小麥基質下枯草芽孢桿菌與酵母共發(fā)酵代謝特征

黃實寬，陳 雄，姚 娟，李志軍，常 煦，李 欣*

（1.湖北工業(yè)大學生物工程與食品學院，湖北武漢 430068；2.湖北安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌 443003）

芽孢桿菌（Bacillus）是一類重要的工業(yè)應用微生物，被廣泛應用于工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)學、環(huán)保等領域[1-3]。高溫大曲是以小麥粉為原料經(jīng)多菌種高溫發(fā)酵[4]后長期儲存的一種傳統(tǒng)曲藥，芽孢桿菌是其中最為廣泛的微生物，被認為是醬香型白酒風味的重要來源[5]。目前，多種芽孢桿菌菌種已從高溫大曲中被篩選出來，如解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）[6]、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[7]、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）[10]、萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus）[8]等。其中，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）最為常見。林群等[9]從大曲中分離到地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌，并以高粱為基質進行固態(tài)發(fā)酵對其代謝產(chǎn)物進行分析，結果表明前者能提供更多的風味產(chǎn)物，如2-甲基吡嗪、2,3,5-三甲基吡嗪和3-甲基丁醇等；王霜等[10]比較了源于兼香型白酒酒醅的地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵特性，發(fā)現(xiàn)兩株芽孢桿菌均能產(chǎn)5-甲基糠醛、β-苯乙醇、苯乙酸和α-亞麻酸?？梢姡莶菅挎邨U菌和地衣芽孢桿菌的代謝既有共性，也有不同。

醬香型白酒的釀造過程離不開酵母菌與芽孢桿菌的參與，單一菌株生產(chǎn)的白酒風味淡薄、單一、缺乏多菌株白酒發(fā)酵的自然感?，F(xiàn)如今，對白酒風味的研究往往基于醇、酸、酯以及吡嗪類物質的檢測，從這些角度不能說明醬香型白酒風味的組分。而氨基酸除自身營養(yǎng)功能外，還可作為其他風味物質前體，如苯丙氨酸是白酒中重要風味物質苯乙醇的前體，游離氨基酸在美拉德反應下形成不同的吡嗪類物質[11]。了解氨基酸代謝特征有助于進一步研究白酒風味，但氨基酸的代謝卻極少引起重視。

前期已經(jīng)對地衣芽孢桿菌與四種酵母共發(fā)酵時的代謝特征進行研究[12]。本實驗以小麥粉為基質，采用枯草芽孢桿菌和漢遜酵母（Hansenula）、弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）四種酵母菌共發(fā)酵，通過對不同發(fā)酵體系中還原糖、乙醇及氨基酸的檢測分析酵母菌與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時的代謝特征，為后續(xù)研究多種芽孢桿菌與多種酵母菌株的菌株復配奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

小麥粉：武漢市太陽行食品有限責任公司。

1.1.2 菌株

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、釀酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）、漢遜酵母（Hansenula）、弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、魯氏結合酵母（Zygosaccharomyces rouxii）：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司。

1.1.3 試劑

酵母粉、蛋白胨（均為生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；乳酸標準品：山東科學院生物研究所；L-丙氨酸（L-alanine，Ala）、L-甘氨酸（L-glicine，Gly）、L-纈氨酸（L-valine，Val）、L-亮氨酸（L-leucine，Leu）、L-異亮氨酸（L-isoleucine，Ile）、L-蘇氨酸（L-threonine，Thr）、L-脯氨酸（L-proline，Pro）、L-絲氨酸（L-serine，Ser）、L-天冬酰胺（L-asparagine，Asn）、L-蛋氨酸（L-methionine，Met）、L-谷氨酸（L-glutamic acid，Glu）、L-谷氨酰胺（L-glutanine，Gln）、L-苯丙氨酸（L-phenylalanine，Phe）、L-半胱氨酸（L-cysteine，Cys）、L-組氨酸（L-histidine，His）、L-賴氨酸（L-lysine，Lys）、L-酪氨酸（L-tyrosine，Tyr）、L-色氨酸（L-tryptophan，Trp）標準品：美國Sigma 公司；3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）、氫氧化鈉、無水乙醇、吡啶、氯仿、碳酸氫鈉、無水硫酸鈉（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；氯甲酸乙酯（ethyl chloroformate，ECF）：成都市科隆化學品有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母粉10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH。121 ℃高壓滅菌20 min。

LB培養(yǎng)基：酵母粉5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。121 ℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[17]：5 g小麥粉中添加100 mL蒸餾水，攪拌均勻，自然pH。115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SBA生物傳感儀：山東省科學院生物研究所；BL-75A高壓滅菌鍋：上海博迅實業(yè)有限公司；HNY-211B恒溫搖床：天津歐諾儀器儀表有限公司；ZSD-A1160A恒溫培養(yǎng)箱：上海智城分析儀器制造有限公司；CT15RE離心機：日本日立公司；V-1100D可見分光光度計：上海美譜達儀器有限公司；5804R型離心機：德國Eppendorf公司；7890B氣相色譜（gas chromatography，GC）儀：美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

從微生物保藏斜面挑取一環(huán)枯草芽孢桿菌菌落于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為20.0，備用。從微生物保藏斜面挑取一環(huán)酵母菌落于YEPD培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)至OD600nm值為5.0，備用。

1.3.2 混菌發(fā)酵

分別取1 mL芽孢桿菌和酵母培養(yǎng)種子液于發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量100 mL/250 mL，30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)9 d，每隔24 h取樣用于檢測分析。

1.3.3 測定方法

發(fā)酵樣品在4 ℃、8 000 r/min離心10 min，收集上清液用于葡萄糖和乙醇的測定。

葡萄糖含量的測定：采用DNS比色法測定葡萄糖含量[12]。以吸光度值（Y）為縱坐標，葡萄糖質量濃度（X）為橫坐標，建立葡萄糖標準曲線回歸方程：Y=1.503 1X-0.050 9，相關系數(shù)R2為0.998 2。

乙醇含量的測定：采用SBA生物傳感儀檢測乙醇含量[13]。

氨基酸的測定：采用ECF衍生化處理樣品[14]，以2%乙酸苯乙酯作為內標物，通過氣相色譜檢測氨基酸種類及含量[20]。氣相色譜條件為HP-5毛細管色譜柱（30 m×0.32 mm×0.25 μm）；升溫程序：70 ℃保留5 min，以5 ℃/min升至260 ℃，保持2 min；進樣口溫度280 ℃；檢測器溫度280 ℃；載氣為氮氣（N2），流速1.0 mL/min；進樣量1 μL；不分流模式。以氨基酸標準品的保留時間進行定性，內標法定量。其中谷氨酸和谷氨酰胺在該方法下色譜峰無法完全分離，因此，將谷氨酰胺和谷氨酸統(tǒng)一用Glu*表示[15]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

每組實驗3個平行。運用Excel計算平均值和方差，并運用Origin 8.6軟件對發(fā)酵數(shù)據(jù)作圖。

2 結果與分析

2.1 芽孢桿菌與酵母菌共發(fā)酵基本代謝特征

枯草芽孢桿菌分別與釀酒酵母（S）、漢遜酵母（H）、弗比恩畢赤酵母（P）和魯氏結合酵母（Z）進行混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中還原糖和乙醇含量的變化見圖1。

由圖1可知，在216 h的發(fā)酵周期內，各實驗組還原糖在前48 h都是持續(xù)積累，此后出現(xiàn)差異性變化。除漢遜酵母外，其他3種發(fā)酵體系中還原糖含量持續(xù)增加，發(fā)酵120 h后基本穩(wěn)定，枯草芽孢桿菌分別與魯氏酵母、弗比恩畢赤酵母、釀酒酵母共發(fā)酵終點時的還原糖含量分別為（17.02±0.95）g/L、（14.34±0.55）g/L、（13.17±0.91）g/L。當枯草芽孢桿菌與漢遜酵母共發(fā)酵時，還原糖含量在共發(fā)酵48 h后開始下降，至144 h后，發(fā)酵液中還原糖含量＜1 g/L。

圖1 枯草芽孢桿菌與酵母共發(fā)酵過程中還原糖（A）和乙醇（B）含量的變化Fig.1 Changes of reducing sugar (A) and ethanol (B) contents during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and yeast

與還原糖含量變化相對應，枯草芽孢桿菌與酵母的混合發(fā)酵中，只有枯草芽孢桿菌與漢遜酵母共發(fā)酵時，發(fā)酵液中有明顯的乙醇積累，發(fā)酵至72 h時，乙醇含量最高，達到（740.00±28.28）mg/L，發(fā)酵72 h后，乙醇含量下降。而枯草芽孢桿菌與另外3種酵母共發(fā)酵條件下，乙醇積累水平很低?？梢?，枯草芽孢桿菌分別與弗比恩畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏結合酵母共發(fā)酵時對生成的還原糖的利用能力不強，其糖醇轉化能力很差，而漢遜酵母在混菌發(fā)酵條件下具有很好的乙醇代謝活性。李欣等[12]研究發(fā)現(xiàn)，地衣芽孢桿菌也僅在與漢遜酵母混菌發(fā)酵時展現(xiàn)相似的良好的乙醇代謝活性，但乙醇含量最高僅為（93.33±4.71）mg/L。酵母和芽孢桿菌是白酒固態(tài)釀造中常見的微生物，它們通過自身代謝及與其他微生物彼此間適應性差異[16]對白酒風味會產(chǎn)生不同的影響[7，17-19]，最典型的就是混菌發(fā)酵下乙醇積累的不同。

2.2 芽孢桿菌與酵母菌共發(fā)酵氨基酸合成代謝分析

氨基酸除具有營養(yǎng)功能外，還可作為其他風味物質的前體，了解氨基酸合成代謝有助于后續(xù)了解微生物與風味之間的關系。當枯草芽孢桿菌分別與漢遜酵母、弗比恩畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏結合酵母共發(fā)酵時，依次從發(fā)酵液中共檢測到10種、10種、12種和12種氨基酸，最高總氨基酸含量分別為（210.41±18.75）μg/mL（48 h）、（160.92±9.11）μg/mL（48 h）、（3 957.35±261.47）μg/mL（72 h）和（956.71±56.64）μg/mL（48 h）。纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和酪氨酸在4種混合發(fā)酵條件下均被檢測到，為共有氨基酸[12]。部分氨基酸只在一定的發(fā)酵時間段產(chǎn)生：亮氨酸只出現(xiàn)在枯草芽孢桿菌與漢遜酵母共發(fā)酵的前96 h；當枯草芽孢桿菌與費比恩畢赤酵母共發(fā)酵時，苯丙氨酸分別在共發(fā)酵24 h和216 h檢出；當枯草芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵時，纈氨酸在發(fā)酵中期檢測不到，苯丙氨酸只存在發(fā)酵后期；當枯草芽孢桿菌與魯氏結合酵母共發(fā)酵時，苯丙氨酸只在發(fā)酵后期積累。酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時氨基酸呈現(xiàn)區(qū)間性分布說明多種酵母與枯草芽孢桿菌的混合發(fā)酵可能會更有助于發(fā)酵體系中形成豐富的氨基酸成分。

2.2.1 共有氨基酸分析

枯草芽孢桿菌分別與漢遜酵母、釀酒酵母、費比恩畢赤酵母和魯氏結合酵母共發(fā)酵過程中共有氨基酸的差異見圖2。

由圖2可知，4株酵母中，釀酒酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵168 h時，纈氨酸積累量最高，為（56.24±2.83）μg/mL。釀酒酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵72 h時最有利于亮氨酸的積累，為（160.59±24.31）μg/mL，其他3種酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵均不能顯著促進亮氨酸的積累。與亮氨酸相似，釀酒酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵72 h時，異亮氨酸積累量最大，達到（206.00±33.19）μg/mL。漢遜酵母和畢赤酵母分別與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時對積累脯氨酸幾乎沒有貢獻，魯氏結合酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時能略微增加發(fā)酵液中的脯氨酸含量，釀酒酵母相比其他三株酵母更利于脯氨酸的積累，與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵72 h時，最大積累量為（295.06±38.81）μg/mL。在畢赤酵母、釀酒酵母和魯氏結合酵母分別與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵過程中，苯丙氨酸均沒有明顯的波動，而漢遜酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時能有效的促進苯丙氨酸的積累。除漢遜酵母和畢赤酵母外，釀酒酵母和魯氏結合酵母分別與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時更有利于組氨酸的積累，其最高含量分別達到（1 043.92±132.53）μg/mL（72 h）和（536.65±42.16）μg/mL（48 h）。酪氨酸含量除在釀酒酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵72 h時增加外，其他發(fā)酵過程中沒有明顯的變化。綜上，枯草芽孢桿菌無論與何種酵母搭配，大部分共有氨基酸的積累主要發(fā)生在發(fā)酵中前期，最佳積累時間為72 h。除漢遜酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時發(fā)酵體系中含有較多的苯丙氨酸。其余六種共有氨基酸均為釀酒酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵體系中含量最為豐富。

圖2 枯草芽孢桿菌與酵母共發(fā)酵過程中共有氨基酸的含量變化Fig.2 Changes of common amino acids content during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and yeast

同為固態(tài)白酒發(fā)酵過程中常見的芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌與酵母的共發(fā)酵體系比枯草芽孢桿菌與酵母的共發(fā)酵體系多3種共有氨基酸，分別為異亮氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺[17，26]。同時共有氨基酸的含量與菌株搭配相關，而不是與菌株自身相關。如亮氨酸和脯氨酸主要來自枯草芽孢桿菌和釀酒酵母共發(fā)酵，而地衣芽孢桿菌和漢遜酵母或畢赤酵母的共發(fā)酵也能大量形成亮氨酸和脯氨酸。氨基酸本身具有呈味特性，是一些風味物質的前體，這表明了菌株對氨基酸的代謝變化可能會影響到風味的形成。

2.2.2 非共有氨基酸分析

枯草芽孢桿菌分別與漢遜酵母、釀酒酵母、費比恩畢赤酵母和魯氏結合酵母共發(fā)酵過程中非共有氨基酸的變化分別見表1～表4。

表1 枯草芽孢桿菌與漢遜酵母共發(fā)酵時非共有氨基酸的變化Table 1 Changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and Hansenula sp.

表2 枯草芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵時非共有氨基酸的變化Table 2 Changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and Saccharomyces cerevisiae

表3 枯草芽孢桿菌與弗比恩畢赤酵母共發(fā)酵時非共有氨基酸的變化Table 3 Changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and Pichia fabianii

表4 枯草芽孢桿菌與魯氏結合酵母共發(fā)酵時非共有氨基酸的變化Table 4 Changes of non-common amino acid during the co-fermentation process of Bacillus subtilis and Zygosaccharomyces rouxii

由表1～表4可知，枯草芽孢桿菌與釀酒酵母、魯氏酵母共發(fā)酵體系中非共有氨基酸含量遠高于漢遜酵母和畢赤酵母。一些非共有氨基酸只在特定條件下生成：谷氨酸和谷氨酰胺、半胱氨酸只在枯草芽孢桿菌分別與漢遜酵母、釀酒酵母或魯氏結合酵母共發(fā)酵時被檢出；丙氨酸只在枯草芽孢桿菌與畢赤酵母或釀酒酵母共發(fā)酵時被檢出；蘇氨酸只在枯草芽孢桿菌與漢遜酵母或魯氏結合酵母共發(fā)酵時被檢出；甘氨酸是枯草芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵時所特有的氨基酸；色氨酸是枯草芽孢桿菌與魯氏結合酵母共發(fā)酵時所特有的氨基酸。

當枯草芽孢桿菌與漢遜酵母共發(fā)酵168 h時未檢測出任何非共有氨基酸組份，而絲氨酸只在共發(fā)酵72 h時可以被檢測到，且含量很低，只有（1.83±0.11）μg/mL。當枯草芽孢桿菌與釀酒酵母共發(fā)酵時，只有少量的半胱氨酸和甘氨酸積累，而且它們分別只在發(fā)酵168～192 h或216 h時產(chǎn)生。當枯草芽孢桿菌與畢赤酵母共發(fā)酵時，蘇氨酸在發(fā)酵第24小時產(chǎn)生，含量為（2.11±0.06）μg/mL，半胱氨酸在發(fā)酵第144小時和第216小時產(chǎn)生，含量分別為（1.40±0.05）μg/mL、（10.19±0.17）μg/mL，而丙氨酸在發(fā)酵后期未檢測出。當枯草芽孢桿菌與魯氏結合酵母共發(fā)酵時，蘇氨酸主要在發(fā)酵中期積累，色氨酸只能在發(fā)酵第72小時和第216小時產(chǎn)生，含量分別為（2.84±0.07）μg/mL、（3.82±003）μg/mL。4種酵母與枯草芽孢桿菌共發(fā)酵時氨基酸合成代謝具有一定的差異。這種差異對后續(xù)研究芽孢桿菌與酵母菌在白酒制備上的復配方案進而研究白酒的風味形成奠定基礎。

3 結論

以小麥粉為基質，枯草芽孢桿菌分別與漢遜酵母（Hansenula）、弗比恩畢赤酵母（Pichia fabianii）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）共發(fā)酵時，在乙醇代謝方面，Hansenula和B.subtilis共發(fā)酵最利于乙醇的合成，乙醇最高含量為（740.00±28.28）mg/L。在氨基酸合成方面，B.subtilis分別與Hansenula、P.fabianii、S.cerevisiae、Z.rouxii共發(fā)酵時氨基酸合成代謝存在差異，分別合成10、10、12、12種氨基酸，最高總氨基酸含量分別為（210.41±18.75）μg/mL、（160.92±9.11）μg/mL、（3 957.35±261.47）μg/mL、（956.71±56.64）μg/mL，其中共有氨基酸有7種，分別為纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、組氨酸和酪氨酸，非共有氨基酸為絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸以及色氨酸。S.cerevisiae與B.subtilis共發(fā)酵時最有利于氨基酸的合成。