一株產(chǎn)2-苯乙醇酵母的鑒定及其在醬油釀造中的應(yīng)用

鄒謀勇，朱新貴，孫啟星，何理琴

（李錦記（新會(huì)）食品有限公司，廣東江門 529100）

醬油起源于我國(guó)，是以大豆和面粉或小麥為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵釀造而形成的具有特殊色、香、味的液體調(diào)味品[1-3]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，醬油風(fēng)味物質(zhì)形成機(jī)理以及代謝調(diào)控技術(shù)逐漸成為行業(yè)的研究熱點(diǎn)[4-6]，原料大分子酶解產(chǎn)物、發(fā)酵菌群代謝產(chǎn)物以及美拉德反應(yīng)、氧化反應(yīng)等化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)物是醬油風(fēng)味物質(zhì)的主要來(lái)源[7-10]。然而，在醬油發(fā)酵菌群代謝與醬油特征風(fēng)味形成的關(guān)系方面的研究尚不深入，相關(guān)報(bào)道較少。

微生物菌群在醬油體系中生長(zhǎng)代謝，產(chǎn)生了豐富的代謝產(chǎn)物，特別是小分子有機(jī)酸、醇、醛、酯等主要由微生物代謝產(chǎn)生[11-12]，這些代謝產(chǎn)物是醬油風(fēng)味物質(zhì)的重要組成部分。酵母菌群在醬油發(fā)酵體系中代謝產(chǎn)生醇、有機(jī)酸、酯[10，13-14]；2-苯乙醇作為酵母的代謝產(chǎn)物在多種醬油中被檢出[15-16]，是醬油特征風(fēng)味物質(zhì)的重要組分。2-苯乙醇合成代謝菌株的分離鑒定日益受到研究者的關(guān)注。富志磊等[17]從老白干香型酒曲中篩選獲得1株高產(chǎn)β-苯乙醇的季也蒙畢赤酵母（Pichia guilliermondii）F11601，有較好的高鹽耐受性，在pH值為1～10 范圍內(nèi)能生長(zhǎng)，β-苯乙醇合成量達(dá)1.66 g/L。彭東等[18]從高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬醪中分離篩選到1株魯式接合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）和1株近平滑假絲酵母（Candida parapsilosis），將其添加到醬油發(fā)酵醪，可顯著提高醬醪總酯含量，苯乙醇、甲酸異戊酯等檢出量增加。崔瑞迎等[19]在實(shí)驗(yàn)室水平上將耐鹽酵母菌（Zygosaccharomyces rouxii）CGMCC 3791接種到醬醪進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)2-苯乙醇質(zhì)量濃度顯著增加。鄒謀勇等[20]從醬油發(fā)酵醪中分離篩選到1株大洋假絲酵母（Candida oceani）922-1，將該菌株接種到醬油發(fā)酵醪可顯著提升醬醪中2-苯乙醇的含量，具有良好的應(yīng)用前景。目前，對(duì)于醬油特征香氣成分2-苯乙醇的研究，主要是在揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析中檢出2-苯乙醇，以及微生物強(qiáng)化對(duì)醬油風(fēng)味物質(zhì)（包括2-苯乙醇）含量的影響，對(duì)于2-苯乙醇在醬油中的合成代謝規(guī)律研究較少，產(chǎn)2-苯乙醇菌株篩選鑒定及其用于2-苯乙醇提升的研究鮮有報(bào)道。

該研究采用梯度平板稀釋法從醬油發(fā)酵醪中分離篩選到一株可以大量合成2-苯乙醇的酵母菌株30-2，采用生理生化特性測(cè)試和轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列測(cè)序及進(jìn)化樹(shù)分析確定菌株30-2分類學(xué)地位；通過(guò)不同鹽度培養(yǎng)基分析了菌株30-2 的耐鹽性；并對(duì)菌株30-2合成2-苯乙醇的生化途徑進(jìn)行分析?？疾炀?0-2提高醬油發(fā)酵中2-苯乙醇的質(zhì)量濃度的能力，旨在為提高醬油特征風(fēng)味物質(zhì)2-苯乙醇含量提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

醬油發(fā)酵醪樣品：李錦記（新會(huì)）食品有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

麥芽浸粉、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；2-苯乙醇（色譜純）、生理生化實(shí)驗(yàn)試劑：生工生物工程（上海）股份有限公司；其他化學(xué)試劑（均為分析純）：廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.3 培養(yǎng)基

麥芽汁培養(yǎng)基：1%酵母抽提物，5%麥芽浸粉，余量為水。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

高鹽麥芽汁培養(yǎng)基：1%酵母抽提物，5%麥芽浸粉，18%NaCl，2%瓊脂粉，余量為水。115 ℃高壓滅菌15 min。

醬醪發(fā)酵液培養(yǎng)基：取發(fā)酵14 d醬油發(fā)酵醪，先用200目紗網(wǎng)過(guò)濾，清液于臺(tái)式離心機(jī)5 000 r/min離心10 min，上清液即為醬醪發(fā)酵液培養(yǎng)基。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

酵母篩選平板：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

苯丙氨酸為唯一氮源培養(yǎng)基：0.5%苯丙氨酸，2%葡萄糖，0.1%KH2PO4，0.01%NaCl，0.05%MgSO4，0.01%CaCl2，0.02%酵母膏，余量為水。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

（NH4）2SO4為唯一氮源培養(yǎng)基：0.5%（NH4）2SO4，2%葡萄糖，0.1%KH2PO4，0.01%NaCl，0.05%MgSO4，0.01%CaCl2，0.02%酵母膏，余量為水。115 ℃高壓蒸汽滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

5732-U固相微萃取小柱（50/30 μm，DVB/CAR/PDMS）：美國(guó)色譜科公司；7820A-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）分析系統(tǒng)、DBWA×U2色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）：美國(guó)安捷倫公司；HZQ-X300搖床、DHP-9051恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Blue Star紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：北京萊伯泰科儀器股份有限公司；T100聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)伯樂(lè)公司；DYY-B電泳儀：北京六一儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 產(chǎn)香酵母的分離

從醬油生產(chǎn)不同時(shí)間點(diǎn)抽取醬油發(fā)酵醪，用0.85%生理鹽水稀釋，涂布于高鹽麥芽汁培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)60 h，挑取單菌落劃線于高鹽麥芽汁培養(yǎng)基，進(jìn)行分離純化。純化后菌株采用麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30 ℃、150 r/min，發(fā)酵4 d后進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，篩選可產(chǎn)生獨(dú)特香氣菌株。

1.3.2 菌株30-2種子液及發(fā)酵液的制備

種子液制備：將菌株30-2純化斜面菌苔接種于麥芽汁培養(yǎng)基，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)48 h，即為種子液。

發(fā)酵液的制備：取上述種子培養(yǎng)液接種到醬醪發(fā)酵液培養(yǎng)基中，接種量為5%，30 ℃、100 r/min振蕩培養(yǎng)14 d，得發(fā)酵液。

1.3.3 菌株30-2發(fā)酵液風(fēng)味成分分析

采用GC-MS對(duì)發(fā)酵液頂空固相微萃?。╯olid-phase micro-extraction，SPME）樣品進(jìn)行分析，具體方法如下：

取2 mL樣品于4 mL 樣品瓶，采用固相微萃取小柱頂空萃取30 min，然后立即進(jìn)樣進(jìn)行GC-MS分析。氣相色譜條件：以氦氣（He）為載氣，流速1.0 mL/min，固相微萃取小柱進(jìn)樣時(shí)間為2 min，不分流，吹掃流量15 mL/min，吹掃2 min，色譜柱升溫程序?yàn)椋?0℃保持5min；以2℃/min升溫到150℃；再以5 ℃/min升溫到240 ℃，保留10 min。質(zhì)譜條件：采用電子電離（electronic ionization，EI）方式，電離能量為70 eV，檢測(cè)器電壓為857 V，掃描速度為2.00 scans/s，掃描范圍為質(zhì)核比（m/z）20～350；進(jìn)樣口和離子源溫度分別為250 ℃和230 ℃；以樣品的總離子色譜圖進(jìn)行定性分析，采用單離子檢測(cè)掃描（single ion monitoring，SIM）模式，以m/z91.1和122.0兩個(gè)離子為定量離子進(jìn)行分析。

1.3.4 形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)

參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[21]中酵母形態(tài)及主要生理生化特征，對(duì)菌株30-2進(jìn)行觀察與生理生化測(cè)試。

1.3.5 ITS序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用液氮研磨提取菌株30-2基因組DNA，PCR擴(kuò)增rDNA-ITS序列，PCR反應(yīng)體系（30 μL）如下：20 ng DNA模板（菌株30-2基因組），100 μmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP），25 pmol通用引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'；ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'），2.5 U HiFi DNA聚合酶和1 mmol/L MgCl2；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送華大基因進(jìn)行二代測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST檢索，獲取ITS rDNA同源序列，上述序列采用Clustal X 1.81軟件[22]進(jìn)行多重序列比對(duì)；采用MEGA 4軟件對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[23-24]。

1.3.6 菌株30-2 耐鹽性實(shí)驗(yàn)

取菌株30-2種子培養(yǎng)液分別接種到含0、5%、10%、15%、18%NaCl的麥芽汁培養(yǎng)基，接種量為5%（V/V）；30℃、180r/min振蕩培養(yǎng)，并按時(shí)間節(jié)點(diǎn)（0、6 h、11 h、24 h、31 h、48 h、72 h、96 h）取樣于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定OD600nm值。

1.3.7 菌株30-2在不同培養(yǎng)基中2-苯乙醇代謝能力研究

培養(yǎng)基設(shè)計(jì)為2組，第1組含4種培養(yǎng)基：麥芽汁培養(yǎng)基添加苯丙氨酸，麥芽汁培養(yǎng)基，苯丙氨酸為唯一氮源培養(yǎng)基，（NH4）2SO4為唯一氮源培養(yǎng)基；第2組含4種培養(yǎng)基：醬醪發(fā)酵醪，醬醪發(fā)酵醪加0.5%、1.0%苯丙氨酸，對(duì)照組（不接種菌株30-2）。取上述種子液200 mL，4 000 r/min離心10 min；菌體沉淀采用滅菌生理鹽水重懸，離心去上清，重復(fù)3遍，再用生理鹽水重懸，并定容到200 mL。種子懸液接種到上述兩組培養(yǎng)基，接種量為5%（V/V）。發(fā)酵溫度為30℃，前24h，180 r/min振蕩培養(yǎng)，隨后將轉(zhuǎn)速降到100 r/min，繼續(xù)培養(yǎng)；發(fā)酵20 d，取發(fā)酵液5 mL，加入30 mL乙醚，萃取3 次；匯總3次萃取液，真空濃縮，用無(wú)水乙醇稀釋到一定濃度，并使用GC-MS進(jìn)行定量分析。2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取2-苯乙醇梯度稀釋到質(zhì)量濃度分別為10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、80 mg/L、100 mg/L，采用上述GC-MS條件檢測(cè)不同質(zhì)量濃度2-苯乙醇（x）的定量離子峰面積（y），繪制2-苯乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=4.514×104x-1.312×105（相關(guān)系數(shù)R2=0.999 59），按照標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算樣品中2-苯乙醇含量。

1.3.8 數(shù)據(jù)及圖像處理方法

GC-MS數(shù)據(jù)處理軟件導(dǎo)出GC-MS總離子流色譜圖，根據(jù)鑒定結(jié)果在總離子流色譜圖上標(biāo)注主要檢出峰化合物名稱。菌株30-2耐鹽性能測(cè)試及2-苯乙醇定量分析均設(shè)置3個(gè)平行樣，結(jié)果顯示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”（）。菌株30-2耐鹽性能測(cè)試結(jié)果的繪圖軟件為OriginPro 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)香酵母的分離

從醬油生產(chǎn)不同時(shí)間點(diǎn)抽取醬油發(fā)酵醪，用0.85%生理鹽水稀釋，涂布于高鹽麥芽汁培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)60 h，挑取單菌落劃線于高鹽麥芽汁培養(yǎng)基，進(jìn)行分離純化。純化后菌株采用麥芽汁培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為30 ℃、150 r/min，發(fā)酵4 d后進(jìn)行香氣評(píng)價(jià)，得到1株可產(chǎn)生獨(dú)特香氣菌株，將其命名為菌株30-2。

2.2 菌株30-2發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分GC-MS鑒定

為了分析菌株30-2 在醬油發(fā)酵醪中合成代謝風(fēng)味物質(zhì)的種類，將菌株30-2接種到醬油發(fā)酵醪培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵產(chǎn)物采用GC-MS分析，總離子流色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1，各揮發(fā)性風(fēng)味成分含量結(jié)果見(jiàn)表1。由圖1及表1可知，實(shí)驗(yàn)組檢出了乙醇、異丁醇、異戊醇、3-羥基-2-丁酮、2,3-丁二醇、3-甲硫基丙醇、2-苯乙醇等醇、酮類風(fēng)味物質(zhì)；對(duì)照組醇、酮類物質(zhì)僅檢出了2-苯乙醇，其峰面積顯著低于實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明，菌株30-2在醬油發(fā)酵醪中具備合成多種醇、酮類風(fēng)味化合物的能力，其中2-苯乙醇相對(duì)峰面積是對(duì)照組的14.6倍，顯示出其在提升醬油風(fēng)味中的應(yīng)用前景。

圖1 菌株30-2發(fā)酵液風(fēng)味成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of flavor components in fermentation liquid of strain 30-2 by GC-MS analysis

表1 菌株30-2發(fā)酵液揮發(fā)性風(fēng)味成分相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果Table 1 Determination results of relative content of volatile flavor components in fermentation liquid of strain 30-2

2.3 菌株30-2的形態(tài)特征觀察

菌株30-2的菌落形態(tài)及細(xì)胞形態(tài)見(jiàn)圖2。由圖2A可知，菌株30-2在麥芽汁平板上菌落為圓形，邊緣整齊，呈米黃色，表明光滑無(wú)光澤。由圖2B可知，菌株30-2為球形或橢球型，菌體直徑為3～8 μm，與酵母屬常見(jiàn)菌株的細(xì)胞大小接近。

圖2 菌株30-2的菌落形態(tài)（A）與細(xì)胞形態(tài)（B）Fig.2 Colonial morphology (A) and cell morphology (B) of strain 30-2

2.4 菌株30-2的生理生化試驗(yàn)

由表2可知，菌株30-2可以發(fā)酵葡萄糖，微弱發(fā)酵蔗糖；可同化蔗糖、半乳糖、果糖、鼠李糖、甘露醇和山梨醇，微弱同化松三糖和甘油，不能同化赤蘚醇、甘油和乙醇，不能利用水楊苷；可同化硝酸鹽；在35 ℃、37 ℃培養(yǎng)條件下不生長(zhǎng)；可利用50%葡萄糖，可耐受18%氯化鈉，在無(wú)維生素培養(yǎng)基中生長(zhǎng)較弱，脲酶試驗(yàn)陰性。以上結(jié)果與《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》[21]標(biāo)準(zhǔn)菌株生理生化特征進(jìn)行比對(duì)，初步確定菌株30-2為接合酵母屬（Zygosaccharomyces）微生物。

表2 菌株30-2生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Physiological and biochemical tests result of strain 30-2

2.5 菌株30-2 ITS rDNA序列PCR擴(kuò)增與系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

采用PCR技術(shù)從菌株30-2基因組DNA中擴(kuò)增出ITS rDNA序列片段，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 菌株30-2 ITS rDNA序列PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of strain 30-2 ITS rDNA sequence

由圖3可知，PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示目標(biāo)片段長(zhǎng)度約為650 bp，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA測(cè)序結(jié)果顯示菌株30-2ITSrDNA序列堿基長(zhǎng)度為678bp。對(duì)該序列進(jìn)行BLAST分析，選取同源序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知，菌株30-2與接合酵母Zygosaccharomycessp.聚為一支，二者ITS 序列相似度為99.85%，表明其與Zygosaccha-romycessp.親緣關(guān)系較近。綜合形態(tài)學(xué)觀察、生理生化測(cè)試和分子生物學(xué)鑒定，初步鑒定菌株30-2為接合酵母（Zygosaccharomycessp.）。

圖4 基于ITS rDNA序列菌株30-2的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree of strain 30-2 based on ITS rDNA sequences

2.6 菌株30-2耐鹽性分析

由圖5可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著影響菌株30-2生長(zhǎng)曲線，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%時(shí)，菌株30-2穩(wěn)定期細(xì)胞濃度最高，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的進(jìn)一步升高，菌株30-2生長(zhǎng)受到抑制，穩(wěn)定期細(xì)胞密度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，延遲期呈現(xiàn)延長(zhǎng)趨勢(shì)；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)提高到18%時(shí)，延遲期延長(zhǎng)至24 h；不添加NaCl，延遲期最長(zhǎng)，為31 h，穩(wěn)定期細(xì)胞濃度也較NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%～10%時(shí)低，說(shuō)明不加鹽不利于菌株30-2生長(zhǎng)。上述結(jié)果表明菌株30-2具有一定的耐鹽性，可以在高含鹽（18%NaCl）發(fā)酵食品中進(jìn)行應(yīng)用測(cè)試。

圖5 菌株30-2在不同含量的NaCl中生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curves of strain 30-2 in different NaCl contents

2.7 菌株30-2 在不同培養(yǎng)基中2-苯乙醇代謝能力分析

由表3可知，菌株30-2在以（NH4）2SO4為唯一氮源的培養(yǎng)基中，可合成10.6 mg/L 2-苯乙醇，而以苯丙氨酸為唯一氮源時(shí)，2-苯乙醇的合成量達(dá)到了1 363.1 mg/L，說(shuō)明艾氏途徑是菌株30-2以苯丙氨酸為底物合成代謝2-苯乙醇的主要途徑[25]。麥芽汁培養(yǎng)基添加苯丙氨酸的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株30-2的2-苯乙醇合成量較對(duì)照明顯增加，與上述唯一氮源試驗(yàn)結(jié)果相近。在缺乏苯丙氨酸的培養(yǎng)條件下，菌株30-2能以（NH4）2SO4為唯一氮源少量合成2-苯乙醇（10.6 mg/L），表明草莽酸途徑也是其合成代謝2-苯乙醇的途徑之一，但該途徑的代謝能力相對(duì)較弱。菌株30-2在麥芽汁培養(yǎng)基（不外加苯丙氨酸）中合成2-苯乙醇的質(zhì)量濃度為113.0 mg/L，說(shuō)明菌株30-2艾氏途徑代謝所需酶蛋白為非誘導(dǎo)型表達(dá)。麥芽汁培養(yǎng)基添加苯丙氨酸后，2-苯乙醇的檢出量顯著增加，較以苯丙氨酸為唯一氮源實(shí)驗(yàn)組有一定程度提高，說(shuō)明充足營(yíng)養(yǎng)源有利于菌株30-2代謝合成2-苯乙醇。

表3 不同培養(yǎng)基中菌株30-2合成2-苯乙醇含量Table 3 Concentration of 2-phenethyl alcohol synthesized by strain 30-2 in various media

2.8 菌株30-2 在醬油釀造中的應(yīng)用

采用麥芽汁培養(yǎng)基培養(yǎng)Zygosaccharomycessp.30-2種子液，并接種到醬油發(fā)酵醪，發(fā)酵60 d 測(cè)定發(fā)酵醪理化指標(biāo)及2-苯乙醇含量，結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5。由表4可知，實(shí)驗(yàn)組固形物含量和氨基酸態(tài)氮指標(biāo)與對(duì)照組接近；但總酸含量低于對(duì)照組，說(shuō)明菌株30-2添加發(fā)酵可以一定程度降低發(fā)酵醪總酸，推測(cè)菌株30-2具有抑制發(fā)酵醪產(chǎn)酸微生物生長(zhǎng)代謝的作用。還原糖較對(duì)照組有一定幅度降低，推測(cè)與菌株30-2代謝利用有關(guān)。菌株30-2接種醬油發(fā)酵醪發(fā)酵20 d，2-苯乙醇質(zhì)量濃度為40.95 mg/L，是對(duì)照組的4.5倍。由表5可知，添加0.5%、1.0%苯丙氨酸后2-苯乙醇質(zhì)量濃度分別提高到87.15 mg/L、134.55 mg/L。上述結(jié)果證實(shí)了菌株30-2具備在醬油發(fā)酵醪中大量合成2-苯乙醇的能力，添加1.0%苯丙氨酸可使醬油發(fā)酵醪中2-苯乙醇質(zhì)量濃度提高至對(duì)照組的14.7倍。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為高濃度2-苯乙醇醬油胚料制備及針對(duì)性提高醬油2-苯乙醇含量技術(shù)開(kāi)發(fā)提供了新的思路。

表5 菌株30-2對(duì)醬油發(fā)酵醪2-苯乙醇含量的影響Table 5 Effect of strain 30-2 on the content of 2-phenethyl alcohol in fermented mash of soy sauce

3 結(jié)論

從醬油發(fā)酵醪中分離篩選到1 株可耐受18%NaCl的耐鹽酵母菌株30-2，其以苯丙氨酸為底物，通過(guò)艾氏途徑合成2-苯乙醇，在以苯丙氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基中可代謝合成1 363.1 mg/L 2-苯乙醇。經(jīng)菌落、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、生理生化試驗(yàn)和分子生物學(xué)分析，初步鑒定該菌株為接合酵母（Zygosaccharomycessp.）。菌株30-2 添加醬油發(fā)酵醪可抑制發(fā)酵醪產(chǎn)酸，并一定程度降低還原糖含量，對(duì)發(fā)酵液其他理化指標(biāo)影響不明顯。菌株30-2添加醬油發(fā)酵可使2-苯乙醇代謝量提高到對(duì)照組的4.5倍；外加1.0%苯丙氨酸可使2-苯乙醇質(zhì)量濃度進(jìn)一步提高至對(duì)照組的14.7倍；說(shuō)明其在醬油等高鹽發(fā)酵調(diào)味品特征風(fēng)味物質(zhì)2-苯乙醇提升及風(fēng)味改善方面有較大的應(yīng)用前景。