PM 2.5通過p38 MAPK信號通路影響血管平滑肌細胞增殖和遷移*

李昕倡， 吳玉蓮， 吳 彤， 李 明， 葉 東， 羅雨淵， 李 巖△

（1廣州中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院，2廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院，廣東廣州510006）

隨著我國大氣污染形勢的日益嚴峻，大氣污染對人類健康的危害性逐漸被研究者所認識。除嚴重影響呼吸系統(tǒng)外，大氣污染與心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生也密切相關(guān)。多個流行病學研究顯示，大氣污染物濃度的升高可導致心血管疾病的發(fā)病率增高，住院和死亡人數(shù)明顯增加［1-2］，表明大氣污染與心血管疾病的發(fā)生密切相關(guān)［2-3］。細顆粒物（fine particulate matter，PM2.5）是大氣污染物中致病的主要成分，PM2.5與冠心病和動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的相關(guān)性已經(jīng)得到流行病學的證實，并被確認是新的AS致病危險因子。對于PM2.5致AS的作用機制，以往認為其主要是通過全身性炎癥反應(yīng)促進AS的發(fā)生，然而隨著研究證實PM2.5能跨過肺氣-血屏障進入血液循環(huán)［4］，其直接接觸并損傷血管已成為PM2.5致病機制的研究重點。目前對于PM2.5致AS的研究主要集中在其對血管內(nèi)皮細胞的影響上，如損傷血管內(nèi)皮細胞和引起炎癥反應(yīng)等［5-6］，但PM2.5對人血管平滑肌細胞（human vascular smooth muscle cells，HVSMCs）的影響尚不完全清楚。致病因子活化HVSMCs，影響細胞的增殖和遷移能力是AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵性環(huán)節(jié)［7］，因此本實驗用PM2.5直接染毒HVSMCs，觀察PM2.5對HVSMCs增殖和遷移的影響，并從p38 MAPK途徑探索其作用機制，揭示PM2.5的血管毒性作用和機制。

材料和方法

1 儀器與試劑

1.1 主要儀器 MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（SANYO）；H1850R高速冷凍離心機（長沙湘儀）；680型酶標儀、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀和凝膠成像儀（Bio-Rad）；MS800顯微鏡（Olympus）。

1.2 主要試劑 PM2.5（編號SRM 1649b，Sigma-Aldrich）；CCK-8試劑盒（日本同仁化學研究所）；抗MAPK抗體、抗phospho-MAPK-T180/Y182抗體、抗GAPDH抗體和HRP標記的II抗（ABclonal）；RIPA細胞裂解液及BCA蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物公司）；SB203580（批號129-56-6，Target Mol）。

2 實驗方法

2.1 細胞株 HVSMCs購自深圳華拓市生物科技有限公司，用含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

2.2 CCK-8法觀察PM2.5對HVSMCs活力的影響 取100μL（5×103個細胞）細胞懸液接種于96孔板內(nèi)，分為對照組（加入PBS）和不同濃度PM2.5染毒組（終濃度分別為6.25，12.5和25 mg/L），培養(yǎng)24 h后根據(jù)分組進行染毒，每組6個復孔，另設(shè)空白組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后根據(jù)試劑盒說明書每孔加入CCK-8溶液100μL，孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測定吸光度（A），計算細胞相對活力。細胞相對活力（%）=（染毒組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A值）×100%。

2.3 EdU法觀察PM2.5對HVSMCs增殖的影響取HVSMCs懸液1 mL（1×105個細胞）接種于24孔板內(nèi)預(yù)置的載玻片，培養(yǎng)24 h使細胞貼壁，分組同步驟2.2，按照分組進行染毒。染毒24 h后根據(jù)試劑盒說明書更換為含50μmol/L EdU的培養(yǎng)基繼續(xù)孵育3 h，然后按步驟依次進行固定和染色，并用Hoechst 33342標記細胞，在共聚焦顯微鏡下進行采樣觀察。

2.4 劃痕實驗觀察PM2.5對HVSMCs遷移的影響 取HVSMCs細胞懸液1 mL（5×105個細胞）接種于6孔板中，培養(yǎng)24 h后用100μL槍頭垂直在培養(yǎng)板中劃線，PBS清洗脫落的細胞，實驗分組和處理同上，按分組分別加入PBS和PM2.5進行染毒，分別于0 h和24 h對細胞進行觀察并拍照，測量劃痕面積并計算劃痕愈合率。劃痕愈合率（%）=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

2.5 Transwell法觀察PM2.5對HVSMCs遷移的影響 取200μL無血清細胞懸液（1×104個細胞）加入Transwell小室上室，實驗分組和處理同上，按照分組加入PBS和PM2.5染毒；下室加入含15%FBS的DMEM培養(yǎng)基500μL，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，取出上室用PBS清洗3次，多聚甲醛固定20 min，風干后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min，在顯微鏡下隨機選取5個視野拍照計數(shù)穿膜細胞數(shù)，用實驗組與對照組穿膜細胞數(shù)比值代表細胞遷移能力的變化。

2.6 Western blot法檢測p38 MAPK的磷酸化水平取HVSMCs懸液1 mL（5×105個細胞）接種于6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后用終濃度為12.5 mg/L的PM2.5對細胞進行染毒，另設(shè)對照組。分別在染毒后不同時點（20、40、60和120 min）用RIPA裂解液裂解細胞提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。取15μg蛋白進行SDS-PAGE，常規(guī)轉(zhuǎn)膜、BSA封閉、加入I抗（1∶1 000）4℃孵育過夜后用TBST洗滌3次，再加入II抗（1∶5 000）孵育2 h，最后加入ECL發(fā)光液曝光、拍照，使用ImageJ軟件對結(jié)果進行灰度值分析，計算磷酸化蛋白與總蛋白的比值。

2.7 p38 MAPK在PM2.5致HVSMCs增殖和遷移中的作用 實驗分為PM2.5組和SB203580+PM2.5組，其中PM2.5組僅給予12.5 mg/L的PM2.5進行染毒，SB203580+PM2.5組則先給予10μmol/L的SB203580干預(yù)2 h后，再給予相應(yīng)濃度的PM2.5進行染毒，在PM2.5染毒后用上述方法進行細胞增殖和遷移能力的檢測。

3 統(tǒng)計學處理

以GraphPad Prism 7軟件進行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果用均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），兩組樣本間檢測則采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 PM 2.5對HVSMCs增殖的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，在6.25～25 mg/L濃度范圍內(nèi)PM2.5染毒使HVSMCs的活力明顯增加，與對照組比較有顯著性差異（P＜0.01），其中在濃度為12.5 mg/L時作用效果最強，見圖1。實驗進一步采用EdU標記法來檢測細胞的增殖情況，也得到了類似的結(jié)果，可見視野內(nèi)綠染細胞數(shù)明顯增多，見圖2。上述兩個實驗證實PM2.5可促進HVSMCs的增殖。

Figure 1.The viability of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was measured by CCK-8 assay.Mean±SD.n=6.**P＜0.01 vs control group.圖1 CCK-8法檢測不同濃度PM2.5對HVSMCs活力的影響

Figure 2.The proliferation of HVSMCs exposed to PM2.5 for 24 h was detected by EdU staining.The scale bar=100μm.圖2 Ed U染色法檢測不同濃度PM2.5對HVSMCs增殖的影響

2 PM 2.5對HVSMCs遷移能力的影響

采用劃痕實驗和Transwell實驗分別檢測了PM2.5染毒對HVSMCs遷移能力的影響。劃痕實驗結(jié)果顯示，PM2.5染毒組劃痕面積在24 h時明顯較對照組減小，計算各組劃痕愈合率發(fā)現(xiàn)PM2.5染毒組細胞劃痕愈合率較對照組明顯增加（P＜0.05），見圖3A。Transwell實驗結(jié)果也顯示，PM2.5染毒后穿膜HVSMCs細胞數(shù)顯著增加，說明PM2.5染毒后細胞遷移能力增強，與劃痕實驗結(jié)果相一致，見圖3B。同時劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果也顯示12.5 mg/L濃度組對細胞遷移能力影響最強，因此選擇12.5 mg/L為最佳濃度進行后續(xù)實驗。

3 PM 2.5對p38 MAPK磷酸化的影響

我們根據(jù)上述結(jié)果以12.5 mg/L的PM2.5染毒HVSMCs，用Western blot法檢測p38 MAPK的磷酸化水平，結(jié)果顯示PM2.5染毒后HVSMCs胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK含量顯著增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學顯著性（P＜0.01），說明PM2.5染毒可活化p38 MAPK信號分子；研究結(jié)果還顯示p38 MAPK的活化在染毒后20 min時最強，這其他研究者的結(jié)果相類似，一般認為細胞受外界刺激后p38 MAPK激活較快且激活高峰往往出現(xiàn)在受刺激的早期，進而引起細胞增殖和遷移等行為學改變［8］。本部分結(jié)果提示PM2.5活化HVSMCs可能與上調(diào)p38 MAPK蛋白磷酸化水平有關(guān)，見圖4。

Figure 3.The migration ability of HVSMCs induced by PM2.5 was detected by scratch assay and Transwell method.A：scratch wound healingassay（×40）；B：Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group.圖3 PM 2.5對HVSMCs遷移能力的影響

Figure 4.The phosphorylation level of p38 MAPK in HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 treatment.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs20 min group.圖4 PM2.5對p38 MAPK磷酸化的影響

4 p38 MAPK在PM 2.5激活HVSMCs中的作用

SB203580是p38 MAPK分子的特異性阻斷劑，我們用SB203580預(yù)處理HVSMCs，結(jié)果顯示SB203580預(yù)處理可以顯著降低PM2.5引起p38 MAPK磷酸化，見圖4。因此我們用SB203580為工具來處理細胞，觀察阻斷p38 MAPK后HVSMCs在PM2.5刺激下的增殖和遷移變化，以此來明確p38 MAPK信號分子在PM2.5影響HVSMCs中的作用。CCK-8實驗和EdU染色實驗結(jié)果顯示，與PM2.5單獨作用組比較，SB203580+PM2.5組細胞的增殖能力顯著降低，說明阻斷p38 MAPK信號途徑降低了PM2.5促進HVSMCs增殖的效果，見圖5A、B。劃痕實驗和Transwell實驗結(jié)果則顯示，阻斷p38 MAPK信號后PM2.5對HVSMCs遷移能力的影響明顯減小，無論是劃痕愈合率還是穿膜細胞的比例，SB203580+PM2.5組均顯著低于PM2.5組（P＜0.05，P＜0.01），見圖5C、D。上述結(jié)果證實p38 MAPK信號途徑參與介導PM2.5促HVSMCs增殖和遷移過程。

討 論

Figure 5.The proliferation and migration ability of HVSMCs exposed to PM2.5 with or without SB203580 pre-treatment.A：the cell viability；B：EdU staining（scale bar=100μm）；C：scratch wound closure rate（×40）；D：the cell invasive rate detected by Transwell assay（×200）.Mean±SD.n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs PM2.5 group.圖5 SB203580預(yù)處理對PM2.5促HVSMCs增殖和遷移的影響

2013年Adar等［9］通過對5 660人長達2年半的觀察，發(fā)現(xiàn)PM2.5可加重動脈中層硬化（AS的前期病變），而降低PM2.5濃度能減緩疾病的進程，明確指出PM2.5可獨立致AS發(fā)生，其它多個研究也證實了該結(jié)論［1-3］。PM2.5已經(jīng)被公認為是AS等心血管疾病的重要致病因子，對其致病機理的研究是目前的重點［1］。

HVSMCs被致病因子激活，細胞增殖和遷移能力增強是AS發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵性步驟和重要病理改變，然而PM2.5對HVSMCs的影響并不完全清楚［7，10］。本實驗在體外培養(yǎng) HVSMCs，用 PM2.5直接染毒來觀察細胞增殖和遷移能力的變化。CCK-8法結(jié)果顯示在一定濃度范圍內(nèi)PM2.5染毒可明顯促進血管平滑肌細胞的活力，不同濃度PM2.5染毒組的細胞活力均顯著高于對照組；實驗還采用EdU染色法對細胞增殖情況進行了觀察，也得到了同樣的結(jié)果，證實PM2.5可促進HVSMCs的增殖。本研究還通過劃痕實驗發(fā)現(xiàn)PM2.5染毒也提高了血管平滑肌細胞的遷移能力，并用Transwell實驗的進一步證實了該結(jié)論。實驗還發(fā)現(xiàn)PM2.5影響HVSMC并無濃度依賴性，25 mg/L組細胞增殖和遷移能力低于12.5 mg/L組，這可能與隨著PM2.5濃度增高其非特異性細胞毒活性增強有關(guān)，以往也有研究發(fā)現(xiàn)在低濃度時PM2.5可促進氣管平滑肌細胞的遷移，而高濃度時則引起細胞死亡［11］，與本實驗結(jié)果相類似，但是對于其具體原因尚需進一步研究。因此，本實驗結(jié)果證實了在一定濃度范圍PM2.5染毒能激活血管平滑肌細胞，促進細胞的增殖和遷移能力，證實PM2.5可能通過影響HVSMCs來促進AS的發(fā)生。

p38 MAPK是絲裂原激活蛋白激酶超家族的重要成員，參與多種細胞的胞內(nèi)信號傳遞，貫穿細胞的生長、分化和死亡過程，特別在肌細胞分化中起著至關(guān)重要的作用［12］。研究顯示p38 MAPK被激活后進入HVSMCs細胞核，催化絲/蘇氨酸磷酸化引起下游基因轉(zhuǎn)錄，從而促進細胞的增殖和遷移［13］。多個研究證實激活p38 MAPK信號途徑是AS致病因子活化HVSMCs的主要方式之一，抑制p38 MAPK可阻止血管平滑肌細胞的增殖和遷移［14-15］。因此，我們選擇p38 MAPK通路初步探討了PM2.5影響HVSMCs的作用機制，結(jié)果顯示PM2.5刺激后HVSMCs胞內(nèi)磷酸化p38 MAPK增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學顯著性，說明PM2.5可激活p38 MAPK信號分子。本實驗還選擇了不同時點來觀察p38 MAPK的活化情況，結(jié)果顯示PM2.5染毒20 min時對p38 MAPK的活化作用最為明顯。其它研究者在包括血管平滑肌細胞在內(nèi)的多種細胞模型中也得到了類似的結(jié)果，并認為致病因子激活p38 MAPK是信號轉(zhuǎn)導的上游事件，迅速激活的p38 MAPK轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)引起細胞增殖、遷移和炎癥因子表達等變化［8，16］。由于 PM2.5成分較為復雜，其可能通過與細胞膜受體結(jié)合或直接進入細胞內(nèi)等多種方式來激活p38 MAPK分子，我們將在后繼實驗中分析并選取PM2.5的主要組分，對PM2.5激活p38 MAPK的具體途徑此進行研究。

為了進一步證實p38 MAPK活化與PM2.5引起的HVSMCs增殖和遷移的關(guān)系，我們用特異性信號分子阻斷劑SB203580預(yù)處理來阻斷p38 MAPK通路，然后觀察HVSMCs的增殖和遷移情況，結(jié)果顯示SB203580預(yù)處理可以抑制PM2.5誘導的p38MAPK活化，同時SB203580預(yù)處理組HVSMCs的增殖和遷移受到明顯抑制，通過上述兩方面的結(jié)果，本研究最終證實p38 MAPK介導了PM2.5誘導的血管平滑肌細胞增殖和遷移過程。

綜上所述，本實驗證實大氣污染物中的PM2.5可以促進HVSMCs細胞增殖和遷移能力，并證實p38 MAPK信號通路參與介導該過程，加深了對PM2.5的血管平滑肌細胞毒性及其致AS作用的認識，后續(xù)本課題組將從PM2.5如何激活p38 MAPK等方面深入研究其致心血管疾病的機理。