葉幕形和留穗量對赤霞珠葡萄酒單體酚類物質(zhì)的影響

楊 君，李俊楠，任瑞華，寧鵬飛，張振文*

（1.西北農(nóng)林科技大學葡萄酒學院，陜西楊凌 712100；2.山西堯京酒業(yè)有限公司，山西臨汾 041500）

酚類物質(zhì)影響葡萄和葡萄酒的顏色和苦澀感，是評價葡萄和葡萄酒質(zhì)量的重要指標，同時酚類物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗癌等特性，有利于人體健康[1-3]。葡萄酒中單體酚類物質(zhì)可分為單體花色苷類與單體非花色苷類，單體非花色苷類主要包括酚酸、黃酮醇、黃烷醇以及芪類物質(zhì)[4]?？寡趸瘎┲饕峭ㄟ^抑制氧化鏈反應的開始或者擴散來抑制其他分子的氧化，有利于緩解氧化性疾?。ㄐ难芗膊　┌Y等）帶來的傷害[5-6]，葡萄酒中酚類化合物因其抗氧化特性而受到越來越多的關(guān)注[7-8]。葡萄及葡萄酒中含有大量的酚類物質(zhì)，葡萄酒中酚類物質(zhì)主要通過浸漬作用從葡萄中獲取[9]，葡萄果實中的酚類物質(zhì)分布在葡萄種子和果皮中，其含量主要與葡萄品種、栽培條件、氣候條件、整形方式等有關(guān)[10]。通過合理的整形方式來提高葡萄品質(zhì)是一種簡單易行的方式，有研究發(fā)現(xiàn)整形方式對葡萄品質(zhì)的影響主要表現(xiàn)在兩方面，一是葉幕形，二是果穗負載量，兩者均可不同程度的改變釀酒葡萄果實生長的微環(huán)境，進而影響葡萄產(chǎn)量和果實品質(zhì)[11]。

葉幕形是葡萄栽培管理的一項重要管理措施，合理的葉幕形有利于獲得穩(wěn)定的產(chǎn)量、提高果實品質(zhì)、病蟲害的防治[12]。不同的架式能形成不同的葉幕結(jié)構(gòu)，從而調(diào)節(jié)葉幕冠層的光照分布，改變?nèi)~片的光合面積，調(diào)節(jié)樹體營養(yǎng)生長與生殖生長的關(guān)系[13]?；h形架形成直立葉幕廣泛應用于釀酒葡萄栽培管理中，Y形架形成V形葉幕，在鮮食葡萄的栽培中廣泛被應用，有研究表明，將籬形架改造為Y形架栽培，使葉幕分開，可有效提高葉片光合效率，改變樹體生長狀況以及產(chǎn)量，有利于提高果實成熟度，減輕病蟲害[14]。

對于釀酒葡萄，產(chǎn)量是決定葡萄成熟度的主要因素，要獲得較高的可持續(xù)產(chǎn)量的同時并具有理想的成熟度，對葡萄植株產(chǎn)量的控制極為重要[15]。疏穗是管理葡萄產(chǎn)量的重要措施，通過對葡萄進行疏穗管理去除葡萄植株上一部分果穗，在不減少葉面積的同時限制植株產(chǎn)量，將植株所產(chǎn)生的能量集中在剩余果穗，使葡萄在較差的氣候條件下也能達到生長所需成熟度[16]，而葡萄果實的成熟程度不僅會影響成熟葡萄漿果中糖、酸、多酚以及香氣物質(zhì)含量[17]，還會影響葡萄酒的顏色以及葡萄酒中化合物的成分，對于提高葡萄酒質(zhì)量至關(guān)重要[18]。關(guān)于葡萄酒中酚類物質(zhì)成分含量及其抗氧化性的研究越來越多[19]，但在釀酒葡萄栽培過程中，關(guān)于葡萄果穗數(shù)量與葉幕形對葡萄酚類物質(zhì)的組成及含量的研究相對較少。

晉中南地區(qū)是我國新興的葡萄酒產(chǎn)區(qū)，赤霞珠是該地區(qū)的主栽品種，本試驗通過葉幕形與果穗留量對赤霞珠干紅葡萄酒中單體酚類物質(zhì)的影響進行研究，并對成熟葡萄果實的單株產(chǎn)量、成熟度、酚類物質(zhì)含量進行測量，對所釀葡萄酒的基本理化指標進行檢測，分別采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（high performance liquid chromatographymass spectrometry，HPLC-MS），對葡萄酒中單體酚類物質(zhì)種類與含量進行檢測，探討葉幕形與果穗留量對干紅葡萄酒質(zhì)量的影響，以期通過合理整形修剪方式，提高晉中南地區(qū)赤霞珠葡萄酒的品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

試驗所用葡萄植株為2012年定植的赤霞珠自根苗，南北行向，行間距為3 m，株距為1 m，單籬架，整形方式為廠字形，短枝修剪，葡萄園采用半機械化管理。田間試驗于2018年進行。

1.1.2 試驗地概況

試驗地位于山西省臨汾市襄汾縣堯京酒莊（35.7～36.1°N，111.1～111.7°E），海拔500～600 m，平地，基本處平原地區(qū)。該地區(qū)屬溫帶季風氣候，暖熱多雨，雨熱同季。年均氣溫11.5 ℃，年降水量550 mm左右，無霜期185 d，氣象數(shù)據(jù)均來自于中國氣象數(shù)據(jù)網(wǎng)（http：//data.cma.cn/）。

1.1.3 化學試劑

甲醇、甲酸、乙腈、4-甲基-2-戊醇、甲基纖維素、（+）-兒茶素、干沒食子酸、二甲花翠素、原花色素B1、槲皮素等標品（均為色譜級）：美國Sigma-Aldrich 公司；葡萄糖、氫氧化鈉、甲氨基肉桂醛（4-（dimethylamino）cinnamaldehyde，DMACA）、濃鹽酸、濃硫酸（均為分析純）：天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

LE438pH計：瑞士梅特勒-托利多公司；PAL-1數(shù)字手持折糖儀：日本愛拓公司；AUW220D電子天平：日本島津公司；KQ-300DE型數(shù)控超聲器：昆山市超聲儀器公司；Aligent 1100、1200 系列高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Kromasil 100-5C18column色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）：美國Agilent公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗設計

本試驗于2018年春季分別對試驗園原葡萄樹形（籬形架直立形葉幕，廠字形，新梢留量約每米架面10個，單株果穗數(shù)為20（圖1））的果穗留量與葉幕形加以改造。對果穗留量進行改造如下：新梢留量為每米架面10個，果穗留量設3個水平，即單株果穗數(shù)為10個（F1）、15個（F2），并以原單株果穗數(shù)20個為對照（CK），每處理分3小區(qū)，每個小區(qū)30株，隨機區(qū)組排列。

對葉幕形進行改造情況如下：通過搭架將新梢向兩邊綁縛設置Y形架（圖1），形成V形葉幕，開張角度為60°，葉幕傾斜長度為120 cm，葉幕厚度為30 cm，Y形架兩橫擔距地面從下到上分別為110 cm和150 cm，對應橫擔上鐵絲間距分別為50 cm和85 cm，并與原籬形架形成的直立葉幕進行對比，兩種葉幕形下每延長1 m架面均留新梢10個，單株果穗數(shù)為20，其他栽培管理方式均一致。

圖1 Y形架與籬形架模式圖Fig.1 Pattern diagram of Y-shaped frame and vertical frame

1.3.2 果實采樣與葡萄酒的釀造

各處理于9月24日采收，按照“S”形選取9株葡萄。每株葡萄分別在陰面與陽面的上、中、下部各選一穗，然后在每穗葡萄上邊均勻選取5粒，共選取54穗，共計270粒葡萄，立即帶回實驗室，將其放置在-40 ℃條件下進行保存，儲藏用于測量果實中可溶性固形物、可滴定酸、酚類物質(zhì)含量及pH值。對每個小區(qū)30株樹上的果穗全部進行采摘并稱質(zhì)量，計算單株平均產(chǎn)量。

1.3.3 小容器發(fā)酵

采用小容器（20 L玻璃罐），參考MULERO J等[20]改進的干紅葡萄酒發(fā)酵工藝進行釀造。每個處理稱取20 kg果穗，人工除梗破碎后入20 L的玻璃罐，立即加入60 mg/L的SO2攪勻，1 h后加20 mg/L果膠酶，溫度控制在25 ℃，24 h后加入200 mg/L活化后的干酵母（酵母名稱為LAFASE HE GRAND CRU）進行酒精發(fā)酵，使用干凈的紗布蓋住玻璃罐罐口，早晚各壓帽一次，并測量其比重和溫度，比重降至1.000時進行皮渣分離，繼續(xù)發(fā)酵至比重降至0.992～0.996，并基本不變時加入60 mg/L的SO2終止發(fā)酵，并滿罐密封15 d，之后裝瓶并陳釀120 d。

1.3.4 葡萄和葡萄酒中基本理化指標的測定

葡萄中可溶性固形物、可滴定酸、pH值以及葡萄酒中殘?zhí)恰⒕贫?、揮發(fā)酸、總酸含量均參照王華[21]的方法。葡萄果實中總酚類物質(zhì)的測定采用福林-肖卡法[22]；總花色苷含量的測定采用pH示差法[23]；總類黃酮含量的測定采用蘆丁-甲醇顯色法[24]，采用p-DMACA-鹽酸法測量總黃烷醇含量[25]。

1.3.5 單體酚類物質(zhì)的測定

單體花色苷物質(zhì)檢測采用Agilent 1100 系列LC/MSD Trap-VL液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，配有二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）。流動相A：甲酸/乙腈/水=2/6/92（V/V/V），流動相B：甲酸/乙腈/水=2/54/44（V/V/V）。流動相B洗脫程序如下：1～18 min，10%～25%；18～20 min，25%；20～30 min，25%～40%；30～35 min，40%～70%；35～40min；70%～100%，流速為1.0mL/min；進樣量為30μL，每個樣品重復進2次?；ㄉ盏亩ㄐ匝芯扛鶕?jù)中國農(nóng)業(yè)大學葡萄酒中心建立的“葡萄與酒花色苷HPLC-UV-MS指紋譜庫”進行[26]?；ㄉ斩恳远谆ù渌?3-O-葡萄糖苷的含量計，其中以二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷為外標物建立5～500 mg/L之間、9個梯度、3個重復的標準曲線，決定系數(shù)在0.999以上。

單體非花色苷酚類物質(zhì)的檢測采用Agilent 1200系列LC/MSD高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀，可變波長檢測器，流動相A相為0.1%的乙酸水溶液，流動相B相為1%的乙酸乙腈溶液，進樣量為2 μL，流速為1 mL/min，每個樣品重復進2次[27]。非花色苷的定性與定量參考LIANG N N等[26]的方法進行，葡萄酒中非花色苷質(zhì)量濃度單位用mg/L表示。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)分析采用Excel 2010以及SPSS Statistics 17.0軟件進行分析，用Duncan法進行多重比較，P＜0.05 表示差異達到顯著水平，運用Origin 8.5進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉幕形與果穗留量對葡萄單株產(chǎn)量及成熟度的影響

不同葉幕形和果穗留量對單株產(chǎn)量和成熟度的影響見表1。由表1可知，V形葉幕單株產(chǎn)量略低于直立形葉幕，但兩者差異不顯著（P＞0.05），V形葉幕葡萄果實中可溶性固形物含量比直立形葉幕顯著提高21.3%（P＜0.05），可滴定酸含量比直立形葉幕顯著降低10.9%（P＜0.05），這可能是因為葉幕張開可增加葡萄葉片的光照面積，有利于葡萄果實中糖分的積累[28]。對于留穗量，隨著單株果穗數(shù)量的減少，葡萄單株產(chǎn)量逐漸降低，但果實中可溶性固形物含量逐漸增加，這與前人研究一致[29]。果穗留量為10時，葡萄中可溶性固形物含量最高，但和果穗留量為15時無顯著性區(qū)別（P＞0.05），比果穗留量為20時顯著高12.9%（P＜0.05）。故適當?shù)氖杷牖蚶肰形葉幕栽培有利于提高葡萄的成熟度。

表1 不同葉幕形和果穗留量對單株產(chǎn)量和成熟度的影響Table 1 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on the yield per plant and ripeness

2.2 葉幕形與果穗留量對葡萄果實酚類物質(zhì)的影響

對不同處理果實中酚類物質(zhì)進行檢測，結(jié)果見表2。由表2可知，對于兩種葉幕形，葡萄果實中總酚、總類黃酮和總花色苷含量沒有顯著差別（P＞0.05），但V形葉幕果實中總黃烷醇物質(zhì)含量比直立葉幕高9.7%，說明葡萄的葉幕張開，有利于葡萄果實中總黃烷醇物質(zhì)的積累。果穗留量為10和15的成熟葡萄果實中總酚、總黃烷醇、總類黃酮和總花色苷含量均高于果穗留量為20的處理，故適當?shù)臏p少葡萄植株的單株果穗數(shù)有助于提高葡萄果實中酚類物質(zhì)含量，這可能是由于果穗數(shù)量的減少改善了樹體的庫源平衡，從而促進了風味物質(zhì)的積累[30]。

表2 不同葉幕形和果穗留量對葡萄果實中酚類物質(zhì)含量的影響Table 2 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on phenolic contents in grape fruits mg/g

2.3 葉幕形與果穗留量對葡萄酒常規(guī)理化指標的影響

不同葉幕形與果穗留量對葡萄酒理化指標的影響見表3。由表3可知，各處理所釀葡萄酒中酒精度和殘?zhí)呛烤蠂鴺艘?。兩種葉幕形下所釀造的葡萄酒中殘?zhí)恰⒕凭群繘]有顯著差別（P＞0.05）。對于果穗量，果穗留量為10時葡萄酒中殘?zhí)呛勘裙肓袅繛?0和15時分別高2.1%、8.8%，但是差異并不顯著（P＞0.05），果穗留量為10時葡萄酒中總酸含量分別比果穗留量為15和20顯著高12.6%和23.3%（P＜0.05），表現(xiàn)為隨著果穗數(shù)量的增加呈現(xiàn)降低趨勢；果穗留量為20時酒精度分別比果穗留量為10和15顯著降低5.7%和5.8%（P＜0.05），這與其葡萄果實的成熟度有關(guān)，由于發(fā)酵作用可將葡萄汁中的糖轉(zhuǎn)換為酒精，由于果穗留量為20時果實成熟度較低，故其酒精度較低。

表3 不同葉幕形與果穗留量對葡萄酒理化指標的影響Table 3 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on physicochemical indexes of wine

2.4 葉幕形與果穗留量對葡萄酒單體酚類物質(zhì)的影響

2.4.1 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中花色苷單體酚類物質(zhì)的影響

不同處理葡萄酒中單體花色苷含量以及種類比例如表4。由表4可知，兩種葉幕均檢測出7種花色苷單體，包括3種非?；ㄉ蘸?種?；ㄉ?，其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷及其乙?；衔锼急戎剌^大，V形葉幕下葡萄酒中?；ㄉ蘸头酋；ㄉ站@著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中?；ㄉ蘸浚?3.46 mg/L）是直立葉幕的2.8倍。V形葉幕下葡萄酒中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷均顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷（72.54 mg/L）是直立葉幕（38.61 mg/L）的1.9倍。?；ㄉ沼兄谠黾悠咸丫祁伾姆€(wěn)定性，甲基化含量有助于提高葡萄酒中紅色色調(diào)[31]，故采用V形葉幕栽培所釀造葡萄酒顏色較深且穩(wěn)定性較好。

對于不同的果穗量，各處理均檢測出7種花色苷單糖苷，?；ㄉ照蓟ㄉ湛偭康?0%～30%，其中甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷在果穗留量為20的處理中含量極低。葡萄酒中單體花色苷總量表現(xiàn)為果穗留量為15（103.32 mg/L）＞果穗數(shù)量為10（99.85 mg/L）＞果穗數(shù)量為20（50.73 mg/L），當果穗數(shù)量為15時，?；瘑误w花色苷含量（29.52 mg/L）是果穗留量為20（11.95 mg/L）的2.50倍，但與果穗留量為10時差異不顯著（29.38 mg/L）（P＞0.05）。果穗留量為15的處理二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷含量（72.01 mg/L）是果穗留量為20（38.61 mg/L）的1.90倍，比果穗留量為10時（68.76 mg/L）高4.73%，但差異不顯著（P＞0.05）。果穗留量為10時二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）-葡萄糖苷含量（25.29 mg/L）分別是果穗留量為20（10.15 mg/L）的1.50倍，比果穗留量為15時（10.15 mg/L）顯著提高8.9%（P＜0.05）。這可能與疏穗增加了果穗的受光面積，提高了葡萄成熟度，從而有利于單體酚類物質(zhì)的合成以及花色苷的積累有關(guān)[32]。葡萄酒中在葡萄酒釀造過程中，若葡萄具有較高的成熟度，會增大葡萄細胞壁的降解，使葡萄果皮中花色苷更容易被提取到葡萄酒中[33]，果穗留量為20的處理，葡萄果實成熟度低于果穗留量為10和15的處理，不利于果皮中花色苷的提取。綜上所述，減少果穗留量或采用V形葉幕栽培均有利于葡萄酒中單體花色苷含量的提高，提高葡萄酒顏色的穩(wěn)定性。

表4 不同葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體花色苷物質(zhì)的影響Table 4 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on anthocyanins in wine

2.4.2 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中非花色苷單體酚類物質(zhì)的影響

葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體非花色苷物質(zhì)的影響見表5。由表5可知，不同處理均檢測出10種非花色苷單體物質(zhì)，主要包括3種黃烷醇類物質(zhì)、3種酚酸類物質(zhì)以及4種黃酮醇類物質(zhì)，三類物質(zhì)在葡萄酒中所占總量比例基本一致，其中黃烷醇類物質(zhì)占非花色苷單體總量的10%左右，酚酸類物質(zhì)占非花色苷單體總量的15%左右，黃酮醇類物質(zhì)占非花色苷單體總量的75%左右。對于不同的葉幕形，V形葉幕非花色苷單體總含量（286.25 mg/L）是直立葉幕（194.19 mg/L）的2.18倍，黃烷醇類總量和黃酮醇類總量均表現(xiàn)為V形葉幕顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），這與V形葉幕分開，減少了果實和內(nèi)部葉片的遮蔽，從而有利于果實著色以及果實糖含量的積累有關(guān)[34]。此外，葡萄果實曝光面積的增加會增加黃酮醇與花色苷共同色素沉著現(xiàn)象，從而提高葡萄或葡萄酒中黃酮醇類物質(zhì)含量[35]。

表5 葉幕形和果穗留量對葡萄酒中單體非花色苷物質(zhì)的影響Table 5 Effect of different canopy shapes and cluster number per vine on non-anthocyanins in wine

對于單株果穗數(shù)，非花色苷單體總含量隨著果穗數(shù)量的增加逐漸降低，其中果穗數(shù)量為10（416.23 mg/L）和15的處理（380.70 mg/L）非花色苷總量分別是新梢留量為20（194.87mg/L）的2.10倍和1.90倍。果穗留量為10（338.44mg/L）和15（313.82 mg/L）時葡萄酒中黃酮醇類物質(zhì)總量分別是果穗留量為20（142.00 mg/L）的2.38和2.21倍，果穗量為10和15時葡萄酒中黃烷醇類物質(zhì)總量分別比果穗量為20時顯著高72.4%和44.4%（P＜0.05），故適度的減少果穗數(shù)有利于黃酮醇和黃烷醇類物質(zhì)的積累。

3 結(jié)論

本試驗以赤霞珠為試材，進行小容器發(fā)酵實驗，主要研究葉幕形與果穗留量對葡萄酒中單體酚類物質(zhì)的影響，結(jié)果表明，在V形葉幕下，葡萄果實的成熟度較好，葡萄酒中花色苷單體酚類物質(zhì)與非花色苷單體酚類物質(zhì)均顯著高于直立形葉幕（P＜0.05），其中?；ㄉ蘸渴侵绷⑿稳~幕的2.80倍，葡萄酒呈色較好。對于籬形架栽培的葡萄，適當?shù)臏p少果穗有利于提高葡萄果實的成熟度和葡萄酒中單體酚類物質(zhì)含量，其中當單株果穗數(shù)為15時，葡萄酒中單體花色苷含量最高。綜上所述，在山西晉中南地區(qū)，對于釀酒品種赤霞珠而言，適度的降低單株果穗留量或者改造為V形葉幕栽培，有利于提高葡萄酒中單體酚類物質(zhì)含量。