額葉島葉及背外側(cè)前額葉皮層、視覺皮層及小腦中被激活的小膠質(zhì)細胞數(shù)量增加，同時在背外側(cè)前額葉皮層小膠質(zhì)細胞存在空間結(jié)構(gòu)異常。Edmonson等［34］也觀察到在ASD患者前額葉皮質(zhì)及小腦中存在神經(jīng)膠質(zhì)細胞異常激活。這些大量的研究證據(jù)表明，小膠質(zhì)細胞活性與ASD密切相關(guān)。小膠質(zhì)細胞具有巨大的形態(tài)和功能可塑性［35］，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的小膠質(zhì)細胞被激活后，表現(xiàn)為分支回縮，由高分化的薄胞體轉(zhuǎn)變?yōu)榉种л^少的阿米巴樣細胞［36-38］。本研究顯示，在具有孤獨癥樣行為的大鼠腦組織中不僅檢測到前額葉皮質(zhì)內(nèi)IBA-1表達水平顯著升高，同時觀察到小膠質(zhì)細胞分支消失，胞體增大、松散，而且PBS對照組的小膠質(zhì)細胞胞體呈濃縮狀態(tài)，多向分支豐富明顯，進一步表明妊娠期LPS暴露激活了子代大鼠前額葉皮質(zhì)中的小膠質(zhì)細胞。被激活的小膠質(zhì)細胞存在M1和M2兩種表型，M1表型是經(jīng)典的活化類型，可誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、TNF-α及iNOS分泌，引起細胞死亡或組織損傷。而M2型包括選擇性激活和獲得性失活兩種狀態(tài)，前者可分泌IL-4和IL-13，具有抗炎及促進組織修復(fù)的作用，后者可攝取凋亡細胞或促進抗炎細胞因子IL-10及TGF-β分泌，減輕急性炎癥反應(yīng)［5］。有趣的是，我們的研究也檢測到妊娠期LPS暴露使子代ASD樣大鼠前額葉皮質(zhì)中M1型小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物iNOS表達顯著增加，而M2型小膠質(zhì)細胞標(biāo)志物Arg-1表達顯著減少，從而導(dǎo)致M1/M2比例失衡，結(jié)合LPS組前額葉皮質(zhì)TNF-α含量升高、IL-10降低的結(jié)果，進一步表明妊娠期LPS暴露可導(dǎo)致子代大鼠前額葉皮質(zhì)小膠質(zhì)細胞向M1型極化，促進炎性細胞因子分泌，減少抗炎細胞因子產(chǎn)生。

TAK242為TLR4的特異性抑制劑，可下調(diào)TLR4下游信號分子MyD88和TRIF的表達［39］。而在體外實驗中，我們觀察到TAK242預(yù)處理可抑制LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞向M1型的轉(zhuǎn)變，證明小膠質(zhì)細胞的分型極化依賴于TLR4信號通路的激活，但TLR4信號通路如何調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化的分子機制，還有待于我們今后的深入研究。

綜上所述，我們的研究顯示，母鼠妊娠期LPS暴露引起的MIA可上調(diào)子代前額葉皮質(zhì)中TLR4表達水平，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細胞異?；罨?，即向M1型極化，引起M1/M2比例失衡，促進炎性細胞因子分泌，而抗炎性細胞因子減少。這可能是引起子代大鼠產(chǎn)生孤獨癥樣行為的一個致病因素，也為我們下一步研究提供了一定的實驗基礎(chǔ)。