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    SUMO特異性蛋白酶3通過調(diào)控巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成*

    2020-06-09 02:41:38張永興倪煥爾李偉峰
    中國(guó)病理生理雜志 2020年5期
    關(guān)鍵詞:磷酸鈣極化主動(dòng)脈

    陳 陽, 張永興, 倪煥爾, 李偉峰, 汪 芳

    (上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院心內(nèi)科,上海200080)

    腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm,AAA)是腹主動(dòng)脈的永久性局部擴(kuò)張至正常腹主動(dòng)脈直徑的150%[1]。臨床AAA多發(fā)生在腎下動(dòng)脈處[2];破裂性AAA及其導(dǎo)致的相關(guān)病理生理損害的死亡率超過80%[3]。目前除了手術(shù)修復(fù),尚無藥物可以治療。因此,探究AAA的病理生理學(xué)調(diào)控機(jī)制,對(duì)于臨床腹主動(dòng)脈瘤的藥物防治靶點(diǎn)研發(fā)具有重要意義。

    在AAA中,病理改變可見血管平滑肌細(xì)胞的凋亡和缺失、炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)以及基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)表達(dá)上調(diào)等引發(fā)彈性蛋白斷裂和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的降解[4]。單核-巨噬細(xì)胞是參與AAA免疫應(yīng)答重要的炎癥細(xì)胞,在特定的免疫微環(huán)境下,骨髓單核細(xì)胞(M0)可以分化為促炎的巨噬細(xì)胞(M1型)或抗炎的巨噬細(xì)胞(M2型)[5]。而MMPs和許多促炎癥反應(yīng)因子,如腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNFα)等,由M1型巨噬細(xì)胞分泌產(chǎn)生,而M2型巨噬細(xì)胞則分泌抗炎細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素10(interleukin-10,IL-10)等。巨噬細(xì)胞M1/M2的失衡被認(rèn)為是AAA發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[6],同時(shí)也有研究報(bào)道巨噬細(xì)胞極化可以調(diào)控新生血管形成[7]。巨噬細(xì)胞在AAA免疫應(yīng)答中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[8],因此調(diào)控巨噬細(xì)胞極化的信號(hào)通路對(duì)于研究AAA發(fā)病機(jī)制具有重要意義。

    SUMO(small ubiquitin-related modifier)是一系列重要的類泛素蛋白,能對(duì)底物進(jìn)行翻譯后SUMO修飾(SUMOylation)[9]。SUMO 修飾是一個(gè)可逆過程,SUMO特異性蛋白酶家族(sentrin/SUMO-specific proteases,SENPs)能夠去除底物蛋白的SUMO修飾,或影響底物與其它蛋白質(zhì)的相互作用,從而影響底物的生物學(xué)效應(yīng)。有研究表明,SENP3敲除減少了脂多糖(lipolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Toll樣受體(Toll-like receptor,TLR4)炎癥信號(hào)的激活和促炎因子的產(chǎn)生,提高小鼠存活率[10]。目前已有證據(jù)顯示TLR4炎癥信號(hào)的激活能促進(jìn)巨噬細(xì)胞的極化,加重炎癥損傷[11-12]。此外,TLR4激活促進(jìn)AAA的調(diào)控關(guān)系也已被證明[13]。但SENP3在AAA病程中對(duì)巨噬細(xì)胞極化的影響尚不清楚。

    本課題組構(gòu)建SENP3單核細(xì)胞特異性敲除的小鼠,并通過磷酸鈣(calciumphosphate,CaPO4)誘導(dǎo)的AAA動(dòng)物模型,探討SENP3通過影響巨噬細(xì)胞的功能在AAA發(fā)生發(fā)展中的作用,以期進(jìn)一步闡釋調(diào)控AAA發(fā)生和進(jìn)展的潛在機(jī)制。

    材料和方法

    1 動(dòng)物

    C57BL/6野生型(wild type,WT)小鼠購于上海斯萊克動(dòng)物公司。C57BL/6背景的Senp3flox/flox(以下簡(jiǎn)稱WT)小鼠由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究中心產(chǎn)生,與C57BL/6背景的Lyz2-Cre小鼠雜交產(chǎn)生Senp3flox/flox;Lyz2-Cre(SENP3單核細(xì)胞特異性敲除,即條件性敲除,conditioned knockout,cKO)小鼠。嚴(yán)格按照中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部發(fā)布的《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物的護(hù)理和使用指南》中的規(guī)定進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),該方案已獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬機(jī)構(gòu)動(dòng)物護(hù)理和使用委員會(huì)的批準(zhǔn)[使用許可證號(hào)為SYXK(滬)2018-0027],所有手術(shù)均在戊巴比妥鈉麻醉下進(jìn)行,并盡一切努力使動(dòng)物痛苦最小化。本研究選用SPF級(jí)cKO小鼠以及同窩出生的WT小鼠,雄性,8~12周齡,體重20~22 g。小鼠飼養(yǎng)于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,飼以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料,溫度為(23±2)℃,濕度為50%±10%。

    2 主要試劑

    小鼠SENP3、β-actin、IL-1β和IL-6抗體購自Cell Signaling Technology;小鼠 CD206、CD86和 TNFα 抗體購自Abcam;小鼠MMP-9抗體購自Affinity;熒光素標(biāo)記的II抗(Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗鼠IgG、Alexa Fluor?488標(biāo)記的山羊抗兔IgG和Alexa Fluor?555標(biāo)記的山羊抗兔IgG)購自Invitrogen;生物素化羊抗小鼠IgG(1∶500)和生物素化羊抗兔IgG(1∶500)購自Jackson;免疫組化顯色試劑盒購自Vector Laboratories;胎牛血清(fetal bovine serum,F(xiàn)BS)購自Gibco;鼠源巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor,M-CSF)購自PeproTech;多聚甲醛購自Sigma;Western blot化學(xué)發(fā)光顯色劑購自中國(guó)上海圣爾生物科技有限公司;二水氯化鈣(calcium chloride dihydrate,CaCl2·2H2O)、磷 酸 鹽 緩 沖 液(phosphatebuffered saline,PBS)和Tween-20購自中國(guó)生工生物工程(上海)股份有限公司;TBS緩沖液購自上海索萊寶生物科技有限公司;二氫乙啶(dihydroethidium,DHE)染色液購自中國(guó)上海碧云天生物技術(shù)有限公司;戊巴比妥購自Sigma。

    3 主要方法

    3.1 改良磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠腎下AAA模型 參照現(xiàn)有研究,相對(duì)于傳統(tǒng)CaCl2模型,改良方法依次使用CaCl2和PBS誘導(dǎo)產(chǎn)生動(dòng)脈瘤所需時(shí)間較短[14]。我們選用同窩出生、C57BL/6背景的8~12周齡雄性小鼠,按基因型分成2組:WT組(n=20)和cKO組(n=18)。小鼠在戊巴比妥(100 mg/kg)麻醉下,無菌環(huán)境里先用0.5 mol/L CaCl2浸泡的棉球包裹游離的腹主動(dòng)脈孵育10 min,隨后改用PBS浸泡的棉球孵育5 min。消毒紗布小心吸干殘余液體,用無菌生理鹽水沖洗腹腔,減少其余組織損傷,結(jié)扎出血點(diǎn),關(guān)腹部縫合。造模時(shí)間為14 d。手術(shù)操作交由未知小鼠基因型與具體分組的人來完成。

    3.2 實(shí)驗(yàn)小鼠標(biāo)本的收集、處理和保存 在術(shù)后第2周,戊巴比妥麻醉小鼠后剖腹,體式顯微鏡下小心暴露腹主動(dòng)脈,剝離腹主動(dòng)脈動(dòng)脈周圍筋膜和脂肪組織,游離升主動(dòng)脈至腹主動(dòng)脈髂總動(dòng)脈分叉處,游標(biāo)卡尺測(cè)此處動(dòng)脈直徑。部分標(biāo)本放入凍存管中存放于液氮罐中,用于提取組織RNA進(jìn)行RT-qPCR實(shí)驗(yàn),以及提取組織蛋白進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)。另一部分標(biāo)本在操作過程中小心保持形態(tài)完整,在4%多聚甲醛溶液中固定48 h,再分成兩部分:(1)其中一些標(biāo)本經(jīng)過常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋制成蠟塊,將蠟塊制成4~5μm厚的連續(xù)切片,供HE染色、Verhoeff-van Gieson(VVG)特殊染色及免疫組織化學(xué)染色;(2)另一些標(biāo)本用最優(yōu)切片溫度(optimum cutting temperature,OCT)包埋劑包埋,制成動(dòng)脈橫截面7 μm厚的連續(xù)冰凍切片,用于免疫熒光和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的DHE染色。

    3.3 免疫組織化學(xué)染色法 石蠟切片置于60℃烘箱1 h,置于二甲苯I和二甲苯II中各15 min,再依次浸泡100%乙醇、100%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、75%乙醇和雙蒸水各5 min完成脫蠟。脫蠟后,石蠟切片置于抗原修復(fù)液(檸檬酸三鈉緩沖液,pH 6.0)中,95℃水浴修復(fù)6 min。PBS漂洗后封閉,經(jīng)I抗(兔抗小鼠SENP3多克隆抗體)4℃孵育過夜,生物素標(biāo)記的II抗(生物素化的羊抗兔IgG)室溫孵育2 h后在顯色液 A+B(1∶1)下孵育 1 h,DAB 顯色 5~10 min。適時(shí)終止后,經(jīng)梯度濃度乙醇脫水和二甲苯處理,用中性樹膠封片,在顯微鏡下觀察和拍照。

    3.4 小鼠骨髓原代單核細(xì)胞(bone marrow-derived monocytes,BMDMs)的提取和誘導(dǎo) 小鼠麻醉后,脫頸處死,無菌條件下取小鼠下肢骨,DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓,過40μm濾網(wǎng),室溫下500×g離心5 min,去除上清液后用含10%FBS和30μg/L M-CSF的DMEM培養(yǎng)基重懸,接種到10 cm培養(yǎng)皿,7 d后細(xì)胞分化為M0,之后分別用來進(jìn)行M1極化誘導(dǎo)[100 μg/L LPS+50μg/L干擾素γ(interferonγ,IFNγ)處理24 h]和 M2 極化誘導(dǎo)(20 μg/L IL-4 處理 24 h)[6,15]。BMDMs置于37°C、5%CO2培養(yǎng)箱,隔天換液。

    3.5 組織和細(xì)胞免疫熒光法 (1)組織免疫熒光:脫蠟步驟同3.4中所述,其余步驟與細(xì)胞免疫熒光步驟相似。(2)細(xì)胞免疫熒光:細(xì)胞用PBS清洗之后,迅速加含4%多聚甲醛的固定液,于4°C固定過夜;0.2%Triton X-100處理10 min,并用封閉液封閉1 h;CD86抗體(1.0 mg/L)4°C孵育過夜,次日用PBS洗3次后,熒光素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶500)在室溫下進(jìn)行染色標(biāo)記,然后觀察。細(xì)胞圖像通過DM2500型熒光顯微鏡(Leica)拍照。

    3.6 ROS的DHE染色法 DHE在ROS作用下脫氫后,可與RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光。冰凍切片用PBS清洗3次,每次5 min后,按1∶100工作濃度用PBS稀釋配制DHE染色液,每個(gè)樣品滴加50μL工作液,室溫下避光孵育60 min。然后同樣用PBS清洗3次,每次5 min。熒光顯微鏡觀察(最大激發(fā)波長(zhǎng)為300 nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為610 nm)。

    3.7 組織RNA抽提和RT-qPCR檢測(cè) TRIzol一步法提取小鼠腹主動(dòng)脈瘤體組織中的RNA后,利用NanoDrop 2000分光光度計(jì)檢測(cè)樣品RNA濃度,并注意A260/A280是否在1.8~2.0范圍,以判斷RNA提取過程中是否有污染。之后按照TaKaRa的PrimeScript?RT reagent Kit使用說明書,進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄操作。qPCR按照TaKaRa SYBR?Premix Ex Taq?(Perfect Real Time)Kit說明書,在冰上將擴(kuò)增體系中的各組分充分混勻后,使用LightCycler?480型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測(cè)。采用兩步法熒光定量PCR擴(kuò)增程序進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)束后檢查實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增曲線是否正常,融解曲線是否為單峰。計(jì)算公式:ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參照(GAPDH);ΔΔCt=ΔCt待測(cè)樣品-ΔCt對(duì)照樣品;相對(duì)表達(dá)量=2-ΔΔCt。引物由中國(guó)生工生物有限公司負(fù)責(zé)合成,主要引物序列見表1。

    表1 RT-qPCR引物序列Table 1.Sequences of the primers for RT-qPCR

    3.8 蛋白提取和Western blot RIPA緩沖液提取來自主動(dòng)脈或細(xì)胞的蛋白。將主動(dòng)脈組織速凍在液氮中,在RIPA緩沖液中通過組織研磨破碎儀粉碎,冰上靜置40~60 min,12 000×g、4℃離心15 min。然后將上清液轉(zhuǎn)移到新EP管用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。BCA protein assay kit測(cè)定其蛋白濃度,再根據(jù)樣品蛋白濃度,按蛋白總量30~50μg范圍內(nèi)計(jì)算出上樣體積。Western blot檢測(cè):組織蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜,5%脫脂奶粉37℃封閉1 h,TBST緩沖液洗3次,每次5 min,然后加入I抗(SENP3、TNFα、IL-1β和MMP9抗體均為1∶1 000稀釋,β-actin抗體為1∶5 000稀釋)于4℃孵育過夜;次日,加入II抗(1∶10 000)于37℃孵育1 h;用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)試劑顯影,顯影儀采用ImageQuant LAS4000(GEHealthcare)。

    4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

    以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,采用GraphPad Prism 8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。兩組間符合正態(tài)分布的計(jì)量資料比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn),兩組間等級(jí)資料比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。兩個(gè)率或兩個(gè)構(gòu)成比的比較采用Fisher確切概率法,生存分析比較采用Mantel-Cox檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    結(jié) 果

    1 SENP3調(diào)控巨噬細(xì)胞極化

    RT-qPCR結(jié)果顯示,SENP3 mRNA在M1型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)過程中表達(dá)升高(P<0.01),但是M2型巨噬細(xì)胞中表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖1A、B。細(xì)胞免疫熒光圖片中可見M1分化時(shí)細(xì)胞核內(nèi)SENP3蛋白表達(dá)升高,見圖1C。此外,在巨噬細(xì)胞受刺激由M1向M2型轉(zhuǎn)換時(shí),SENP3的mRNA表達(dá)降低(P<0.01),而在M2向M1型轉(zhuǎn)換時(shí),SENP3的mRNA表達(dá)升高(P<0.01),見圖1D、E。進(jìn)一步,細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示,cKO小鼠和其同窩出生的WT小鼠的原代BMDMs在誘導(dǎo)M1分化過程中,cKO組M1型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD86表達(dá)低于WT組,與之對(duì)應(yīng)的是,誘導(dǎo)M2分化時(shí)cKO組M2型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物CD206表達(dá)則高于WT組,見圖1F。

    Figure 1.SENP3 expression was up-regulated during M1 polarization and M1/M2 transformation.A and B:the BMDMs from wildtype(WT)mice were isolated,cultured and treated with M1 stimulation(100 μg/L LPS+50 μg/L IFNγ)(A)or M2 stimulation(20μg/L IL-4)(B)for 24 h,and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR;C:the BMDMs from WTmice were treated with M1 stimulation(100μg/L LPS+50μg/L IFNγ)or M2 stimulation(20μg/L IL-4)for 24 h,and immunofluorescence was conducted to analyze SENP3 protein expression(red:SENP3;blue:DAPI);D:the BMDMs from WT mice were cultured in DMEM containing 100μg/L LPS+50μg/L IFNγfor 24 h,and then in DMEM containing 100μg/L LPS+50μg/L IFNγor 20μg/L IL-4 for another 24 h,and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR;E:the BMDMs from WT mice were cultured in DMEM containing 20μg/L IL-4 for 24 h,and then in DMEM containing 20μg/L IL-4 or 100μg/L LPS+50μg/L IFNγfor another 24 h,and the mRNA expression of SENP3 was detected by RT-qPCR;F:BMDMs isolated from WT and cKO mice were cultured and treated with M1 stimulation(100μg/L LPS+50μg/L IFNγ)or M2 stimulation(20μg/L IL-4)for 24 h,and the M1 marker or M2 marker was measured by immunofluorescence(red:CD206;green:CD86;blue:DAPI).Mean±SD.n=6.**P<0.01 vs PBSgroup;##P<0.01 vs LPS+IFNγ/LPS+IFNγ group;△△P<0.01 vs IL-4/IL-4 group.圖1 巨噬細(xì)胞M1極化和M1/M 2轉(zhuǎn)化過程中SENP3表達(dá)上調(diào)

    2 SENP3在改良磷酸鈣誘導(dǎo)的模型小鼠AAA組織中高表達(dá)

    RT-qPCR和Western blot結(jié)果顯示,SENP3在小鼠AAA組織中表達(dá)顯著升高(P<0.05),見圖2A、B。石蠟切片免疫組織化學(xué)染色顯示,AAA病灶組織內(nèi)膜、中膜層有缺失;SENP3陽性染色主要分布在中膜層細(xì)胞核及核周的部分胞質(zhì)內(nèi),與對(duì)照組相比,陽性染色面積顯著增大(P<0.05),見圖2C。

    3 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制磷酸鈣誘導(dǎo)的小鼠A A A形成

    Figure 2.SENP3 was up-regulated in the aorta tissue of mice with CaPO4-induced abdominal aortic aneurysm(AAA).The AAA model was establshed in 8~12-week-old C57BL/6Jmice by administration with CaCl2 and PBSfor 14 d.A:SENP3 mRNA expression was measured by RT-PCR;B:SENP3 protein expression was measured by Western blot;C:representative immunohistochemical staining images for SENP3 in paraffin-embedded sections from aorta tissues were shown,and the SENP3 positive area was determined.Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01 vs Con group.圖2 SENP3在CaPO 4誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤中高表達(dá)

    RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示,cKO小鼠BMDMs中,SENP3表達(dá)顯著降低(P<0.01),見圖3A。cKO雄鼠和同窩出生的WT雄鼠AAA造模結(jié)果顯示,cKO小鼠腹主動(dòng)脈成瘤較小或無法形成AAA,見圖3B,相應(yīng)地,cKO組AAA造模小鼠生存率顯著高于WT組(P<0.05),見圖3C。改良磷酸鈣法誘導(dǎo)的AAA中cKO小鼠AAA發(fā)生率顯著低于WT組(P<0.05),見圖3D;WT小鼠中,磷酸鈣誘導(dǎo)的AAA主動(dòng)脈瘤體外部直徑和動(dòng)脈重/總體重比值均高于cKO組(P<0.05),見圖3E、F。HE染色可見正常動(dòng)脈具備清晰、完整的彈力板層將內(nèi)、中、外膜分開,動(dòng)脈無異常擴(kuò)張,內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞排列整齊;而造模后,WT組發(fā)生AAA的動(dòng)脈擴(kuò)張和增厚程度比cKO組嚴(yán)重,見圖3G。此外,VVG染色可見cKO組僅有少量或無內(nèi)彈性膜崩解及彈性纖維斷裂(黑色著色為彈性纖維),而WT組的彈性纖維斷裂更為嚴(yán)重,纖維斷裂等級(jí)數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05),見圖3G、H。

    4 SENP3敲除抑制AAA的炎癥和氧化應(yīng)激

    通過對(duì)AAA瘤體組織進(jìn)行RT-qPCR和Western blot檢測(cè)顯示,在磷酸鈣誘導(dǎo)下,WT組的主動(dòng)脈組織炎癥因子IL-1β、IL-6和TNFα的表達(dá)顯著高于cKO組,見圖4A~C。DHE染色檢測(cè)動(dòng)脈組織中的ROS水平,結(jié)果顯示:cKO組的主動(dòng)脈組織中氧化應(yīng)激水平低于WT組,見圖4D。

    5 SENP3敲除抑制MMP-9表達(dá)上調(diào)所導(dǎo)致的ECM重構(gòu)

    RT-qPCR、Western blot和免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,在cKO組瘤體內(nèi)MMP-9的mRNA和蛋白表達(dá)比WT組顯著下調(diào),見圖5A~C。MMP-9陽性著色在細(xì)胞質(zhì)中,瘤體的病灶中伴隨著大量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞和破損的血管平滑肌細(xì)胞,而cKO組的中膜層相對(duì)完整,在MMP-9高表達(dá)的相應(yīng)部位,對(duì)應(yīng)WT組瘤體動(dòng)脈中膜的彈力板層破壞更為嚴(yán)重,見圖5C。

    6 SENP3介導(dǎo)MKK7 de-SUMO修飾調(diào)控JNK通路和MMP-9表達(dá)

    Co-IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,巨噬細(xì)胞MKK7的SUMO2/3修飾在誘導(dǎo)M1分化的過程中減少(圖6A),而MKK7與SENP3的相互作用增強(qiáng)(圖6B);在轉(zhuǎn)染Flag-MKK7野生型(Flag-MKK7 WT)和SUMO修飾位點(diǎn)K18突變體(Flag-MKK7 K18Rmutant)后誘導(dǎo)BMDMs進(jìn)行M1極化,結(jié)果顯示,后者p-JNK和MMP-9水平均高于前者,見圖6C、D。

    討 論

    1 SENP3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M 1極化促進(jìn)AAA發(fā)生和進(jìn)展

    哺乳動(dòng)物體內(nèi)目前共發(fā)現(xiàn)有7種SENPs,其中SENP3對(duì)氧化應(yīng)激最為敏感[16-17],主要介導(dǎo)底物蛋白的去除SUMO2/3修飾(de-SUMO2/3修飾),在腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移和炎癥細(xì)胞的激活中發(fā)揮重要作用。同時(shí),在免疫應(yīng)答條件下巨噬細(xì)胞極化成M1型,線粒體中大量生成ROS,在氧化應(yīng)激環(huán)境下分泌釋放大量的炎癥因子,放大炎癥損傷[5]。本研究表明SENP3在巨噬細(xì)胞M1/M2極化時(shí)存在表達(dá)差異,并且敲除SENP3能改變M1/M2巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)分布,這提示SENP3也參與調(diào)控巨噬細(xì)胞M1和M2表型轉(zhuǎn)換。人類外周血單核細(xì)胞衍生的巨噬細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析顯示,AAA與非AAA外周動(dòng)脈疾病的患者之間,巨噬細(xì)胞的蛋白和基因表達(dá)譜存在顯著差異,其中差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)富集在與AAA相關(guān)的ECM重塑和炎癥等方面,表明單核-巨噬細(xì)胞譜系在AAA的ECM重塑或炎癥過程具有重要作用[18]。在體外,cKO小鼠的M0受刺激后發(fā)生M1極化的比例降低,而在磷酸鈣誘導(dǎo)的腹主動(dòng)脈瘤小鼠模型中,SENP3敲除能夠有效降低AAA的氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)和ECM重塑,從而導(dǎo)致AAA發(fā)病減少和小鼠存活率的升高。以上結(jié)果表明,SENP3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞M1極化可促進(jìn)AAA發(fā)生和進(jìn)展。

    Figure3.Monocyte-specific SENP3 knockout protectsed mice from CaPO4-induced AAA.A:SENP3 expression in abdominal aorta tissue was measured by RT-qPCR and Western blot;B:representative images of mouse abdominal aorta tissue in 8~12-week-old cKO male mice(n=6)and WT littermates(n=6)administered with CaCl2 and PBSfor 14 d(the arrowhead indicates typical aneurysm);C:Kaplan-Meier survival curves(WT:n=20;cKO:n=15);D:incidences of AAA in animal model;E:quantification analysis for maximal external diameters of abdominal aortas in animal model;F:total wet weight of abdominal aorta per body weight in animal model;G:HE and VVG staining for paraffin-embedded section of AAA tissue in animal model;H:grade of elastic degradation.Unpaired two-tailed t-test was used for statistical analysis in A,Eand F,and Mann-Whitney U test was used in H.Two-sided Fisher's exact test was used to compare variables in D.Statistical significance on Kaplan-Meier curves(C)was assessed with Mantel-Cox test.Mean±SD.*P<0.05,**P<0.01 vs WTgroup.圖3 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除減少CaPO4誘導(dǎo)的小鼠腹主動(dòng)脈瘤形成

    2 SENP3促進(jìn)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)并調(diào)控ECM的機(jī)制

    Figure 4.Monocyte-specific SENP3 knockout inhibited the flammation and oxidative stress in AAA.A,Band C:the mRNA and protein levels of inflammatory cytokines(IL-1β,IL-6 and TNFα)in the aorta tissues of WT and cKO mice were detected by RT-qPCR and Western blot;D:in situ dihydroethidium(DHE)staining for ROSproduction in the frozen sections of the aorta tissues from WT and cKOmice.Unpaired two-tailed t-test was used for statistical analysis in A,B and C.Mean±SD.n=5.**P<0.01 vs WTgroup.圖4 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制AAA的炎癥和氧化應(yīng)激反應(yīng)

    Figure 5.Monocyte-specific SENP3 knockout inhibited MMP-9-induced ECM remodeling.A:the mRNA level of MMP-9 was measured by RT-qPCR;B:the protein level of MMP-9 was measured by Western blot;C:immunohistochemical staining for MMP-9 in paraffin-embedded sections fromaorta tissues.Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01 vs WTgroup.圖5 單核細(xì)胞SENP3特異性敲除抑制MMP-9介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)

    SENP3及其介導(dǎo)的de-SUMO修飾在單核-巨噬細(xì)胞分化和炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。SUMO蛋白酶SENP3在小鼠炎癥性休克模型中可以激活TLR4下游MAPK/AP-1通路,正向調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),而SENP3敲除則顯著抑制了這一過程,提高了小鼠炎癥損傷后的存活率[10]。我們的研究結(jié)果表明相,磷酸鈣誘導(dǎo)的AAA病灶中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),SENP3介導(dǎo)巨噬細(xì)胞M1極化發(fā)揮促炎作用從而加重AAA。研究表明,鈣離子可誘導(dǎo)主動(dòng)脈中層平滑肌細(xì)胞凋亡和彈性蛋白降解,刺激單核-巨噬細(xì)胞遷移趨化,并促進(jìn)炎癥因子表達(dá)分泌[19-20]。M1型巨噬細(xì)胞的MMPs(MMP-9最具代表性)表達(dá)上調(diào),能夠降解和破壞中層彈性纖維板以及Ⅰ型和Ⅲ型膠原,反映病情進(jìn)展。病灶處炎癥損傷-修復(fù)過程ECM的主動(dòng)病理性重構(gòu)依賴于MMPs的分泌和活化,大量降解動(dòng)脈中層的主要應(yīng)力結(jié)構(gòu)——彈力蛋白。同時(shí),炎癥細(xì)胞對(duì)組織的浸潤(rùn)和相關(guān)炎癥因子表達(dá)上調(diào)會(huì)促進(jìn)巨噬細(xì)胞的MMPs進(jìn)一步表達(dá),加重彈力蛋白的降解,從而引發(fā)破壞-重塑惡性循環(huán),促進(jìn)AAA的形成和動(dòng)脈瘤體破裂。我們構(gòu)建的小鼠模型表明,單核細(xì)胞SENP3敲除顯著減輕了這種炎癥級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),延緩AAA的疾病進(jìn)展。

    Figure 6.SENP3 mediated MKK7 de-SUMO modification to regulate JNK pathway and MMP-9 expression.A:BMDMs treated with or without LPS(100 μg/L)and IFNγ(50μg/L)for 48 h were collected,and endogenous MKK7 conjugated with SUMO2/3 was detected by co-immunoprecipitation(Co-IP);B:BMDMs were treated with LPS(100 μg/L)and IFNγ(50 μg/L)for 30 min,and the interaction of endogenous SENP3 and MKK7 was determined by Co-IP;C and D:BMDMs were transfected with Flag-tagged MKK7 WT or SUMOless mutant K18R and incubated with or without LPS(100 μg/L)and IFNγ(50μg/L)for the indicated time,and then p-JNK,JNK and MMP-9 were determined by immunoblotting(IB).*:non-specific bands.圖6 SENP3通過介導(dǎo)MKK 7的de-SUMO修飾調(diào)控JNK通路和MMP-9表達(dá)

    這些研究也揭示了不同炎癥環(huán)境下的單核-巨噬細(xì)胞系中SUMO修飾底物和多種調(diào)控機(jī)制,為我們深入了解單核-巨噬細(xì)胞譜系中轉(zhuǎn)錄因子的翻譯后調(diào)控機(jī)制提供了充分的證據(jù)。目前尚無研究表明MMP-9能被SUMO化修飾,SUMO修飾功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)(http://www.jassa.fr/)也同樣表明,MMP-9沒有可能的SUMO修飾位點(diǎn)。因此,巨噬細(xì)胞MMP-9合成增多可能是SENP3調(diào)控的效應(yīng)分子和終末環(huán)節(jié)。SENP3作為一種de-SUMO蛋白酶,主要功能是對(duì)底物蛋白進(jìn)行翻譯后de-SUMO修飾,降低底物蛋白的SUMO2/3水平,從而影響底物蛋白的功能及活性。我們課題組前期研究表明,SENP3通過介導(dǎo)MKK7 de-SUMO修飾調(diào)控JNK/c-Jun通路,從而參與巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[10]。我們現(xiàn)有的研究證據(jù)也表明SENP3作用于AAA疾病的機(jī)制在于de-SUMO調(diào)控MKK7及MAPK/JNK通路,進(jìn)而促進(jìn)MMP-9合成和分泌,最終導(dǎo)致ECM重構(gòu)的病理學(xué)改變。未來我們將進(jìn)一步通過Co-IP實(shí)驗(yàn)鑒定SENP3及其介導(dǎo)的de-SUMO2/3在氧化應(yīng)激以及CaPO4誘導(dǎo)的AAA中的其他作用底物。此外,其他類型細(xì)胞如平滑肌細(xì)胞的凋亡和增殖異常,以及內(nèi)皮細(xì)胞參與的新生血管形成[7]等,在AAA形成中也發(fā)揮了重要作用,我們將在接下來的工作中繼續(xù)開展相關(guān)研究。

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