葡糖醋桿菌J2-1靜態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的培養(yǎng)基優(yōu)化

趙 航，陳 沙，張 璇，陳桂光，梁智群，龍曉鵬

（廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院廣西微生物與酶工程技術(shù)研究中心，廣西南寧 530004）

細菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種以β-葡聚糖鏈通過氫鍵作用形成的多孔三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子聚合物[1]。細菌纖維素作為一種由微生物合成的天然高分子聚合物，具有優(yōu)良的生物兼容性[2]、生物降解性、生物適應(yīng)性、納米材料特性[3]以及獨特的理化性質(zhì)和機械性能（如高純度[4]、高結(jié)晶度、高抗張力[5]、高持水性[6]、高通透性等[7-8]）。目前細菌纖維素已被報道在食品、醫(yī)療、化妝品、紡織、導(dǎo)電材料及組織工程等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[9-10]。

目前已報道多種細菌纖維素生產(chǎn)菌株，但是能夠大量合成細菌纖維素且能明顯成膜的菌株主要來自醋桿菌屬（Acetobacter）[7]。盡管目前已有大量關(guān)于優(yōu)良菌株選育[11-13]、發(fā)酵工藝優(yōu)化[14]、生物合成及調(diào)控機制[15]、細菌纖維素結(jié)構(gòu)表征的相關(guān)研究[16]，但是細菌纖維素產(chǎn)量仍較低，難以滿足大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求。其中，圍繞培養(yǎng)基組分及濃度、發(fā)酵條件及發(fā)酵方式的發(fā)酵工藝優(yōu)化是提高細菌纖維素產(chǎn)量的有效途徑。薛璐等[17]研究發(fā)現(xiàn)，醋酸桿菌C2利用果糖、蔗糖和甘露醇作為碳源可以獲得較高的細菌纖維素產(chǎn)量，其中以甘露醇為碳源時的細菌纖維素產(chǎn)量達到4.2 g/L。SON H J等[18]對多種氮源進行對比后發(fā)現(xiàn)添加酵母膏為0.5%時，細菌纖維素產(chǎn)量最高達到2.87 g/L。馬霞等[19]研究發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加適量乙酸和乳酸可提高細菌纖維素產(chǎn)量。此外，細菌纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH為4.0～6.0，發(fā)酵溫度為28～30 ℃[15]。上述發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件優(yōu)化大多是通過動態(tài)發(fā)酵方式實現(xiàn)。盡管動態(tài)方法方式具有更高的溶氧水平和底物利用效率，但是由于機械攪拌或氣流運動造成的發(fā)酵過程中細菌纖維素成膜困難和性能不穩(wěn)定，使得細菌纖維素產(chǎn)量較難提高。相對于動態(tài)發(fā)酵，靜態(tài)發(fā)酵具有工藝簡單、設(shè)備要求低、產(chǎn)物性能穩(wěn)定以及細菌纖維素產(chǎn)量高等優(yōu)點[20]，是細菌纖維素生產(chǎn)的一種較為理想的發(fā)酵方式。

本研究以實驗室自主選育獲得的一株細菌纖維素生產(chǎn)菌株葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）J2-1為試驗菌株，采用靜態(tài)發(fā)酵方式，利用單因素和正交試驗對其發(fā)酵培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，以期提高細菌纖維素產(chǎn)量，為后續(xù)中試研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter）J2-1：廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品發(fā)酵工程實驗室保藏。

1.1.2 化學(xué)試劑

葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇、甘油、檸檬酸、乙酸、乳酸、蘋果酸、乙醇、Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O（均為分析純）：上海泰坦科技股份有限公司；蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；玉米漿干粉：山東聚慈玉米生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏2.5 g/L，檸檬酸2 g/L，Na2HPO4·12H2O 2 g/L，MgSO4·7H2O 0.1 g/L；初始pH 5.0，115 ℃滅菌30 min后加入無水乙醇2%（V/V）。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，酵母膏10 g/L，檸檬酸2 g/L，Na2HPO4·12H2O 3 g/L；初始pH 5.8，115 ℃滅菌30 min后加入無水乙醇2%（V/V）。

1.2 儀器與設(shè)備

PL303精密電子天平：德國METTLERTOLEDO公司；HVE-50高壓滅菌鍋：日本Hirayama公司；SW-CJ-1F超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)公司；LRH-250A生化培養(yǎng)箱：韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司；SKY-211B搖床培養(yǎng)箱：上海蘇坤實業(yè)有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種培養(yǎng)

從斜面上挑取一環(huán)菌苔，接種至裝有50 mL種子培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，于28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液。將種子液以2%（V/V）的接種量接種于裝有50 mL初始發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d。

1.3.2 靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗

以細菌纖維素產(chǎn)量為評價指標(biāo)，分別對培養(yǎng)基碳源種類（葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和甘油）及碳源添加量（20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L）、氮源種類（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉和玉米漿干粉）及氮源添加量（6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L和22 g/L）、乙醇體積分數(shù)（0、1%、2%、3%、4%和5%）、Na2HPO4·12H2O添加量（0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L）、有機酸種類（檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸）及最佳有機酸添加量（1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L）、MgSO4·7H2O添加量（0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L和0.5 g/L）進行單因素優(yōu)化。培養(yǎng)基單因素試驗中，所試驗因素的濃度與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度一致；其他因素的濃度，若已優(yōu)化則與優(yōu)化后的濃度一致，若未優(yōu)化則與基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的濃度一致。

1.3.3 靜態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗

在單因素優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇葡萄糖添加量（A）、MgSO4·7H2O添加量（B）和酵母粉添加量（C）進行正交優(yōu)化試驗，正交優(yōu)化試驗因素與水平如表1所示。

表1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for medium composition optimization

1.3.4 細菌纖維素產(chǎn)量測定

發(fā)酵結(jié)束后，細菌纖維素經(jīng)去離子水漂洗干凈后，置于0.5 mol/L NaOH溶液中沸水浴0.5 h，然后置于去離子水中反復(fù)浸泡至乳白凝膠狀，90 ℃烘干至恒質(zhì)量。細菌纖維素產(chǎn)量（g/L）計算：細菌纖維素干質(zhì)量與發(fā)酵培養(yǎng)基體積的比值。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 碳源種類及最佳碳源添加量

圖1 不同碳源種類（A）和葡萄糖添加量（B）對菌株J2-1細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of different carbon sources (A) and glucose addition (B)on bacterial cellulose production by strain J2-1

在細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，碳源既是菌體生長的能量來源又是細菌纖維素合成的底物。依據(jù)文獻報道及前期實驗結(jié)果[17]，選取葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇和甘油進行碳源種類及最佳碳源添加量優(yōu)化，結(jié)果見圖1。由圖1A可知，葡萄糖、果糖、甘露醇和甘油均有利于細菌纖維素產(chǎn)生，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d產(chǎn)量均在5 g/L左右；而蔗糖作為碳源時，細菌纖維素產(chǎn)量較低，僅為（2.34±0.12）g/L。綜合考慮細菌纖維素產(chǎn)量及原料成本等因素，選擇葡萄糖作為最優(yōu)碳源。

設(shè)置葡萄糖添加量分別為20 g/L、40 g/L、60 g/L、80 g/L和100 g/L，考察葡萄糖添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖1B可知，當(dāng)葡萄糖添加量為20～80 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量也隨葡萄糖添加量增加而增大；當(dāng)葡萄糖添加量為80 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到（5.27±0.05）g/L；當(dāng)葡萄糖添加量＞80 g/L之后，細菌纖維素產(chǎn)量反而降低。因此，選擇葡萄糖最佳添加量為80 g/L。

2.1.2 氮源種類及最佳氮源添加量

圖2 不同氮源種類（A）和酵母粉添加量（B）對菌株J2-1細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources (A) and yeast extract powder addition (B) on bacterial cellulose production by strain J2-1

在細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，一般使用有機氮源，其一方面能夠為菌體生長提供氮素，另一方面有機氮源中豐富的維生素和微量元素能夠作為細菌纖維素合成相關(guān)酶的輔助因子。依據(jù)文獻報道及前期試驗結(jié)果[18]，選取蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏、酵母粉和玉米漿干粉進行氮源種類及最佳氮源添加量優(yōu)化，結(jié)果見圖2。由圖2A可知，酵母膏和酵母粉更有利于細菌纖維素生產(chǎn)，其中以酵母粉為氮源時，30 ℃靜置培養(yǎng)7 d細菌纖維素產(chǎn)量達到最大，為（5.68±0.06）g/L，因此，選擇酵母粉作為最優(yōu)氮源。

設(shè)置酵母粉添加量分別為6 g/L、10 g/L、14 g/L、18 g/L和22 g/L，考察酵母粉添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖2B可知，隨著酵母粉添加量在6～18 g/L范圍內(nèi)的增加，細菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)酵母粉添加量為18 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到（7.43±0.07）g/L；當(dāng)酵母粉添加量＞18 g/L之后，細菌纖維素產(chǎn)量下降。因此，選擇酵母粉最佳添加量為18 g/L。

2.1.3 乙醇體積分數(shù)

在細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乙醇作為輔助碳源對葡糖酸醋桿菌的生長和細菌纖維素合成具有促進作用。按體積百分比設(shè)置乙醇添加量，考察乙醇體積分數(shù)對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加乙醇時，細菌纖維素產(chǎn)量為（6.19±0.19）g/L；隨著乙醇體積分數(shù)在1%～2%范圍內(nèi)增加，細菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)乙醇體積分數(shù)為2%時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到（7.39±0.12）g/L，提高了19.4%，促進效果較為明顯；但是，當(dāng)乙醇體積分數(shù)＞2%之后，細菌纖維素產(chǎn)量明顯降低，甚至低于不添加乙醇時的細菌纖維素產(chǎn)量，這可能是由于過量的乙醇抑制菌體生長的結(jié)果。因此，選擇最佳乙醇體積分數(shù)為2%。

圖3 乙醇體積分數(shù)對菌株J2-1細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of ethanol volume fraction on the bacterial cellulose production by strain J2-1

2.1.4 Na2HPO4·12H2O及MgSO4·7H2O添加量

在細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，Na2HPO4·12H2O能夠為菌體生長提供磷源，同時對發(fā)酵液pH具有緩沖作用。Mg2+作為細菌纖維素合成酶的激活劑，對細菌纖維素合成具有促進作用。設(shè)置Na2HPO4·12H2O添加量0、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L和5 g/L，MgSO4·7H2O添加量0、0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.4 g/L和0.5 g/L，考察Na2HPO4·12H2O、MgSO4·7H2O添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖4。

由圖4A可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加Na2HPO4·12H2O時，細菌纖維素產(chǎn)量為（6.06±0.15）g/L；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量為1～3 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量為3 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到（7.49±0.10）g/L，提高了23.6%；當(dāng)Na2HPO4·12H2O添加量＞3 g/L之后，細菌纖維素產(chǎn)量不再升高。因此，選擇最佳Na2HPO4·12H2O添加量為3 g/L。

由圖4B可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加MgSO4·7H2O時，細菌纖維素產(chǎn)量為（8.06±0.13）g/L；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量在0.1～0.4 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量為0.4g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，達到（9.34±0.20）g/L，提高了15.9%；當(dāng)MgSO4·7H2O添加量＞0.4 g/L之后，細菌纖維素產(chǎn)量有所下降。因此，選擇最佳MgSO4·7H2O添加量為0.4 g/L。

2.1.5 有機酸種類及濃度

在細菌纖維素發(fā)酵生產(chǎn)過程中，有機酸不僅作為輔助碳源對菌體生長和細菌纖維素合成具有促進作用，而且可以與Na2HPO4·12H2O一起對發(fā)酵液pH具有緩沖作用。依據(jù)文獻報道及前期試驗結(jié)果[19]，以不加有機酸為對照，選取檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸4種有機酸，考察有機酸種類及最佳有機酸添加量對細菌纖維素產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖5。由圖5A可知，當(dāng)培養(yǎng)基中不添加任何有機酸時，細菌纖維素產(chǎn)量為（6.43±0.17）g/L；當(dāng)培養(yǎng)基中添加檸檬酸、乙酸、乳酸和蘋果酸任意一種有機酸時，細菌纖維素產(chǎn)量都有所提高，特別是培養(yǎng)基中添加乳酸時，細菌纖維素產(chǎn)量最高達到（8.35±0.24）g/L，提高了28.8%。因此，選擇乳酸作為最優(yōu)有機酸。設(shè)置乳酸添加量為1g/L、2g/L、3g/L、4g/L和5g/L，考察乳酸濃度對細菌纖維素產(chǎn)量的影響。由圖5B可知，當(dāng)乳酸添加量為1～2 g/L時，細菌纖維素產(chǎn)量隨之增加；當(dāng)添加2 g/L乳酸時，細菌纖維素產(chǎn)量最高，為（8.28±0.30）g/L；當(dāng)乳酸添加量＞2 g/L之后，細菌纖維素產(chǎn)量有所降低，這可能是由于高濃度乳酸對菌體生長有所抑制的結(jié)果。因此，選擇最佳乳酸添加量為2 g/L。

圖5 不同有機酸（A）和乳酸添加量（B）對菌株J2-1 細菌纖維素產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different organic acids (A) and lactic acid addition (B)on the bacterial cellulose production by strain J2-1

2.2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗

單因素優(yōu)化試驗結(jié)果表明，相對于乙醇、Na2HPO4·12H2O和乳酸，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉在最優(yōu)濃度條件下對細菌纖維素產(chǎn)量的提高更為顯著。因此，以細菌纖維素產(chǎn)量為評價指標(biāo)，選取葡萄糖（A）、MgSO4·7H2O（B）和酵母粉（C）添加量進行正交優(yōu)化試驗，試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2可知，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉對細菌纖維素產(chǎn)量的影響程度為：葡萄糖＞MgSO4·7H2O＞酵母粉。根據(jù)正交試驗極差分析結(jié)果，葡萄糖、MgSO4·7H2O和酵母粉的最佳組合為A2B2C2，即葡萄糖添加量80 g/L、酵母粉添加量18 g/L，MgSO4·7H2O 添加量0.4 g/L。在此最佳培養(yǎng)基組分條件下進行3次平行驗證試驗，細菌纖維素產(chǎn)量平均值為9.34 g/L。由表3可知，葡萄糖對細菌纖維素產(chǎn)量影響顯著（P＜0.05），而MgSO4·7H2O和酵母粉對細菌纖維素產(chǎn)量影響不顯著（P＞0.05）。

表2 培養(yǎng)基組分優(yōu)化正交試驗結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for medium composition optimization

表3 正交試驗結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

3 結(jié)論

利用單因素和正交試驗對葡糖醋桿菌J2-1靜態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)細菌纖維素的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，確定培養(yǎng)基最優(yōu)組分：葡萄糖80 g/L、酵母粉18 g/L、乙醇體積分數(shù)2%（V/V）、Na2HPO4·12H2O 3 g/L、乳酸2 g/L、MgSO4·7H2O 0.4 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基條件下，細菌纖維素產(chǎn)量達到9.34 g/L，是優(yōu)化前細菌纖維素產(chǎn)量的1.89倍。下一步將在培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎(chǔ)上，重點針對其中試放大開展研究，以期為細菌纖維素的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。