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    1-磷酸鞘氨醇抑制TGF-β誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化*

    2020-06-09 02:41:50湯石林彭良善趙正亮譚一清王橋生
    中國病理生理雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:功能

    湯石林, 彭良善, 趙正亮, 譚一清, 顏 波, 王橋生

    (南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,湖南衡陽421001)

    心肌纖維化(myocardial fibrosis,MF)是各種心肌損害發(fā)展至終末階段的共同病理特征,可誘發(fā)心律失常,心肌炎和心力衰竭,是導(dǎo)致心源性猝死的潛在危險(xiǎn)因素。因此,改善或逆轉(zhuǎn)MF是治療心血管疾病的重要策略[1]。MF是肌成纖維細(xì)胞過度增殖,膠原過度沉積及異常分布所引起的病理過程。以往研究認(rèn)為,肌成纖維細(xì)胞主要來源于局部組織中的成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞等。新近研究表明,血管內(nèi)皮細(xì)胞也是肌成纖維細(xì)胞的重要來源之一[2-3]。相關(guān)研究表明,內(nèi)皮細(xì)胞可在多種因素刺激作用下逐漸失去其形態(tài)和功能,并獲得間充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞表型及其生物學(xué)特性,即發(fā)生內(nèi)皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition,End-MT)[4]。因此,深入探究內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程可為MF的治療提供參考依據(jù)。

    1-磷酸鞘氨醇(sphingosine 1-phosphate,S1P)屬于鞘磷脂代謝產(chǎn)物,能夠通過S1P受體1~5(S1Preceptor 1~5,S1PR1~5)激活下游信號通路,調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、分化、增殖、遷移等生物學(xué)功能,或以胞內(nèi)第二信使的方式發(fā)揮其調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究證實(shí),S1P可通過S1PR1、S1PR3等參與調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移、分化等過程[5-6]。此外,S1P能夠顯著增加間充質(zhì)干細(xì)胞的抗纖維化能力[7],說明S1P可能在抑制心肌纖維化過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。但是,S1P抑制心肌纖維化的作用是否依賴S1PR以及End-MT是否在其中發(fā)揮功能,有待進(jìn)一步探討。

    Smads家族蛋白作為轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)受體下游重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子,在TGF-β誘導(dǎo)的End-MT經(jīng)典模型中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[8]。研究表明,在調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞分化過程中,S1PR1能夠抑制Smad3信號通路,進(jìn)而拮抗TGF-β功能[9]。然而,S1P介導(dǎo)的S1PR1信號途徑是否可通過調(diào)節(jié)Smad3信號通路影響TGF-β誘導(dǎo)的End-MT尚不明確。本研究擬通過人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)觀察S1P及其受體在TGF-β誘導(dǎo)的End-MT中的作用,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討,以期為抑制心肌纖維化及其誘發(fā)的心功能不全提供參考資料。

    材料和方法

    1 材料與試劑

    HUVECs購自ATCC。DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素和鏈霉素購自Gibco;小鼠抗人CD31單克隆抗體、小鼠抗人VE-cadherin單克隆抗體和重組人S1P蛋白購自Abcam;小鼠抗人α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體和兔抗人成纖維細(xì)胞特異性蛋白1(fibroblast-specific protein 1,F(xiàn)SP1)多克隆抗體購自 Sigma;兔抗人Smad3單克隆抗體和兔抗人p-Smad3抗體購自Thermo Fisher;小鼠抗人GAPDH單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠Ⅱ抗購自武漢博士德公司;其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

    2 方法

    2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVECs用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞狀態(tài),當(dāng)細(xì)胞融合度超過80%時(shí),采用0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞、傳代培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求,分為TGF-β(10 μg/L[10])組、TGF-β+S1P(200 nmol/L[11])組和 TGF-β+S1P+VPC23019(10 μmol/L[12];S1PR1抑制劑)組。

    2.2 Western blot實(shí)驗(yàn) 收集細(xì)胞裂解液,并用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白質(zhì)定量;SDS-PAGE上樣緩沖液(5×)矯正蛋白濃度,煮沸 5~8 min,冷卻,-20℃保存?zhèn)溆?。采用SDS-PAGE(80 V,30 min;120 V,90 min)分離蛋白;轉(zhuǎn)膜(200 mA,2 h);TBST封閉液(含5%脫脂奶粉)封閉2 h;按比例稀釋CD31、VE-cadherin、α -SMA、FSP1、GAPDH 和 p-Smad3抗體,4℃孵育過夜;TBST洗3次,每次10 min;辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗室溫孵育2 h,TBST洗3次,每次10 min;經(jīng)ECL顯影劑處理后,采用自動(dòng)化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)拍照分析。

    2.3 免疫熒光染色 24孔板培養(yǎng)細(xì)胞,加入處理因素后,PBS浸洗3次,每次3 min;4%的多聚甲醛固定細(xì)胞30 min,PBS浸洗3次,每次3 min;0.5%Triton X-100室溫通透30 min;PBS浸洗3次,每次3 min;正常山羊血清工作液室溫封閉30 min;棄封閉液,I抗工作液4℃孵育過夜;PBS浸洗3次,每次3 min;熒光Ⅱ抗37℃避光孵育1 h,PBS浸洗3次,每次3 min;倒置熒光相差顯微鏡拍照觀察。

    3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    以GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,組間比較采用方差分析或t檢驗(yàn),以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

    Western blot檢測End-MT相關(guān)標(biāo)志物的表達(dá),結(jié)果顯示,與TGF-β組相比,S1P+TGF-β組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin表達(dá)水平顯著增加(P<0.05),間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1表達(dá)水平則顯著降低(P<0.05),見圖1。

    2 S1P通過S1PR1降低TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

    Figure 1.S1Pinhibited TGF-β-induced End-MT.The expression of CD31(A),VE-cadherin(B),α-SMA(C)and FSP1(D)was determined by Western bolt.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs TGF-β group.圖1 S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

    為了進(jìn)一步證實(shí)S1PR1在S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT中的作用,我們采用S1PR1抑制劑VPC23019處理HUVECs。結(jié)果顯示,與S1P+TGF-β組相比,S1P+TGF-β+VPC23019組內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31和VE-cadherin的表達(dá)顯著降低(P<0.05),而間充質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA和FSP1的表達(dá)顯著增加(P<0.05),見圖2。

    3 S1PR1抑制劑VPC23019下調(diào)S1P作用下HUVECs中Smad3活性

    與TGF-β處理組相比,S1P顯著降低了HUVECs中Smad3的磷酸化水平,并抑制其核轉(zhuǎn)位(P<0.05);而添加S1PR1抑制劑VPC23019處理后,S1P降低Smad3磷酸化及核轉(zhuǎn)位的作用被逆轉(zhuǎn)(P<0.05),見圖3。

    討 論

    End-MT能夠進(jìn)一步增加間充質(zhì)或肌成纖維細(xì)胞,尋找調(diào)控End-MT的策略對有效控制和減輕心肌纖維化及其誘發(fā)的各類心血管疾病具有重要意義[13-14]。S1P作為細(xì)胞鞘脂類物質(zhì)的代謝活性物質(zhì),其相關(guān)信號通路在調(diào)節(jié)心肌纖維化進(jìn)程、內(nèi)皮細(xì)胞生存及功能過程中發(fā)揮重要作用。鑒于S1P在心肌及內(nèi)皮細(xì)胞中的功能,我們推測S1P可能通過介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化參與心肌功能的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,S1P具有抑制TGF-β誘導(dǎo)的HUVECs的End-MT功能,說明S1P抑制心肌纖維化的功能可能部分依賴于其對End-MT進(jìn)程的抑制作用。

    S1P作為胞內(nèi)第二信使,可直接特異性結(jié)合組蛋白脫乙酰酶 1/2(histone deacetylases 1/2,HDAC1/HDAC2),抑制其活性,進(jìn)而增強(qiáng)組蛋白H3乙酰化程度,促進(jìn)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[15]。HDAC1被證實(shí)在上皮-間 充 質(zhì) 轉(zhuǎn) 化(epithelial-to-mesenchymal transition,EMT)過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[16],而 End-MT 是EMT的一種特殊類型,提示S1P介導(dǎo)胞內(nèi)HDAC1的變化可能參與了其對End-MT的調(diào)節(jié)。S1PR1作為S1P在內(nèi)皮細(xì)胞中的受體之一,是介導(dǎo)S1P發(fā)揮功能的關(guān)鍵蛋白[17]。相關(guān)研究表明,S1P受體激動(dòng)劑FTY720能夠通過抗炎和抗凋亡途徑降低異位心臟移植后心肌纖維化水平[18]。本研究也表明,S1PR1抑制劑VPC23019能夠顯著逆轉(zhuǎn)S1P對TGF-β誘導(dǎo)的End-MT的作用,說明S1P抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT依賴S1PR1。

    另外,我們利用Western blot及免疫熒光染色證實(shí),S1P可能通過S1PR1途徑降低Smad3的磷酸化水平和核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而影響TGF-β誘導(dǎo)的End-MT進(jìn)程。然而,在本研究中,我們僅觀察了S1P-S1PR1軸對Smad3信號的影響,而S1P對TGF-β介導(dǎo)的End-MT的具體調(diào)節(jié)機(jī)制是否依賴于Smad途徑,以及是否存在非Smad依賴信號途徑尚不清楚。

    Figure 2.S1Pinhibited TGF-β-induced End-MTthrough S1PR1.The expression of CD31(A),VE-cadherin(B),α-SMA(C)and FSP1(D)was detected by Western bolt.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs TGF-β group;#P<0.05 vs TGF-β+S1Pgroup.圖2 S1P經(jīng)S1PR1途徑抑制TGF-β誘導(dǎo)的End-MT

    Figure 3.The effect of S1Pand S1PR1 on Smad3 signaling under the action of TGF-β.A:the phosphorylation level of Smad3 was detected by Western blot;B:the nuclear translocation of Smad3 was detected by immunofluorescence staining.Mean±SD.n=3.*P<0.05 vs TGF-β group;#P<0.05 vs TGF-β+S1Pgroup.圖3 S1P及S1PR1對TGF-β作用下Smad3信號的影響

    綜上所述,本研究在體外證實(shí)S1P-S1PR1可抑制TGF-β誘導(dǎo)的HUVECs的End-MT,其機(jī)制可能與Smad3磷酸化及核轉(zhuǎn)位有關(guān)。

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