裂褶菌多糖發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化及其活性研究

魯 鐵，陳懷中，金 陽，周牧野，劉 通，葉延欣，姬曉娜，劉 宇，李冰冰*

（1.河南城建學院生命科學與工程學院，河南平頂山 467036；2.平頂山健康食品協(xié)同創(chuàng)新中心，河南平頂山 467036；3.魯東大學農(nóng)學院，山東煙臺 264025）

裂褶菌（Schizophyllum communeF.）又稱白參、樹花、八擔柴，隸屬于真菌門，擔子菌綱，傘菌目，裂褶菌科，裂褶菌屬（Schizophyllum），是一種具有較高食藥用價值的大型食用菌[1-2]，具有清肝明目、滋補強身的功效[3-4]，在我國主要分布于河北、黑龍江、安徽、江蘇、浙江、福建、海南等省份。

裂褶菌多糖（schizophyllan polysaccharide，SPG）又稱裂褶菌素，是裂褶菌主要的活性物質(zhì)之一，其結(jié)構(gòu)主要是β-（1→3）和β-（1→6）糖苷鍵組成的β-葡聚糖[5]。JAYAKUMAR G C等[6]研究發(fā)現(xiàn)，SPG具有廣譜性的抑菌活性，趙岳等[7]進一步證實SPG對假單胞桿菌（Pseudomonas syringae）和大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制效果。MAYAKRISHNAN V等[8]研究發(fā)現(xiàn)，裂褶菌子實體的提取物具有一定的抗氧化活性，楊娜等[9]進一步證實SPG具有抗氧化活性。此外，周林等[10]對SPG的保濕性能進行了評價，結(jié)果表明SPG是化妝品較優(yōu)良的保濕性原料。

SPG來源于裂褶菌的子實體、發(fā)酵液和菌絲體。使用發(fā)酵手段獲取SPG利于規(guī)?；拈_發(fā)利用。SINGH M K等[11]使用以銀合歡（Leucaena leucocephala）木粉碎物為主成分等14種組分的培養(yǎng)基進行發(fā)酵產(chǎn)SPG，產(chǎn)量達到4.2 g/L；吳麗華[12]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加聚合物如谷氨酸及透明質(zhì)酸等可以提高發(fā)酵體系的溶氧傳質(zhì)效率，從而提升SPG的產(chǎn)量。

本研究以胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量為評價指標，在單因素試驗確定對發(fā)酵影響較大的主效碳、氮源基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken響應(yīng)面試驗考量3種聚合物（羥甲基淀粉鈉、透明質(zhì)酸、β-環(huán)糊精）及谷氨酰胺、抗壞血酸、KH2PO4復(fù)合體系對裂褶菌產(chǎn)多糖的影響，確定裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)多糖的最佳培養(yǎng)基配方，并對其抑菌活性、抗氧化性及保濕活性進行研究，以期為裂褶菌多糖的開發(fā)利用提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

裂褶菌（Schizophyllum commune）經(jīng)野外組織分離，保存于本實驗室，編號為SCLT NO.990715。

1.1.2 試劑

葡萄糖標準品（純度≥98%）：天津市優(yōu)譜化學試劑有限公司；1,1-二苯肼-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl2-picrylhydrazyl，DPPH）：北京索萊寶科技有限公司；2,2'-聯(lián)氨雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二胺鹽（2,2'-azino-bis（3-ethbenzothiazoline-6-sulfonicacid）diammoniumsalt，ABTS）（純度≥98%）、水楊酸（純度≥98%）：宜興市申光醫(yī)藥化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基、活化培養(yǎng)基使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，121 ℃高壓滅菌20 min。

液體種子培養(yǎng)基[13]：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，蔗糖10 g，酵母膏2 g，牛肉膏2 g，蛋白胨2 g，KH2PO42 g，MgSO41 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[14]：葡萄糖20 g，酵母浸粉6 g，KH2PO41 g，抗壞血酸0.01 g，蒸餾水1 000 mL，121 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DLHR-D 2802型恒溫振蕩培養(yǎng)箱：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；Spectronic 200型紫外分光光度計：美國賽默非世爾科技公司；GFL-125型電熱鼓風干燥箱：天津萊玻特瑞儀器有限公司；MJ-78A型高壓蒸汽滅菌鍋：上海施都凱儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2F型無菌操作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；KDC-1044型低速離心機：科大創(chuàng)新股份有限公司；Biotech-10BG2A型發(fā)酵罐：上海虔鈞科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 裂褶菌的發(fā)酵培養(yǎng)

菌種的活化：將4 ℃低溫保存的斜面試管菌種接種到活化培養(yǎng)基中，25 ℃條件下培養(yǎng)5～10 d，待其長滿后接種。

種子液的制備：使用打孔器取5塊直徑為1 cm的菌塊，接入種子培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d。

裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)：將種子液按5%（V/V）的接種量接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基，裝液量為100 mL/250 mL，于25 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)5 d。

1.3.2 裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

（1）最佳碳源與氮源的確定：改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳源為乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖，質(zhì)量濃度為20 g/L，改變發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源為酵母浸粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏，質(zhì)量濃度為6 g/L，其他組分不變，25 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)5 d，研究不同碳源對裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量的影響，篩選出最佳碳源與氮源。

（2）裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

確定最佳的碳氮源后，以胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量（Y）為考察指標，選擇碳源（X1）、氮源（X2）、KH2PO4（X3）、β-環(huán)糊精（X4）、透明質(zhì)酸（X5）、抗壞血酸（X6）、羧甲基淀粉鈉添加量（X7）和谷氨酰胺（X8）共計8個因素進行Plackett-Burman試驗，考察8個因素對裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量影響的正負效應(yīng)，試驗因素與水平見表1。

表1 Placket-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Placket-Burman tests

依據(jù)Plackett-Burman試驗結(jié)果確定顯著因子，根據(jù)各因素影響的正負效應(yīng)設(shè)計最陡爬坡試驗的方向和步長，通過最陡爬坡試驗確定顯著因子水平的中心值。在最陡爬坡試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，進行Box-Benhnken響應(yīng)面試驗。

1.3.3 裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量的測定

裂褶菌菌絲體干質(zhì)量的測定參照文獻[15]的方法；裂褶菌菌絲體粗多糖的提取步驟參照文獻[16]的方法；裂褶菌多糖質(zhì)量分數(shù)的測定參照文獻[17]，總多糖產(chǎn)量的計算方法參照文獻[15]。

1.3.4 發(fā)酵曲線試驗

采用最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基培養(yǎng)裂褶菌，測定胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量繪制發(fā)酵曲線，確定搖床發(fā)酵階段的最優(yōu)培養(yǎng)時間。

1.3.5 發(fā)酵罐試驗

在搖床培養(yǎng)的基礎(chǔ)之上，進行發(fā)酵罐培養(yǎng)試驗，將種子培養(yǎng)液以10%（V/V）的接種量接種于10 L發(fā)酵罐中，裝液量6 L，攪拌轉(zhuǎn)速300 r/min，通氣量1.00～2.00 vvm，25 ℃，培養(yǎng)7 d，pH自然。通過測定胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量繪制發(fā)酵曲線，確定通過發(fā)酵罐培養(yǎng)獲得最大產(chǎn)量的時間。

1.3.6 裂褶菌多糖抑菌活性測定

參照文獻[18]，以青霉素為陽性對照，采用二倍稀釋法配制質(zhì)量濃度分別為0.625 mg/mL、1.250 mg/mL、5.000 mg/mL、10.000 mg/mL的裂褶菌粗多糖溶液，利用紫外分光度法探究裂褶菌多糖對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃葡萄球菌的抑菌活性，并計算抑菌率，其計算公式如下：

式中：A0為空白對照吸光度值；A1為樣品測定管吸光度值；A2為樣品本底管吸光度值。

1.3.7 裂褶菌多糖抗氧化性測定

以維生素C（vitamin C，VC）為陽性對照，采用二倍稀釋法配制成質(zhì)量濃度分別為0.125 mg/mL、0.250 mg/mL、0.500 mg/mL、1.000 mg/mL、2.000 mg/mL的裂褶菌粗多糖溶液，參照文獻[19]測定其·O2-清除率，參照文獻[20]測定其DPPH·及·OH清除率，參照文獻[21]測定其ABTS自由基清除率。

1.3.8 裂褶菌多糖保濕性測定

以透明質(zhì)酸為陽性對照，參照文獻[22]測定質(zhì)量濃度為2.00 mg/mL的裂褶菌多糖在相對濕度（relative humidity，RH）分別為43%和81%條件下放置8 h的保濕率。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源與氮源種類的確定

碳、氮源對裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，葡萄糖作為碳源時，總多糖產(chǎn)量最高，為2.24 g/L；酵母浸粉作為氮源時，總多糖產(chǎn)量最高，為2.49 g/L。因此，確定葡萄糖、酵母浸粉分別為最佳碳、氮源。

圖1 不同的碳源、氮源對裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of different carbon source and nitrogen source on the submerged fermentation of Schizophyllum commune

2.2 裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化響應(yīng)面試驗

2.2.1 Plackett-Burman試驗

Plackett-Burman試驗設(shè)計及結(jié)果見表2，各因素效應(yīng)分析見表3，方差分析見表4。

表2 Plackett-Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of Plackett-Burman tests

表3 Plackett-Burman試驗各因素的效應(yīng)分析Table 3 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman tests

由表3可知，酵母浸粉（X2）、β-環(huán)糊精（X4）和抗壞血酸（X6）的貢獻值分別為58.61%、17.03%、6.79%，對裂褶菌總多糖產(chǎn)量的影響最大，且酵母浸粉（X2）和β-環(huán)糊精（X4）影響為正效應(yīng)，抗壞血酸（X6）影響為負效應(yīng)，選擇這三個因素進行最陡爬坡試驗。其他組分，葡萄糖（X1）、KH2PO4（X3）、透明質(zhì)酸（X5）為正效應(yīng)，分別使用20.0 g/L、0.6 g/L和0.1 g/L，羥甲基淀粉鈉（X7）、谷氨酰胺（X8）為負效應(yīng)，分別使用3.0 g/L和0.000 5 g/L。由表4可知，模型的P值＜0.01，說明模型所擬合的方程達到極顯著水平。

表4 Plackett-Burman試驗回歸模型的方差分析Table 4 Variance analyses of regression model for Plackett-Burman tests

2.2.2 最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗的結(jié)果選擇合適的步長對酵母浸粉（A）、β-環(huán)糊精（B）和抗壞血酸（C）進行最陡爬坡試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設(shè)計與結(jié)果Table 5 Design and results of the steepest ascent tests

由表5可知，第4組試驗條件下，即酵母浸粉30 g/L、β-環(huán)糊精16 g/L、抗壞血酸0.006 g/L時，裂褶菌總多糖產(chǎn)量最高，為12.84 g/L。因此，以第4組試驗因素的水平為中心點進行Box-Benhnken試驗。

2.2.3 Box-Benhnken試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗結(jié)果設(shè)計Box-Benhnken試驗，試驗結(jié)果與分析見表6，方差分析見表7。

表6 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 6 Design and results of Box-Behnken tests

利用統(tǒng)計軟件Design-Expert10.0.4.0對表6的試驗結(jié)果進行多元回歸擬合，得到二次多元回歸方程：

表7 Box-Behnken試驗回歸模型的方差分析Table 7 Variance analysis of regression model of Box-Behnken tests

由表7可知，模型的P值＜0.01，極顯著，失擬項P值＞0.05，不顯著，說明所構(gòu)建的模型很好，與試驗的差異較小；決定系數(shù)R2為0.910 2，調(diào)整決定系數(shù)R2adj為0.794 8，說明預(yù)測值與試驗值有較好的相關(guān)性，試驗誤差較??；模型的信噪比為7.879，遠大于4，則表明該模型適合用于裂褶菌菌絲體總多糖產(chǎn)量的預(yù)測。在該模型中，一次項B、二次項A2、B2、C2對結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），其他項對結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。根據(jù)F值大小可知，各因素對裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量影響的主次順序為：β-環(huán)糊精添加量（B）＞酵母浸粉添加量（A）＞抗壞血酸添加量（C）。各因素間交互作用的響應(yīng)面及等高線見圖2。

圖2 各因素間交互作用對裂褶菌總多糖產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.2 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between each factors on the yield of total schizophyllan polysaccharide fromSchizophyllum commune

由圖2可知，響應(yīng)曲面呈向上的凸面，說明存在最大值；等高線接近圓形，說明各因素間交互作用對裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量的影響不顯著，與方差分析結(jié)果一致。

對擬合出的二次多項式回歸方程分別求A、B和C的偏導(dǎo)數(shù)，得到裂褶菌菌絲體產(chǎn)多糖的最優(yōu)培養(yǎng)基為酵母浸粉29.402 g/L、β-環(huán)糊精17.006 g/L、抗壞血酸0.006 g/L，裂褶菌胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量最高理論值為3.765 g/L?？紤]到實際操作的可行性，將培養(yǎng)基組分調(diào)整為酵母浸粉29.5 g/L、β-環(huán)糊精17.0 g/L、抗壞血酸0.006 g/L，其他組分為葡萄糖20 g/L、KH2PO40.6 g/L、谷氨酰胺0.000 5 g/L、透明質(zhì)酸0.05 g/L、羧甲基淀粉鈉3 g/L。

在此條件下通過3次平行重復(fù)試驗驗證，測得實際胞內(nèi)總多糖產(chǎn)量為3.715 g/L，與理論偏差為1.33%。實際值與理論值基本相符，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)可靠，具有一定參考價值。

2.3 搖瓶發(fā)酵曲線試驗結(jié)果

在最優(yōu)培養(yǎng)基下，裂褶菌搖瓶發(fā)酵產(chǎn)多糖曲線見圖3。由圖3可知，裂褶菌發(fā)酵11 d時，總多糖產(chǎn)量最高，為5.35 g/L。因此，確定搖瓶發(fā)酵裂褶菌產(chǎn)總多糖的最佳培養(yǎng)時間為11d。

圖3 裂褶菌總多糖產(chǎn)量的變化曲線Fig.3 Change curve of total schizophyllan polysaccharide yield

2.4 發(fā)酵罐試驗結(jié)果

在最優(yōu)培養(yǎng)基下，采用10 L發(fā)酵罐對裂褶菌進行發(fā)酵，發(fā)酵曲線見圖4。由圖4可知，當發(fā)酵6 d時，總多糖產(chǎn)量最高，為6.39 g/L。為裂褶菌進一步中試生產(chǎn)提供了試驗依據(jù)。

圖4 最佳培養(yǎng)條件下裂褶菌總多糖產(chǎn)量的變化曲線Fig.4 Change curve of total schizophyllan polysaccharide yield under the optimal culture condition

2.5 裂褶菌多糖活性研究結(jié)果

2.5.1 抑菌試驗結(jié)果

由圖5可知，裂褶菌多糖質(zhì)量濃度在0.625～10.000mg/mL范圍內(nèi)對4種指示菌的抑制作用均呈正相關(guān)關(guān)系，且抑制率均低于陽性對照（青霉素）。當裂褶菌多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，抑菌率均達到最大，對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為56.24%、33.75%、32.62%、42.51%。結(jié)果表明，裂褶菌多糖溶液對4種指示菌均具有抑制作用。

圖5 裂褶菌多糖對不同細菌的抑菌率Fig.5 Antibacterial rate of schizophyllan polysaccharide on different bacteria

2.5.2 抗氧化活性試驗結(jié)果

圖6 裂褶菌多糖對不同自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of schizophyllan polysaccharide on different free radicals

裂褶菌多糖對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除作用見圖6。由圖6可知，裂褶菌多糖質(zhì)量濃度在0.125～2.000 mg/mL的范圍內(nèi)對四種不同的自由基的清除作用呈正相關(guān)關(guān)系，且清除率均低于陽性對照（VC）。當裂褶菌多糖質(zhì)量濃度為2.000 mg/mL時，自由基清除率均達到最大，對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除率分別為84.58%、15.08%、18.61%和32.60%。結(jié)果表明，裂褶菌多糖對4種自由基均具有清除作用。

2.5.3 保濕活性試驗結(jié)果

裂褶菌的保濕性見圖7。由圖7可知，在RH 43%和RH 81%的環(huán)境中，放置0～6 h，裂褶菌多糖的保濕性與透明質(zhì)酸的一致，僅在8 h后裂褶菌多糖的保濕率下降至98.2%，保濕活性略低于透明質(zhì)酸。結(jié)果表明，裂褶菌多糖具有很強的保濕活性，略低于透明質(zhì)酸。

圖7 裂褶菌多糖在不同濕度環(huán)境下的保濕率Fig.7 Moisture-retention of schizophyllan polysaccharide under different humidity environment

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)面試驗確定裂褶菌液態(tài)深層發(fā)酵產(chǎn)胞內(nèi)多糖最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方為葡萄糖20.0 g/L、酵母浸粉29.5 g/L、KH2PO40.6 g/L、抗壞血酸0.006 g/L、β-環(huán)糊精17 g/L、谷氨酰胺0.000 5 g/L、透明質(zhì)酸0.05 g/L、羧甲基淀粉鈉3 g/L，采用最優(yōu)培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵11 d，總多糖產(chǎn)量為5.35 g/L，10 L發(fā)酵罐發(fā)酵6 d，總多糖產(chǎn)量為6.39 g/L。當裂褶菌多糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時，對·O2-、·OH、DPPH·和ABTS自由基的清除率分別為84.58%、15.08%、18.61%和32.6%；當裂褶菌多糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時，對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌率分別為56.24%、33.75%、32.62%和42.51%；在RH 43%和RH 81%的環(huán)境下放置8 h內(nèi)，裂褶菌多糖溶液的保濕性均高于98%。結(jié)果表明，裂褶菌多糖具有較好的抗氧化、抑菌、保濕性能，其具有應(yīng)用于食品、化妝品領(lǐng)域的潛力。