慶大霉素?fù)p傷條件下大腸桿菌內(nèi)源過(guò)氧化氫對(duì)間體膜囊的作用

鐘永亮，李 欣,1b,2，龐新躍，劉雪茹

(1.河南科技大學(xué)a.食品與生物工程學(xué)院；b.食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心；c.醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471023; 2.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng) 471023)

0 引言

間體膜囊是細(xì)菌在特殊環(huán)境下產(chǎn)生的一種由細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)褶而形成的囊狀膜構(gòu)造，參與細(xì)胞的多種生命活動(dòng)[1-2]，如作為電子傳遞、磷酸化、氧化還原反應(yīng)的發(fā)生位點(diǎn)[1, 3]，以及參與細(xì)胞分裂周期的DNA復(fù)制和分裂等[4-6]。眾多研究證實(shí)，菌體的損傷會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞形成間體膜囊[7-10]。當(dāng)菌體在惡劣環(huán)境脅迫下，氧化磷酸化作用會(huì)增強(qiáng)，細(xì)胞膜流動(dòng)性增強(qiáng)，從而內(nèi)褶形成間體膜囊，細(xì)胞的表面積增大，促進(jìn)氧化反應(yīng)，維持細(xì)胞代謝平衡[1]。不同抗生素?fù)p傷過(guò)的細(xì)菌均出現(xiàn)了間體膜囊，猜測(cè)細(xì)菌經(jīng)適當(dāng)?shù)幕衔?、機(jī)械等損傷后也可能出現(xiàn)間體膜囊[2]。文獻(xiàn)[11-15]研究發(fā)現(xiàn)：在受損的菌體中均出現(xiàn)內(nèi)源過(guò)氧化氫(H2O2)的大量積累，且受損時(shí)形成的間體膜囊是這些內(nèi)源H2O2的主要積累位點(diǎn)。

丙二醛(maleic dialdebyde, MDA)是多不飽和酸過(guò)氧化的主要產(chǎn)物之一，其細(xì)胞毒性較為顯著。表現(xiàn)在機(jī)體內(nèi)部氧自由基對(duì)膜上的不飽和脂肪酸進(jìn)行攻擊，伴隨著攻擊所衍生的脂質(zhì)過(guò)氧化物，能對(duì)細(xì)胞膜原有結(jié)構(gòu)造成損傷，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性的增高，在此基礎(chǔ)之上，細(xì)胞膜出現(xiàn)損傷，同時(shí)，功能以及相關(guān)代謝過(guò)程受到影響，甚至直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21-25]。所以，測(cè)定細(xì)胞懸液的MDA濃度可間接反映細(xì)胞的損傷程度。慶大霉素(gentamicin, GM)屬于氨基糖類(lèi)的廣譜抗生素，與細(xì)菌中的30S核糖體亞單位16rRNA解碼區(qū)的A部位發(fā)生直接作用，進(jìn)而對(duì)蛋白質(zhì)的合成加以阻礙，使得翻譯異?；蛑袛?，最終導(dǎo)致菌體破裂而亡[26-27]。

本文選擇慶大霉素對(duì)野生型大腸桿菌MG1655進(jìn)行損傷處理，以電導(dǎo)率和MDA為損傷指標(biāo)，對(duì)內(nèi)源H2O2進(jìn)行組織化學(xué)染色后，通過(guò)透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察細(xì)菌損傷前后的變化情況，研究慶大霉素?fù)p傷處理對(duì)大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)中所用的野生型大腸桿菌MG1655，由美國(guó)伊利諾伊大學(xué)微生物學(xué)院James A. Imlay教授惠贈(zèng)，并采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基進(jìn)行37 ℃活化與進(jìn)一步培養(yǎng)。

氯化鈰(CeCl3，分析純)：英國(guó)Sigma公司；硫酸慶大霉素(美國(guó)藥典級(jí))：上海生工生物公司；溶菌酶(分子生物學(xué)級(jí)，酶活≥20 000 U/mg)：上海生工生物公司；50%戊二醛溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)50%，化學(xué)純)：上海生工生物公司；微量MDA測(cè)試盒：南京建成生物工程研究所。

TGL-16型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；雷磁DDS-307型電導(dǎo)率儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；日立F-4500型熒光分光光度計(jì)：深圳市昊光機(jī)電科技應(yīng)用有限公司；TEM-100C型透射電子顯微鏡：日本電子株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 電導(dǎo)率檢測(cè)

將大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，用梯度質(zhì)量濃度的慶大霉素處理菌體后，6 000g室溫離心10 min，此時(shí)測(cè)定上清液電導(dǎo)率并記錄為σm。去除培養(yǎng)液中的上清液，將無(wú)菌水重懸菌沉淀，并靜置于室溫中5 min，此時(shí)測(cè)定菌懸液的電導(dǎo)率并記錄為σs，重復(fù)上述操作直至數(shù)據(jù)穩(wěn)定。根據(jù)記錄，將橫坐標(biāo)定為σm，縱坐標(biāo)定為σs，進(jìn)行坐標(biāo)軸的繪制，坐標(biāo)圖中直線與橫坐標(biāo)的相交點(diǎn)為細(xì)胞的電導(dǎo)率σp[28]。使用Origin軟件繪制菌體電導(dǎo)率和上清液的折線圖，橫坐標(biāo)為不同終質(zhì)量濃度的慶大霉素，兩個(gè)縱坐標(biāo)分別為σp和σs。

1.2.2 間體膜囊的外排和制備

將大腸桿菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，6 000g離心10 min收集菌體，用Tris-HCl緩沖液(pH7.5)洗滌離心2次，去除上清液后加入原培養(yǎng)液1/10體積的Tris-HCl蔗糖高滲溶液重懸。室溫靜置90 min后，加入溶菌酶至終濃度為8.5 mol/L，37 ℃、80 r/min搖床處理30 min，再進(jìn)行10 000g的離心，而后將含有間體膜囊的上清液輕輕吸出，將上清液置于4 ℃的環(huán)境中進(jìn)行420 000g的離心，完成后靜置120 min。將上清液去除之后即可獲得間體膜囊沉淀，再通過(guò)適量的Tris-HCl緩沖液重懸間體膜囊，于-20 ℃存放備用[29]。

1.2.3 紫外光譜法和熒光光譜法測(cè)定H2O2濃度

利用H2O2在240 nm處有吸收峰的光譜特性[30-32]，采用紫外光譜法對(duì)慶大霉素作用后的細(xì)菌內(nèi)源H2O2濃度進(jìn)行測(cè)定。按照文獻(xiàn)[33-34]的方法，通過(guò)熒光光譜法對(duì)間體膜囊外排過(guò)程中上清液的H2O2濃度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 組織化學(xué)染色法檢測(cè)H2O2濃度

參照文獻(xiàn)[35]的測(cè)定方式，使用CeCl3進(jìn)行H2O2的特異染色。通過(guò)離心進(jìn)行菌體的收集，用50 mmol/L CeCl3重懸菌體，在37 ℃預(yù)處理90 min，再用醋酸鈾和醋酸鉛實(shí)施樣品復(fù)染，借助TEM對(duì)鈰過(guò)氧化物的沉積物進(jìn)行觀測(cè)。

1.2.5 硫代巴比妥酸(2-thiobarbituric acid, TBA)比色法檢測(cè)MDA濃度

根據(jù)MDA測(cè)試盒相關(guān)要求，針對(duì)性地配制空白管、測(cè)定管、標(biāo)準(zhǔn)管和標(biāo)準(zhǔn)空白管，并用漩渦混勻器混勻，95 ℃水浴40 min，取出后流水冷卻至室溫，在可見(jiàn)光波長(zhǎng)532 nm處，100 mm光徑，以蒸餾水為參比液，測(cè)各管吸光度值，按照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)中的計(jì)算公式換算成MDA的濃度：

(1)

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌細(xì)胞電導(dǎo)率的影響

菌懸液的電導(dǎo)率σs與細(xì)胞膜受損程度存在密切關(guān)系，外部環(huán)境中內(nèi)部電解質(zhì)釋放導(dǎo)致σs的變化[36]，σs越高，菌體損傷程度越嚴(yán)重。而σp是菌體顆粒的電導(dǎo)率，受菌體細(xì)胞壁上的羧基、磷酸鹽和胺基等電解質(zhì)類(lèi)酸性基團(tuán)分解的影響[37-38]，σp越低，說(shuō)明菌體的損傷越嚴(yán)重。

圖1為慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌MG1655細(xì)胞電導(dǎo)率的影響。分析圖1可知： 雖然上清液電導(dǎo)率σs和菌體顆粒電導(dǎo)率σp變化無(wú)明顯規(guī)律，但兩者的變化趨勢(shì)相反。當(dāng)慶大霉素終質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL時(shí)，σs和σp差值最大，可確定為有效且最優(yōu)的損傷濃度。

2.2 紫外光譜法確定慶大霉素的最佳損傷時(shí)間

圖2為慶大霉素?fù)p傷后大腸桿菌內(nèi)源H2O2濃度隨時(shí)間的變化。吸光度反映H2O2的濃度，吸光度A240的值越高，說(shuō)明H2O2的濃度越高。由圖2可知：隨著慶大霉素?fù)p傷時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)源H2O2濃度呈現(xiàn)緩慢升高的趨勢(shì)。在損傷時(shí)間為26 min時(shí)，內(nèi)源H2O2濃度趨于峰值并保持穩(wěn)定狀態(tài)，所以確定26 min是慶大霉素的最佳損傷時(shí)間。

圖1 慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌MG1655細(xì)胞電導(dǎo)率的影響

圖2 慶大霉素?fù)p傷后大腸桿菌內(nèi)源H2O2濃度隨時(shí)間的變化

2.3 慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響

圖3為慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響。對(duì)比圖3a和圖3b可知：慶大霉素?fù)p傷后，大腸桿菌周?chē)腍2O2沉積量顯著提升，并且間體膜囊數(shù)量增多。使用Image-Pro Plus7.0圖像軟件對(duì)菌體周?chē)e累的H2O2面積占細(xì)胞面積的比例進(jìn)行二維分析，損傷處理前后的面積占比分別為1.85%和32.05%。圖3c和圖3d為慶大霉素?fù)p傷前后離體的間體膜囊，由圖3c和圖3d可知：經(jīng)慶大霉素?fù)p傷后，離體間體膜囊外周H2O2沉積顯著增加，離體間體膜囊外周H2O2面積與菌體面積之比由54.59%增加至87.45%。上述結(jié)果充分表明：慶大霉素所造成的損傷致使大腸桿菌內(nèi)源H2O2增加，并且間體膜囊聚集大量的H2O2。

(a) 慶大霉素?fù)p傷前的大腸桿菌

(b) 2.0 μg/mL慶大霉素?fù)p傷后的大腸桿菌

(c) 慶大霉素?fù)p傷前的離體間體膜囊

(d) 2.0 μg/mL慶大霉素?fù)p傷后的離體間體膜囊

圖3 慶大霉素?fù)p傷對(duì)大腸桿菌內(nèi)源H2O2和間體膜囊的影響

2.4 間體膜囊外排過(guò)程中H2O2和電導(dǎo)率的變化

觀察圖3能夠發(fā)現(xiàn)：大腸桿菌經(jīng)慶大霉素?fù)p傷處理，致使菌體和其間體膜囊的外周聚集大量的H2O2，間體膜囊外排。測(cè)定不同時(shí)段H2O2濃度和電導(dǎo)率的變化，可在一定程度上解析H2O2聚集在間體膜囊外周的時(shí)間段，以及間體膜囊與H2O2兩者間存在的聯(lián)系。

圖4為間體膜囊外排過(guò)程中上清液H2O2濃度和電導(dǎo)率變化。由圖4可知：通過(guò)Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理90 min之后，采用熒光光譜法測(cè)得間體膜囊外排過(guò)程中，上清液的H2O2濃度明顯增加，上清液的電導(dǎo)率下降；Tris-HCl蔗糖+溶菌酶處理相較于Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理的結(jié)果并沒(méi)有明顯區(qū)別。說(shuō)明在Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理的90 min內(nèi)，菌體大量產(chǎn)生內(nèi)源H2O2，且在此期間細(xì)胞膜的損傷程度逐漸減弱。

圖4 間體膜囊外排過(guò)程中上清液H2O2濃度和電導(dǎo)率變化

2.5 內(nèi)源H2O2濃度對(duì)間體膜囊MDA濃度的影響

對(duì)圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，菌體經(jīng)Tris-HCl蔗糖高滲溶液處理后，其內(nèi)源H2O2的濃度大幅度提升，并且上清液電導(dǎo)率下降，側(cè)面說(shuō)明隨著H2O2濃度的上升，細(xì)胞膜的損傷得到緩解。圖5為過(guò)氧化氫酶和慶大霉素處理對(duì)間體膜囊MDA濃度的影響。分析圖4和圖5的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)過(guò)過(guò)氧化氫酶或慶大霉素或兩者共同處理，都能有效提高間體膜囊的MDA濃度。綜上分析，內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊外排H2O2可能有利于減輕大腸桿菌的損傷，發(fā)揮一定的保護(hù)作用，但仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

圖5 過(guò)氧化氫酶和慶大霉素處理對(duì)間體膜囊MDA濃度的影響

3 討論

外排的間體膜囊外周聚集大量的H2O2，內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊的外排似乎同時(shí)進(jìn)行，并且隨著H2O2濃度的提升，細(xì)胞的損傷程度出現(xiàn)顯著性下降，說(shuō)明內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生和間體膜囊外排H2O2可能有利于減輕大腸桿菌的抗損傷能力，但其保護(hù)機(jī)理需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。慶大霉素的損傷和過(guò)氧化氫酶處理會(huì)使間體膜囊中的MDA濃度提升，而過(guò)氧化氫酶能有效清除H2O2，因此間體膜囊損傷程度與H2O2濃度呈相反的趨勢(shì)。進(jìn)一步驗(yàn)證間體膜囊周?chē)e累的H2O2濃度對(duì)間體膜囊具有保護(hù)作用，即伴隨間體膜囊外排產(chǎn)生的H2O2以及慶大霉素?fù)p傷條件下間體膜囊自身產(chǎn)生的H2O2都對(duì)間體膜囊具有保護(hù)作用。慶大霉素和過(guò)氧化氫酶處理的間體膜囊中的MDA濃度遠(yuǎn)高于未經(jīng)慶大霉素處理的。經(jīng)慶大霉素?fù)p傷能使間體膜囊外周的H2O2積淀增加(H2O2濃度提升)，結(jié)合H2O2的保護(hù)作用，可說(shuō)明慶大霉素和過(guò)氧化氫酶共同作用后的間體膜囊中MDA濃度增多，且損傷程度更嚴(yán)重。

大腸桿菌經(jīng)慶大霉素?fù)p傷之后，發(fā)現(xiàn)菌體和間體膜囊中H2O2積淀物數(shù)量顯著性提升，由此可知，間體膜囊可能是一種與正常細(xì)菌類(lèi)似的內(nèi)源H2O2產(chǎn)生位點(diǎn)，而間體膜囊是否能產(chǎn)生大量的H2O2或間體膜囊是否能聚集胞內(nèi)H2O2并排到胞外，這些推測(cè)仍需后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，對(duì)于間體膜囊的形成及相關(guān)功能的研究尚未有結(jié)論，推測(cè)間體膜囊可能是一種特殊的電子傳遞通道[15]，但已有研究表明間體膜囊中含有參與氧化還原反應(yīng)所需的氧化還原酶以及所有細(xì)胞色素，真核細(xì)胞的線粒體與間體膜囊兩者功能存在許多相同之處，由此可知間體膜囊與線粒體DNA之間的聯(lián)系是存在的[1, 3]，有相關(guān)研究指出間體膜囊是一種線粒體的等同物[1, 3]。但鑒于間體膜囊與線粒體兩者之間的結(jié)構(gòu)功能等存在一定差異性[1]，同時(shí)，針對(duì)線粒體內(nèi)含物的研究還存在許多不明之處，猜測(cè)間體膜囊可能是線粒體的一種內(nèi)含物，或是線粒體的一種衍生物。文獻(xiàn)[20]研究認(rèn)為，間體膜囊具有重要的生物學(xué)功能，但是間體膜囊中的活性物質(zhì)尚不清楚。

本試驗(yàn)研究結(jié)果證實(shí)了間體膜囊與H2O2之間的特殊關(guān)系，間體膜囊可能通過(guò)H2O2這一信號(hào)傳遞因子來(lái)完成更多的生理功能，而不僅僅只是損傷條件下的自我保護(hù)。對(duì)間體膜囊與H2O2的進(jìn)一步研究將有助于更深入地了解間體膜囊。

4 結(jié)論

(1)使用非致死的慶大霉素?fù)p傷野生型大腸桿菌MG1655，損傷濃度與損傷程度并非呈正相關(guān)，且損傷期間細(xì)胞的內(nèi)源H2O2濃度隨時(shí)間的增長(zhǎng)趨于穩(wěn)定。慶大霉素?fù)p傷的最佳終質(zhì)量濃度為2.0 μg/mL，最佳損傷時(shí)間為26 min。

(2)慶大霉素?fù)p傷后的大腸桿菌外周以及離體間體膜囊外周H2O2的積淀量明顯增加。

(3)當(dāng)大腸桿菌受到慶大霉素?fù)p傷時(shí)，大量?jī)?nèi)源H2O2聚集在間體膜囊外周，且這些H2O2對(duì)間體膜囊具有保護(hù)作用。