黑曲霉孢子粉粗提物對青枯雷爾式菌的抑菌機制初探

張欽語，冉 江，趙妗頤，楊佩斯，劉 芳，肖 洋，李 祝*

（1.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室山地生態(tài)與農(nóng)業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心，貴州貴陽 550025；2.貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗檢測院，貴州貴陽 550003）

青枯雷爾氏菌（Ralstonia solanacearum）是一種毀滅性的土傳性植物病原菌，廣泛分布于熱帶、亞熱帶及溫帶地區(qū)[1]。青枯雷爾式菌寄主范圍廣，從單子葉、雙子葉植物到林木，可侵染50 多個科的200余種植物[2]，通過侵染植株傷口或根尖裂縫，定殖于皮層組織，入侵維管束，阻礙水分的運輸，導(dǎo)致植株枯萎并最終死亡[3]。由于在寄生范圍、致病能力、生化型等特性上存在較大差異，該菌引起的植物病害也較難防治[4]。目前，生產(chǎn)上防治青枯病主要依靠化學(xué)農(nóng)藥[5-6]，但隨著人類對食品安全、環(huán)境保護和克服有害生物抗性等問題的日益重視，化學(xué)殺菌劑的使用正受到越來越嚴格的限制[7]。微生物源防治是當(dāng)前及未來植物病害防治研究的熱點，毛露甜等[8]通過平板對峙法篩選出枯草芽孢桿菌等對青枯雷爾式菌的抑制效果明顯。汪漢成等[9]以青枯雷爾式菌為指示菌，篩選出的拮抗菌經(jīng)鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。黑曲霉（Aspergillus niger）作為美國食品藥品監(jiān)督管理局認定的安全發(fā)酵菌種，工業(yè)中用來發(fā)酵檸檬酸和葡萄糖酸[10]。近年來黑曲霉生防菌的研究報道逐漸增多，李大軍等[11]從黑曲霉中提取到曲霉多糖物質(zhì)，該物質(zhì)對多種病原菌均有良好的抑制效果。左祥等[12]從飛龍斬血中分離到一株內(nèi)生真菌黑曲霉F-001，研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有廣譜抗菌性。李祝等[13]從土壤中分離得到一株Aspergillus niger（xj），其對5種常見病原真菌均具有抑制作用。唐婧紅等[14]將黑曲霉制備成泡騰片對煙草青枯病進行防治，效果良好。本研究以具有自主知識產(chǎn)權(quán)的黑曲霉孢子粉為原料，采用天然產(chǎn)物分離手段從黑曲霉孢子粉中分離得到對青枯雷爾式菌具有抑菌活性化合物S5，通過測定電導(dǎo)率、核酸蛋白泄露、總蛋白以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）的變化等對其抑菌活性進行初步研究，旨在為對青枯雷爾式菌的防治提供一定的理論基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株來源

黑曲霉（Aspergillus niger）xj（編號：M206021）：由貴州大學(xué)真菌資源研究所分離，中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏；青枯雷爾式菌（Rastonia solanacearum）Q11-2：貴州大學(xué)微生物實驗室保存。

1.1.2 化學(xué)試劑

氯化鈉、丙酮、石油醚、乙酸乙酯、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（均為分析純）、氯霉素（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉（均為分析純）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；溴酚藍、活性氧類檢測試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉5 g/L。121 ℃濕熱滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DDB303A電導(dǎo)率儀：上海雷磁儀器廠；BIOMATE 3S紫外分光光度計：美國Thermo Fisher公司；JY300HE電泳儀：北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；7890A/5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀：美國Agilent Technologie公司；Allegra X-30R離心機：美國BECKMAN公司；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)：美國BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 黑曲霉孢子粉粗提物的制備及粗分段

黑曲霉孢子粉粗提物的制備方法參考文獻[14]，選用15×109CFU/g黑曲霉干燥孢子體粉末500 g，用500 mL丙酮、60 ℃回流提取3 h，收集濾液，重復(fù)提取2次，濃縮提取液，得1.677 g浸膏粗提物。浸膏用蒸餾水懸浮，用石油醚進行3次萃取，濃縮石油醚萃取液得到0.782 g石油醚部分。經(jīng)過硅膠柱層析分離，石油醚-乙酸乙酯（100∶1、50∶1、20∶1、10∶1、5∶1、2∶1、1∶1（V/V））體系洗脫，每個梯度洗脫體積為2 L，分段收集洗脫液，通過薄層色譜硅膠板上的遷移情況將洗脫液分為九個部分，編號為S1～S9。

1.3.2 黑曲霉孢子粉粗提物洗脫液對青枯雷爾式菌的抑制

以對菌株Q11-2的活性抑制效果為評價指標，對洗脫液S1～S9進行活性篩選。將S1～S9分別用DMSO配制質(zhì)量濃度為100 mg/mL的母液。接種菌株Q11-2于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)13 h。然后以10%的接種量接種菌株Q11-2到1 mL新鮮培養(yǎng)基中，加入S1～S9母液，使其終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，30 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，在波長420 nm處測定吸光度值。設(shè)置相同終濃度氯霉素為藥物對照，以不加活性段母液為空白對照，每個處理3個平行。抑菌率計算公式如下：

式中：OD空白為空白處理在波長420 nm處的吸光度值；OD樣品為S1～S9的處理組在波長420 nm處的吸光度值。

1.3.3 洗脫液GC-MS化學(xué)成分分析

經(jīng)過洗脫液S1～S9對青枯雷爾式菌的活性篩選后，選取活性最佳洗脫液進行GC-MS分析其化學(xué)組成，并確定為目標活性段。

甲酯化條件：取100 mg 洗脫液，加入2 mL 1%硫酸-甲醇溶液，超聲振蕩10 min后70 ℃水浴3 min，再加入2 mL正己烷，振蕩3 min后取上清，加入1 g無水硫酸鈉和5 mL飽和NaCl，振蕩1 min，靜置5 min，取上清過0.22 μm有機濾膜，備用。進樣2 μL甲酯化處理后的洗脫液，利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀對樣品進行分析。氣相色譜（GC）條件為柱溫50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升溫至310 ℃，保持4 min，運行時間58 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純氦氣（He）（純度99.999%）；柱前壓7.06 psi，載氣流量1.0 mL/min；分流比20∶1；溶劑延遲時間5 min。質(zhì)譜（MS）條件：離子源為電子電離（electronic ionization，EI）源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA；倍增器電壓1 482 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。

1.3.4 電導(dǎo)率測定

通過測定胞外電導(dǎo)率揭示目標活性段對菌株Q11-2細胞滲透性的影響。接種菌株Q11-2于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)13 h。參考謝麗等[15]的方法測定終質(zhì)量濃度1 mg/mL的目標活性段作用1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后菌株Q11-2 培養(yǎng)基的電導(dǎo)率。

1.3.5 核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的測定

通過測定胞外環(huán)境中核酸和蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的含量變化反映目標活性段對菌株Q11-2細胞膜完整性的影響。接種菌株Q11-2于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)13 h。參考洪學(xué)斌[16]的方法改動，以終質(zhì)量濃度為1 mg/mL的目標活性段處理菌株Q11-2 作用3 h、6 h、9 h、12 h、15 h后，各取3 mL，4 500 r/min離心5 min，立即取上清液在波長260 nm和280 nm處測定吸光度值。

1.3.6 活性氧測定

通過測定胞內(nèi)活性氧的變化來反應(yīng)目標活性段對菌株Q11-2細胞內(nèi)環(huán)境平衡的影響。接種菌株Q11-2 于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)13 h。測定方法參考活性氧檢測試劑盒說明書，取3 mL菌液，12 000 r/min離心5 min，用磷酸鹽緩沖液重懸兩次菌體，然后用終質(zhì)量濃度為10 μmol/L的2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）與菌體混合，37 ℃孵育30 min。接著用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）除去剩余DCFH-DA，與1 mg/mL的目標活性段反應(yīng)30 min，對照設(shè)置同1.3.2，每反應(yīng)10 min取樣制片在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3.7 總蛋白量的測定

參照吳海霞[17]的方法，接種菌株Q11-2 于50 mL的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃振蕩培養(yǎng)13 h。將目標活性段加入菌液至終質(zhì)量濃度為1 mg/mL在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12 h，每4 h取出5 mL樣品，5 000 r/min離心2 min后加入100 μL 1%溴酚藍，95 ℃煮沸10 min，以氯霉素為陽性對照，正常菌液為空白對照，通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium lauryl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）之后進行考馬斯亮藍染色觀察實驗結(jié)果，并通過BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行圖片處理。

1.3.8 數(shù)據(jù)處理

使用WPS 2019進行數(shù)據(jù)分析，IBM SPSS Statistics 22.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Duncan法對所得數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉孢子粉粗提物活性段對青枯雷爾式菌的影響

黑曲霉孢子粉粗提物洗脫液S1～S9對菌株Q11-2的抑制率結(jié)果見圖1。由圖1可知，其中洗脫液S5對于菌株Q11-2的抑制效果最好，達到90.87%，且與藥物對照氯霉素的抑制率無顯著差異（P＜0.05）。洗脫液S4對于菌株Q11-2的抑菌率也達到67.45%，洗脫液S6、S7的抑制率都高于50%，其余部分洗脫液對菌株Q11-2的抑制效果均低于50%。因此，推測黑曲霉孢子粉中抑菌活性物質(zhì)主要在粗提物組分S5中。

圖1 黑曲霉孢子粉粗提物洗脫液S1～S9對菌株Q11-2的抑制率Fig.1 Antibacterial rate of Aspergillus niger spore powder crude extract eluent S1-S9 against strain Q11-2

2.2 活性段的GC-MS成分分析

根據(jù)活性段對菌株Q11-2的抑制率結(jié)果，選擇洗脫液S5段進行GC-MS化學(xué)成分分析，總離子流色譜圖見圖2，洗脫液S5段組分含量分析結(jié)果見表1。通過質(zhì)譜計算機數(shù)據(jù)庫檢索比對總離子流圖中各峰，經(jīng)核對美國國家標準與技術(shù)研究院2005和Wiley275標準質(zhì)譜圖，確定了S5的49種化學(xué)成分，鑒定出其中29種化合物。從表1可知，油酸（26.52%）含量最高，其次是亞油酸甲酯（14.46%）、油酸甲酯（11.10%）、棕櫚酸（10.50%）、油酸乙酯（7.36%）、亞油酸乙酯（6.88%）。結(jié)果顯示出洗脫液S5段中主要成分為亞油酸，油酸和棕櫚酸等脂肪酸。張希等[18]研究發(fā)現(xiàn)，部分脂肪酸及其衍生物能夠有效抑制大腸桿菌以及白色念珠球菌的生長繁殖；張璐[19]研究表明，碳鏈為18～20的雙鍵多不飽和脂肪酸及其甘油單酯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌都有極強的抑制作用。

圖2 粗提物洗脫液S5的化學(xué)成分GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.2 Total ion chromatogram of chemical composition in the crude extract eluent S5 analyzed by GC-MS

表1 粗提物洗脫液S5的化學(xué)成分Table 1 Chemical components of the crude extract eluent S5

續(xù)表

2.3 粗提物洗脫液S5的抑菌機制研究

2.3.1 粗提物洗脫液S5對電導(dǎo)率的影響

當(dāng)細菌遭受外界藥物影響時，細胞膜的維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的能力下降，使胞內(nèi)K+等電解質(zhì)大量外泄，其培養(yǎng)液電導(dǎo)率的變化可以反映細胞膜滲透性的改變。黑曲霉孢子粉粗提物洗脫液S5對菌株Q11-2 的電導(dǎo)率影響結(jié)果見圖3。

圖3 粗提物洗脫液S5對菌株Q11-2電導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of the crude extract eluent S5 on conductivity of strain Q11-2

由圖3可知，洗脫液S5作用菌體過程中，上清液電導(dǎo)率隨著時間的增加而增加。在作用6 h時洗脫液S5處理組的電導(dǎo)率達到最大值，較空白組增加了17.3%（P＜0.05），推測洗脫液S5能夠改變青枯雷爾氏菌細胞膜通透性，引起細胞離子外泄導(dǎo)致胞外電導(dǎo)率升高。

2.3.2 粗提物洗脫液S5對細胞完整性的影響

圖4 粗提物洗脫液S5對菌株Q11-2細胞膜完整性的影響Fig.4 Effect of the crude extract eluent S5 on cell integrity of strain Q11-2

由圖4a可知，洗脫液S5與菌株Q11-2作用3 h后，菌株Q11-2的胞外260 nm吸光度值逐漸升高，說明菌株Q11-2在與洗脫液S5的作用過程中，胞外環(huán)境中的核酸含量不斷增加。由圖4b可知，可觀察到細胞外液在波長280 nm處的吸光度值與時間呈正相關(guān)，在洗脫液S5作用菌株Q11-2的過程中，S5處理組的胞外環(huán)境中的蛋白質(zhì)含量不斷增加，而空白處理的280 nm吸光度值遠低于S5處理組?？梢酝茰y洗脫液S5對菌株Q11-2的細胞膜結(jié)構(gòu)造成了損傷，致使細胞膜結(jié)構(gòu)不完整，導(dǎo)致核酸和蛋白質(zhì)外泄。氯霉素組在280 nm的吸光度值明顯低于空白組，據(jù)文獻報道氯霉素可以與核糖體50S亞基相結(jié)合導(dǎo)致信使核糖核酸與核糖體結(jié)合受阻，從而抑制蛋白合成[20]。

2.3.3 粗提物洗脫液S5對細胞ROS的影響

由圖5可知，對比空白的ROS熒光強度，可見洗脫液S5引起的ROS積累是十分迅速的，在50 min內(nèi)的ROS檢測熒光強度都與空白組的ROS熒光強度的差異極顯著（P＜0.01）。在30 min左右檢測到洗脫液S5熒光強度達到最大，比空白組的熒光強度高出540%，推測在洗脫液S5的作用下，菌株Q11-2細胞在短時間內(nèi)引起了胞內(nèi)大量活性氧的產(chǎn)生，活性氧的大量積累導(dǎo)致細胞膜結(jié)構(gòu)損傷，進而影響其正常細胞代謝過程。

圖5 粗提物洗脫液S5對Q11-2的活性氧的影響Fig.5 Effect of the crude extract eluent S5 on reactive oxygen species of strain Q11-2

2.3.4 粗提物洗脫液S5對細胞總蛋白含量的影響

由圖6可知，在3 h時蛋白量變化差異不大，隨著時間增加，6 h時已經(jīng)可以看出洗脫液S5與氯霉素組對比空白組的蛋白含量出現(xiàn)變化，9 h時空白組的蛋白含量已經(jīng)明顯高于洗脫液S5組和氯霉素組，12 h時總蛋白差異十分明顯，此實驗結(jié)果觀察到空白組的總蛋白含量隨著時間增加而增加，符合正常代謝過程，洗脫液S5組和氯霉素組的總蛋白含量幾乎保持不變，推測洗脫液S5可能抑制了菌株Q11-2的蛋白合成，并對細胞膜結(jié)構(gòu)造成破壞導(dǎo)致蛋白質(zhì)泄露胞外，造成總蛋白量相對于空白組減少。

圖6 粗提物洗脫液S5對菌株Q11-2總蛋白量的影響Fig.6 Effect of the crude extract eluent S5 on total protein contents of strain Q11-2

3 結(jié)論

本研究通過發(fā)掘青枯病原菌的一株拮抗菌黑曲霉xj的次生代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)其粗提物洗脫液S5對青枯病原菌Q11-2具有良好的抑菌作用，經(jīng)GC-MS分析粗提物洗脫液S5得到49種化合物，其中明確結(jié)構(gòu)的有29種，主要有油酸（26.52%）、亞油酸甲酯（14.46%）、油酸甲酯（11.10%）、棕櫚酸（10.50%）等。研究結(jié)果顯示，經(jīng)過洗脫液S5作用后，對比空白組，菌液電導(dǎo)率增加，胞外核酸與蛋白的吸光度值增加，說明粗提物洗脫液S5對病原菌的細胞膜結(jié)構(gòu)造成了影響，導(dǎo)致細胞內(nèi)容物泄露。ROS具有很強的氧化活性，在胞內(nèi)迅速積累會對細胞結(jié)構(gòu)造成損傷，進而影響生物活性。S5在短時間內(nèi)引起病原菌產(chǎn)生大量的ROS，推斷其加快了細胞膜結(jié)構(gòu)的損傷，進而使得細胞生長代謝被抑制甚至失去細胞活性。