白腐乳發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替規(guī)律研究

周小虎，李 理

（華南理工大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東廣州 510641）

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品醬油、豆豉、納豆、腐乳（sufu）在調(diào)味品中具有重要地位，而腐乳因其獨(dú)特而誘人的風(fēng)味被稱(chēng)為“中國(guó)奶酪”或“東方芝士”。腐乳可分為紅方、白方、青方以及其他各種花色腐乳，白腐乳因其獨(dú)特的風(fēng)味和純凈的外觀在華南地區(qū)及海外擁有較大的市場(chǎng)[1-2]。

白腐乳的生產(chǎn)工藝包括大豆浸泡、打漿、濾漿、煮漿、點(diǎn)漿、壓榨成型、切塊，以及接種毛霉、前酵、加鹽腌制、灌湯后酵、包裝等。雖然接種了純種毛霉進(jìn)行前期發(fā)酵[3]，但由于固態(tài)發(fā)酵是在開(kāi)放的空間進(jìn)行，環(huán)境中的微生物特別是細(xì)菌仍然可以進(jìn)入并參與發(fā)酵，從而影響腐乳的品質(zhì)。白腐乳在后酵過(guò)程中常常出現(xiàn)的白點(diǎn)[4]、脹蓋漏汁[5]等感官品質(zhì)問(wèn)題，均可能與后酵過(guò)程中的微生物相關(guān)。此外，也有報(bào)道顯示，腐乳生產(chǎn)原料豆腐可能被金黃色葡萄球菌、腸桿菌等食源致病菌污染而存在安全問(wèn)題[6]。因此，解析白腐乳發(fā)酵過(guò)程中出現(xiàn)的細(xì)菌群落變化將對(duì)腐乳生產(chǎn)及產(chǎn)品質(zhì)量提升具有很好的指導(dǎo)作用。

研究表明，高通量測(cè)序方法可以在脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）層面比較清晰地展示發(fā)酵體系中出現(xiàn)的微生物[7]，而傳統(tǒng)的培養(yǎng)組學(xué)則可以從發(fā)酵體系中得到純的菌種，可以進(jìn)一步從菌種的角度進(jìn)行深入的研究。目前，對(duì)腐乳菌群的研究主要集中在紅腐乳[8-10]，白腐乳菌群研究的報(bào)道較少。因此，本研究擬對(duì)白腐乳發(fā)酵過(guò)程的全過(guò)程（從前酵至后酵180 d）細(xì)菌群落的演替進(jìn)行系統(tǒng)的研究，為進(jìn)一步研究白腐乳發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落變化對(duì)白腐乳品質(zhì)的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

實(shí)驗(yàn)原料均采自廣東某腐乳廠(chǎng)同一批次生產(chǎn)的白腐乳樣品，實(shí)驗(yàn)原料包括酸漿水（SJ）、白坯（BP）、毛坯（MP）、鹽坯（YP）、后酵45 d（CG45）、后酵90 d（CG90）、后酵180 d（CG180）。所有樣品均收集三份然后混勻凍存于-80 ℃冰箱備用。

1.1.2 化學(xué)試劑

核酸熒光定量染料（P7589）：美國(guó)Invitrogen 公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mix、Marker、DNA提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒：廣州東盛生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS肉湯培養(yǎng)基、M17肉湯培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）培養(yǎng)基：廣州環(huán)凱生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

IlluminaHiSeq2500高通量測(cè)序平臺(tái)：美國(guó)Illumina公司；DYY-6C電泳儀：北京六一生物科技有限公司；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)：北京百晶生物技術(shù)有限公司；LDX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)；SW-CJ-1C超凈工作臺(tái)蘇州凈化設(shè)備廠(chǎng)；MDF-86V50超低溫冰箱：安徽中科都菱電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白腐乳加工工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：白腐乳生產(chǎn)工藝可分為四個(gè)階段。第一階段是豆腐的生產(chǎn)，包括泡豆、打漿、煮漿、點(diǎn)漿、蹲腦、擠壓成型等工藝，其中用于點(diǎn)漿的凝固劑是酸漿水，即自然發(fā)酵的豆腐乳清。第二階段，也稱(chēng)為前期發(fā)酵階段，新鮮切好的豆腐塊（白坯）接種純種毛霉，在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)約48 h，待豆腐塊表面覆蓋著厚實(shí)的白色真菌菌絲結(jié)束（毛坯）。第三階段，將毛坯進(jìn)行腌制，降低毛坯中的水分（鹽坯）。第四階段為后熟階段，將鹽坯裝罐并加入含有一定濃度的食鹽和酒精的湯汁，陳放1～6個(gè)月然后包裝白腐乳成品。

1.3.2 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替分析

對(duì)各個(gè)樣品按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行總DNA提取，并通過(guò)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA提取質(zhì)量，同時(shí)采用紫外分光光度計(jì)對(duì)DNA進(jìn)行定量。然后，以各樣本提取的總細(xì)菌基因組DNA為模板，以16S rRNA 基因V3-V4區(qū)特異引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）和806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對(duì)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系（25 μL）：5×反應(yīng)緩沖液（reaction buffer）5 μL，5×GC buffer 5 μL，脫氧核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5 mmol/L）2 μL，正向引物（Forward primer）（10 μmol/L）1 μL，反向引物（10 μmol/L）1 μL，DNA 模板2 μL，雙蒸水（ddH2O）8.75 μL，Q5 DNA聚合酶0.25 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性15 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72 ℃末端延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并對(duì)目標(biāo)片段進(jìn)行切膠回收。最后，送樣至派諾森生物使用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序及生物信息學(xué)分析。

1.3.3 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

采用傳統(tǒng)平板法對(duì)部分可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離、純化，采用16S rDNA對(duì)分離的細(xì)菌進(jìn)行鑒定。用于分菌的樣品及其采集和保存方法有1.1中所有樣品和后酵30 d腐乳（CG30），其采集和保存方法同1.1。

細(xì)菌的分離純化：在超凈臺(tái)中取5 g腐乳于研缽中（酸漿水取5 mL），研磨后加入45 mL生理鹽水混勻制備樣品液，在超凈臺(tái)中吸取1 mL樣品液于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，依次稀釋至10-3、10-4、10-5倍，分別取100 μL用MRS和M17固體培養(yǎng)基依次傾注倒平板，分別取100 μL于LB、NA固體培養(yǎng)基涂布，于30 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)72 h。挑取單菌落液體培養(yǎng)，經(jīng)平板劃線(xiàn)法進(jìn)一步純化直至獲得單菌落。將分離得到的菌株編號(hào)并于-80 ℃冰箱甘油保藏備用。

分離菌株的鑒定：采用東盛生物細(xì)菌DNA提取試劑盒按照說(shuō)明書(shū)步驟提取每個(gè)分離菌株的基因組DNA，然后使用16S rDNA通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'和下游引物1495R：5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系為50 μL，包括：λDNA 1 μL，引物27F和引物1495R各2 μL，2×PCR Mix 20 μL，超純水25 μL。PCR擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，42 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30次循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。在瓊脂糖凝膠中加入GoldView染料制膠，取8.0 μLPCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠成像儀下觀察。然后利用PCR產(chǎn)物及DNA片段純化試劑盒按照其操作手冊(cè)從PCR反應(yīng)液中回收DNA片段，將回收得到的DNA片段送到生工生物工程（廣州）公司進(jìn)行DNA測(cè)序，將測(cè)得的DNA序列在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）對(duì)比。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用Excel 2019、Origin 2018等軟件。生物信息學(xué)分析：采用滑動(dòng)窗口法對(duì)FASTQ格式的雙端序列逐一作質(zhì)量篩查，隨后利用FLASH軟件（v1.2.7）對(duì)通過(guò)質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對(duì)連接，根據(jù)每個(gè)樣本所對(duì)應(yīng)的Index信息，將連接后的序列識(shí)別分配入對(duì)應(yīng)樣本（要求Index序列完全匹配），從而獲得每個(gè)樣本的有效序列。對(duì)于每個(gè)OTU的代表序列，在QIIME軟件中使用默認(rèn)參數(shù)，通過(guò)將OTU代表序列與對(duì)應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù)的模板序列相比對(duì)，獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息，計(jì)算各樣本的Alpha多樣性。使用Origin 2018軟件，對(duì)關(guān)注的特定樣本在特定分類(lèi)水平的組成繪制柱狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替分析

對(duì)于微生物群落而言，有多種指數(shù)來(lái)反映其Alpha多樣性。常用的度量指數(shù)主要包括側(cè)重于體現(xiàn)群落豐富度的Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)，以及兼顧群落均勻度的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)。一般而言，Chao1或ACE指數(shù)越大，表明群落的豐富度越高；Shannon指數(shù)對(duì)群落的豐富度以及稀有OTU更敏感，而Simpson指數(shù)對(duì)均勻度和群落中的優(yōu)勢(shì)OTU更敏感。樣品Alpha多樣性指數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，毛坯中細(xì)菌群落的豐富度最高，白坯和后酵180 d樣品中細(xì)菌群落的豐富度最低。

表1 白腐乳各樣品中細(xì)菌群落測(cè)序的Alpha多樣性指數(shù)Table 1 Alpha-diversity indexes of bacterial community sequencing in each sample of white sufu

腐乳發(fā)酵過(guò)程中各樣品門(mén)水平、屬水平細(xì)菌群落相對(duì)豐度分布結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1A可知，在后酵45 d及以前樣品中厚壁菌門(mén)（Firmicutes）和變形菌門(mén)（Proteobacteria）為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)；在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中厚壁菌門(mén)均為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，尤其是在后酵45～180 d，厚壁菌門(mén)相對(duì)豐度均在92%以上。由圖1B可知，在酸漿水和白坯中相對(duì)豐度較高的有乳桿菌屬（Lactobacillus）、醋酸菌屬（Acetobacter）；毛坯中的優(yōu)勢(shì)菌屬是庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）；鹽坯中的優(yōu)勢(shì)菌屬是庫(kù)特氏菌屬（Kurthia）、魏斯氏菌屬（Weissella）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）；后酵45 d樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬是明串珠菌屬（Leuconostoc）、乳球菌屬（Lactococcus）和四聯(lián)球菌屬（Tetragenococcus）；后酵90 d樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬是庫(kù)特氏菌屬、明串珠菌屬和乳球菌屬；后酵180 d樣品中的優(yōu)勢(shì)菌屬是四聯(lián)球菌屬、庫(kù)特氏菌屬和魏斯氏菌屬。

圖1 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落基于門(mén)水平（A）及屬水平（B）相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacterial community in white sufu samples in the fermentation process based on phylum level (A) and genus level (B)

2.2 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)細(xì)菌的分離鑒定

利用DNA提取試劑盒提取分離菌株DNA，采用通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，所有條帶堿基數(shù)均在1 500 bp左右，條帶單一且清晰明亮，可進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序。

圖2 部分菌株基于16S rDNA序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of 16S rDNA PCR amplification products of some isolated strains

對(duì)PCR產(chǎn)物純化并測(cè)序后，將測(cè)得的DNA序列在NCBI進(jìn)行BLAST對(duì)比，相似度均在99%以上。從酸漿水、白坯、毛坯、后酵45 d、后酵90 d、后酵180 d 6個(gè)樣品中用MRS、M17、LB和NA四種培養(yǎng)基分離、純化和鑒定出64株細(xì)菌，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 白腐乳發(fā)酵過(guò)程中可培養(yǎng)細(xì)菌基于16S rDNA序列的分離鑒定結(jié)果Table 2 Isolation and identification results of culturable bacteria in the white sufu fermentation process based on 16S rDNA sequences

由表2可知，從酸漿水中主要分離鑒定出融合魏斯氏菌（Weissella confuse），其在白坯和毛坯中也大量分離到，而在白坯中還分離鑒定到了蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）；在毛坯中還分離鑒定到乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和糞腸球菌（Enterococcus faecalis），這兩種細(xì)菌在后酵45 d和90 d腐乳中均有分離到；除乳酸乳球菌外，后酵45 d和90 d樣品中還分離出較多的腸球菌；后酵180 d樣品中分離鑒定到蠟樣芽孢桿菌和乳酸乳球菌。

2.3 高通量測(cè)序與培養(yǎng)分離方法結(jié)合分析菌群變化

酸漿水中豐度較高的細(xì)菌有乳桿菌和醋酸菌，這和課題組先前的研究一致（樣品源自不同工廠(chǎng)）[11]，本實(shí)驗(yàn)從酸漿水、白坯和毛坯中都分離到比較多的融合魏斯氏菌。魏斯氏菌是革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞不運(yùn)動(dòng)，顯微鏡下菌體是短桿狀的，其廣泛分布于食物、土壤、胃腸道和呼吸道等環(huán)境中，其中一個(gè)分支由食竇魏斯氏菌和融合魏斯氏組成，它們常分布在含鹽的發(fā)酵食品中。魏斯氏菌是參與食品發(fā)酵的重要乳酸菌之一，對(duì)于發(fā)酵食品的發(fā)酵進(jìn)程和風(fēng)味有重要的影響和貢獻(xiàn)[12]。

序列分析的結(jié)果顯示，從毛坯開(kāi)始出現(xiàn)乳球菌，且在后酵45～90 d樣品中乳球菌屬相對(duì)豐度較高，而通過(guò)培養(yǎng)組學(xué)分析，從白坯到后酵的各個(gè)階段均分離到多株乳酸乳球菌，說(shuō)明乳球菌是白腐乳發(fā)酵過(guò)程中的主要細(xì)菌之一。乳酸乳球菌被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵乳制品中，對(duì)牛乳蛋白質(zhì)的降解和酸奶風(fēng)味具有重要的影響[13]。

明串珠菌屬在后酵45～150 d腐乳中相對(duì)豐度較高。明串珠菌屬是兼性厭氧菌，具有嗜溫性，廣泛存在于發(fā)酵蔬菜、肉制品等[14]，但并未分離到該菌。在白坯中分離到肉葡萄球菌，該菌對(duì)發(fā)酵香腸的風(fēng)味有重要作用[15]。在后酵45～90 d腐乳中還分離鑒定到較多的糞腸球菌、耐久腸球菌及未鑒定到種的腸球菌，腸球菌在其他腐乳中也有分布[9]。有報(bào)道表明，某些芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌會(huì)導(dǎo)致辣椒醬及豆瓣醬脹蓋[16-17]，本研究高通量測(cè)序結(jié)果顯示白腐乳發(fā)酵后期也存在一定的芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌，因此后酵過(guò)程中某些活躍的芽孢桿菌、乳桿菌和腸桿菌可能對(duì)腐乳“脹蓋漏汁”產(chǎn)生影響。在白坯及后酵180 d腐乳中均分離到蠟樣芽孢桿菌，但在后酵階段不是優(yōu)勢(shì)菌屬。

在腐乳成熟的后期，嗜鹽四聯(lián)球菌的豐度越來(lái)越高。雖然四聯(lián)球菌的豐度很高，一開(kāi)始并未分離到該菌。后期通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研，在培養(yǎng)基中增補(bǔ)了氯化鈉后從后熟30 d腐乳中分離到11株嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）。嗜鹽四聯(lián)球菌對(duì)鹽的耐受性較強(qiáng)，是一種革蘭氏陽(yáng)性、四聚體形成、不活動(dòng)、過(guò)氧化氫酶陰性、廣泛存在于高鹽發(fā)酵食品中的微生物[18-19]，在發(fā)酵食品中具有抑制組胺產(chǎn)生[20]、降解黃曲霉毒素B1的作用[21]，并且能夠產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)[22]。后酵45 d和90 d腐乳中乳球菌、明串珠菌和四聯(lián)球菌等菌屬相對(duì)豐度較高，后酵180 d腐乳中四聯(lián)球菌、魏斯氏菌和乳桿菌等菌屬相對(duì)豐度較高，可能是由于這些菌屬的某些菌種對(duì)腐乳后酵體系的高鹽、微氧及復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境具有較好的適應(yīng)性，并且對(duì)其他微生物產(chǎn)生抑制作用。

值得關(guān)注的是，在發(fā)酵的過(guò)程中還出現(xiàn)了不動(dòng)桿菌和庫(kù)特氏菌。不動(dòng)桿菌屬在毛坯中的相對(duì)豐度最高，在發(fā)酵各階段都有存在，這和XU D D等[10]的研究結(jié)果一致；不動(dòng)桿菌屬的部分種是有感染性的[23-24]，但大多數(shù)種是非致病的環(huán)境生物，不動(dòng)桿菌屬也存在于其他各種發(fā)酵食品中[15，22]。庫(kù)特氏菌在鹽坯和后酵90 d樣品中豐度較高，在腐乳發(fā)酵過(guò)程中一直存在且有一定的波動(dòng)，這與LIANG J J等[25]的結(jié)果相似。

對(duì)不同樣品進(jìn)行細(xì)菌的分離鑒定，發(fā)現(xiàn)能夠分離鑒定出的細(xì)菌種類(lèi)較少，并且純培養(yǎng)出的細(xì)菌菌屬不是該樣品豐度最高的菌屬，可能原因是培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件不適合該樣品高豐度菌屬生長(zhǎng)，或分菌時(shí)挑取菌數(shù)有限，而純培養(yǎng)出來(lái)的細(xì)菌是較適合實(shí)驗(yàn)條件生長(zhǎng)的，或是高通量測(cè)序方法可能檢測(cè)到死亡的微生物群的完整核苷酸序列[26-27]。

3 結(jié)論

通過(guò)高通量測(cè)序及培養(yǎng)分離結(jié)合的方法分析了白腐乳發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落演替。白腐乳從前酵到后酵180 d的整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落均有較大變化，從白坯、毛坯、后熟45 d腐乳至后熟180 d腐乳中的優(yōu)勢(shì)菌屬分別為：乳酸桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬、明串珠菌屬和四聯(lián)球菌屬。從白腐乳生產(chǎn)及發(fā)酵過(guò)程中分離鑒定出75株細(xì)菌，包括融合魏斯氏菌（Weissella confusa）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）、嗜鹽四聯(lián)球菌（Tetragenococcus halophilus）、糞腸球菌（Enterococcus faecalis）和耐久腸球菌（Enterococcus durans）等。