一種獼猴桃果酒專用酵母的高效篩選方法

韋 婷 ，何靖柳，楊冬雪，李成忠，李忠琴，陸小琴，程金權(quán)

（1.雅安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川雅安 625000；2.四川省食品發(fā)酵工業(yè)研究設(shè)計院，四川成都 611130）

獼猴桃（Actinidia chinensisPlanch）屬于獼猴桃科（Actinidiaceae）獼猴桃屬（Actinidia）的植物果實，含有大量的糖、多酚、有機酸、酯類、多種維生素及人類所需的氨基酸等物質(zhì)，被稱為“水果之王”[1]。近年，獼猴桃栽培面積飛速增長，獼猴桃精深加工越發(fā)重要，因其果肉多汁，營養(yǎng)豐富，加工成果酒產(chǎn)品成為一大方向，但目前產(chǎn)品還存在采用葡萄酒商業(yè)酵母釀造、獼猴桃果酒典型性不強、果香不突出、風(fēng)味偏單薄、酸度過高等問題[2]，制約了獼猴桃果酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

篩選培育優(yōu)良的發(fā)酵菌種是釀制優(yōu)質(zhì)獼猴桃酒的首要保證。目前獼猴桃果酒專用酵母的篩選通常是從掩埋獼猴桃后的土壤、獼猴桃果表皮或獼猴桃?guī)す麑嵾M行無菌采樣，用純凈水、麥芽汁、獼猴桃汁或無機鹽加富[3-8]等液體培養(yǎng)，采用WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基分離，結(jié)合菌落形態(tài)、鏡檢、杜氏小管產(chǎn)氣等多級篩選[3，5，7-13]，再測定所得野生菌株的各項發(fā)酵性能，從而篩選出一株綜合性能最優(yōu)的發(fā)酵菌株[2，14-16]。整個篩選過程工作量大，隨機性較強，不利于獼猴桃果酒專用酵母篩選工作的推進。因此，探索獼猴桃果酒專用酵母的高效篩選方法具有重要的意義。

本研究探索以高糖啟動獼猴桃酒精發(fā)酵，從發(fā)酵完成的酒液中篩選獼猴桃果酒專用酵母，對獼猴桃自然發(fā)酵篩選菌種和高糖發(fā)酵篩選菌種進行了發(fā)酵性能對比和菌株鑒定，探討該方法的可行性和優(yōu)越性，以期簡化獼猴桃果酒專用菌種篩選流程，提高篩選效率。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與試劑

紅陽獼猴桃：雅安市雨城區(qū)多營鎮(zhèn)；優(yōu)質(zhì)白砂糖（純度≥99.6%）：雅安市吉選超市；體積分數(shù)95%乙醇、氫氧化鈉、無水硫酸銅、酒石酸鉀鈉（均為分析純）：成都市科龍化工試劑廠；一水合檸檬酸、偏重亞硫酸鉀（均為分析純）、葡萄糖（生化試劑）：天津市致遠化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸（體積分數(shù)≥36.0%）：四川西隴化工有限公司。

1.1.2 培養(yǎng)基

沙氏瓊脂培養(yǎng)基[17]：青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

獼猴桃清汁培養(yǎng)基[2]：成熟紅陽獼猴桃去皮破碎榨汁，按20 mg/kg比例加入果膠酶于40 ℃酶解2 h，加入白砂糖調(diào)整糖度至170 g/L，115 ℃高壓滅菌15 min。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-250-Ⅰ型霉菌培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；ZWYR-2012C型氣浴恒溫振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；VAL-3N型酒精比重計：杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司；LB32T型手持糖度折光儀：廣州市速為電子科技有限公司；ME204E/02電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；UV-1601型分光光度計：北京瑞利分析儀器；雷磁DZ-2型自動電位滴定儀：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；WITEK MS型全自動微生物質(zhì)譜檢測系統(tǒng)：法國Biomerieux SA公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種的富集與分離

取無病害、表皮無皺縮、軟化八成熟的紅陽獼猴桃200 g兩份，分別放入500 mL無菌三角瓶中，用無菌工具搗碎，一組為自然糖度[14]，此次樣品自然糖度為150 g/L；另一組加入白砂糖調(diào)節(jié)糖度為350 g/L，塞好棉塞，均于28 ℃，恒溫靜置培養(yǎng)7 d[14]。7 d后分別取兩種發(fā)酵液以連續(xù)劃線法涂抹于沙氏培養(yǎng)基平板，每種發(fā)酵液劃線兩個平行樣，于28 ℃恒溫倒置培養(yǎng)48 h。挑選疑似酵母菌落進行鏡檢，符合酵母菌落及形態(tài)特征的在沙氏培養(yǎng)基平板上進行分離純化2次，轉(zhuǎn)入沙氏培養(yǎng)基固體斜面，4 ℃冰箱保藏備用。

1.3.2 菌種擴培

將分離純化得到的菌株轉(zhuǎn)至無菌獼猴桃清汁培養(yǎng)基，裝液量150 mL/250 mL，于28 ℃、120 r/min條件下氣浴恒溫振蕩培養(yǎng)[8]，每24 h鏡檢監(jiān)測菌種生長情況，至菌種形態(tài)飽滿，出芽旺盛，菌數(shù)無明顯增長時停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵種子液。

1.3.3 菌種發(fā)酵性能測定

發(fā)酵力的測定：按5%（V/V）的接種量將發(fā)酵種子液接種于獼猴桃清汁培養(yǎng)基[2]，裝液量150 mL/250 mL，于培養(yǎng)箱22 ℃靜置恒溫發(fā)酵，每12 h測定發(fā)酵液質(zhì)量損失，至相隔2次質(zhì)量損失＜0.2 g[2]；每12 h用直尺測量發(fā)酵液起泡高度；發(fā)酵結(jié)束時測定酒液的酒精度[18]、殘?zhí)橇縖19]、總酸含量[19]，并進行感官評價[20-21]，發(fā)酵結(jié)束比較各株野生酵母的發(fā)酵力。

耐酒精度測定：因12%vol的果酒在市面上最為常見，本試驗以體積分數(shù)為95%的乙醇將獼猴桃清汁培養(yǎng)基酒精度調(diào)整為12%vol，按5%（V/V）的接種量接種不同發(fā)酵種子液，裝液量為150 mL/250 mL，于培養(yǎng)箱22 ℃靜置恒溫發(fā)酵，每12 h觀測產(chǎn)氣情況，并取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，用紫外分光光度計于波長580 nm處測定OD580nm值[2]。

耐SO2測定：SO2在果酒生產(chǎn)中具有選擇性殺菌、抑菌、澄清、抗氧化、增酸、溶解等作用，幾乎是果酒釀造中不可缺少的添加劑[22]，參考羅秦等[23-24]的研究，本試驗使用偏重亞硫酸鉀將獼猴桃清汁培養(yǎng)基中SO2含量調(diào)整為150 mg/L，按5%（V/V）的接種量接種不同發(fā)酵種子液，裝液量為150 mL/250 mL，于22 ℃培養(yǎng)箱靜置恒溫發(fā)酵，每12 h觀測產(chǎn)氣情況，并取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，用紫外分光光度計于波長580 nm處測定OD580nm值。

耐酸性測定：因獼猴桃果酒自然酸度較高，前期預(yù)實驗測得發(fā)酵液pH值接近3.0，本試驗以0.1%檸檬酸溶液將獼猴桃清汁培養(yǎng)基的pH值調(diào)整為3.0。按5%（V/V）的接種量接種不同發(fā)酵種子液，裝液量為150 mL/250 mL，于22 ℃培養(yǎng)箱靜置恒溫發(fā)酵，每12 h觀測產(chǎn)氣情況，并取發(fā)酵液適當(dāng)稀釋，用紫外分光光度計于波長580 nm處測定OD580nm值。

1.3.4 菌株鑒定

將篩選得到的菌株送至雅安市人民醫(yī)院檢驗科進行微生物質(zhì)譜檢測[25]，鑒定菌株種屬。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種富集與分離

從劃線分離的沙氏平板上挑選菌落較大、白色、光滑、不透明的單個菌落進行鏡檢，符合圓形、卵圓形、橢圓形細胞特征且多端出芽生殖的單細胞菌株在沙氏平板上進行兩次純化[14]，從兩種發(fā)酵液中分別獲得3株，共6株野生菌種，從自然發(fā)酵液中分離的菌株編號為ZR-1、ZR-2、ZR-3，高糖發(fā)酵液中分離的菌株編號為GT-1、GT-2、GT-3，6株菌株的菌落形態(tài)見圖1。

圖1 分離菌株的菌落形態(tài)Fig.1 Colony morphology of isolated strains

2.2 菌種擴培

氣浴恒溫振蕩96 h后，6株分離菌株的鏡檢結(jié)果見圖2。

圖2 分離菌株的細胞形態(tài)Fig.2 Cell morphology of isolated strains

由圖2可知，6株菌株經(jīng)氣浴恒溫振蕩96 h后，細胞形態(tài)均飽滿，出芽旺盛，無雜菌污染，停止培養(yǎng)，作為發(fā)酵種子液。

2.3 菌種發(fā)酵性能測定

2.3.1 發(fā)酵力的測定

各發(fā)酵液的起泡高度是一定時間內(nèi)菌株發(fā)酵劇烈程度的反應(yīng)，質(zhì)量減少主要是酒精發(fā)酵產(chǎn)生CO2逸出三角瓶所致，所以兩者可作為菌株發(fā)酵力指標(biāo)。6株分離菌株發(fā)酵液的起泡高度及質(zhì)量減少情況分別見圖3、圖4。

圖3 不同菌株的起泡曲線Fig.3 Foaming curves of different strains

圖4 不同菌株發(fā)酵液質(zhì)量損失曲線Fig.4 Mass loss curves of fermentation broth of different strains

由圖3和圖4可知，自然發(fā)酵液中篩選出的3株菌株差異性較大，菌株ZR-1的發(fā)酵液幾乎沒有起泡，發(fā)酵力十分微弱，發(fā)酵1 d后質(zhì)量下降，可能是高壓滅菌時棉塞吸收水分蒸發(fā)所致；菌株ZR-2起酵迅速，發(fā)酵1～2 d后起泡高度和質(zhì)量減少就達到高峰，同時發(fā)酵力回落也較快；菌株ZR-3在發(fā)酵3 d后才開始明顯起酵，發(fā)酵強度不大，但持續(xù)發(fā)酵能力較強。高糖發(fā)酵液篩選出的菌株GT-1、GT-2、GT-3總體發(fā)酵性能具有相似性，發(fā)酵1 d后均起酵，菌株GT-1發(fā)酵力居中；菌株GT-2發(fā)酵高峰后發(fā)酵力持續(xù)更長久；菌株GT-3發(fā)酵強度最大，但是回落迅速。綜合比較，來自高糖發(fā)酵液篩選的菌株GT-2更符合工業(yè)發(fā)酵菌種要求，具有較高發(fā)酵峰值和較持久的發(fā)酵能力。

6株菌株發(fā)酵后原酒的理化指標(biāo)及感官評分分別見表1、表2。

表1 原酒的理化指標(biāo)Table 1 Physical and chemical indicators of original wine

表2 原酒的感官評分Table 2 Sensory evaluation score of original wine

由表1可知，菌株ZR-1發(fā)酵后原酒的殘?zhí)橇孔罡?，?5 g/L，酒精發(fā)酵程度最低，酒精度為3%vol；菌株ZR-3發(fā)酵后原酒的殘?zhí)橇繛?3 g/L，酒精度也較低（3.8%vol）；其余4株菌株發(fā)酵后原酒的殘?zhí)橇考熬凭炔顒e不大，分別在6.0～7.2 g/L、9.0%vol～9.5%vol之間，其中菌株GT-2發(fā)酵后原酒的酒精度最高，達到9.5%vol，說明菌株GT-2的產(chǎn)酒精能力最強；由表2可知，菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3發(fā)酵后的原酒均有獼猴桃果酒風(fēng)格，且菌株GT-1發(fā)酵后的原酒總體風(fēng)味最為純正典型。

2.3.2 耐酒精度測定

對6株菌株進行耐酒精度測定，起酵情況及生長情況見圖5。

圖5 不同菌株在酒精度12%vol條件下的起泡曲線（a）及生長曲線（b）Fig.5 Foaming curves (a) and growth curve (b) of different strains under alcohol content 12%vol

由圖5a可知，菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3發(fā)酵液的起泡曲線趨勢相同，在發(fā)酵1 d后明顯起酵，第3天達到發(fā)酵峰值，在發(fā)酵6～7 d后液面不再明顯起泡；而菌株ZR-1、ZR-3被酒精抑制，發(fā)酵9 d后才出現(xiàn)明顯起酵現(xiàn)象。由圖5b可知，菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3的生長曲線趨勢相似，短暫的延滯期后，在發(fā)酵2～5 d內(nèi)達到生長高峰，隨后菌數(shù)降低。其中菌株ZR-2發(fā)酵2 d后最先達到生長高峰，隨后菌數(shù)緩慢降低，發(fā)酵8 d后趨于平穩(wěn)，表現(xiàn)出較好的耐酒精性能；其中菌株GT-1顯示出最好的耐受酒精性能，菌數(shù)持續(xù)增加到第5天到達峰值，且菌數(shù)高于其他各菌株，隨后趨于下降；菌株GT-2和GT-3在前4 d也是持續(xù)生長，隨后緩慢降低趨于平穩(wěn)，對酒精耐受性弱于菌株GT-1。菌株ZR-1和ZR-3在酒精中生長情況相似，菌數(shù)緩慢增加，在發(fā)酵第9天達到較高數(shù)量。綜上可知，12%vol酒精環(huán)境會延遲各菌株起酵時間，降低發(fā)酵強度，其中高糖發(fā)酵液中篩選到的菌株GT-1酒精耐受性最好，高糖發(fā)酵液中篩選到的菌株整體耐受性優(yōu)于自然發(fā)酵液中篩選到的菌株。

2.3.3 耐SO2測定

對6株菌株進行耐SO2測定，起酵情況及生長情況見圖6。

由圖6a可知，菌株GT-1和GT-3在觀察時間內(nèi)微弱起酵，起酵強度較低、持續(xù)時間很短；其他菌株均未起酵。由圖6b可知，菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3的生長趨勢相似，培養(yǎng)1 d后緩慢增長，發(fā)酵2～5 d內(nèi)達到生長高峰，隨后緩慢降低，以菌株GT-2生長最旺盛。菌株ZR-1和ZR-3的生長趨勢相似，在發(fā)酵1～6 d內(nèi)生長受抑制，在培養(yǎng)6 d后，快速生長，且菌株ZR-1生長強于ZR-3。說明150 mg/L SO2對6株菌株的生長和酒精發(fā)酵均有明顯的抑制作用，菌株GT-2有最好的生長耐受性，菌株GT-1和GT-3在該條件下起酵能力較好。

圖6 不同菌株在150 mg/L的SO2條件下的起泡曲線（a）及生長曲線（b）Fig.6 Foaming curves (a) and growth curves (b) of different strains under 150 mg/L SO2

2.3.4 耐酸性測定

對6株菌株進行耐酸性測定，起酵情況及生長情況見圖7。

由圖7a可知，菌株ZR-1和ZR-3一直沒有起酵；菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3在第4天開始起酵，但總體起泡高度都很低，發(fā)酵微弱；菌株GT-2、GT-3起泡最高值相當(dāng)。說明pH值為3.0的酸性環(huán)境抑制了各菌株發(fā)酵，延遲各菌株起酵時間和發(fā)酵峰值。由圖7b可知，發(fā)酵1 d后各菌株的OD580nm值均增大，菌株ZR-2、GT-1、GT-2、GT-3均呈現(xiàn)先增長到峰值再降低的趨勢，但達到峰值的時間不同，其中菌株GT-3的生長速率最高，在發(fā)酵第4天就達到生長量峰值，隨后菌數(shù)降低，菌株ZR-2、GT-2在發(fā)酵第5天達到峰值，其中菌株GT-2的生長量在各菌株中最高，菌株GT-1比其他3株菌生長緩慢，在發(fā)酵第5天達到峰值，菌數(shù)也最低；菌株ZR-1和ZR-3在觀察期內(nèi)一直處于生長狀態(tài)，且菌株ZR-3生長速率高于菌株ZR-1。說明pH值為3.0的酸性環(huán)境下各菌株仍然能生長，但對比圖2發(fā)現(xiàn)酸性條件下生長速度和變化趨勢均放緩，其中菌株GT-2耐酸性能最好，表現(xiàn)出最高的生長峰值和起泡高度。

圖7 不同菌株在pH=3.0條件下的起泡曲線（a）及生長曲線（b）Fig.7 Foaming curves (a) and growth curves (b) of different strains under pH=3.0

2.4 菌株鑒定

采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)獲取質(zhì)量圖譜，并通過VITEK MS數(shù)據(jù)庫對其進行分析，從而完成微生物鑒定。結(jié)果顯示，6株菌株中菌株ZR-1及ZR-3被鑒定為檸檬形克勒克酵母（Kloechera apiculate），其他菌株均被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

3 結(jié)論

從自然糖度（150g/L）和添加白砂糖達到高糖度（350g/L）的兩組獼猴桃汁發(fā)酵液中分別篩選出3株酵母菌，自然糖度組編號為ZR-1、ZR-2、ZR-3，高糖度組編號為GT-1、GT-2、GT-3。其中菌株ZR-1及ZR-3被鑒定為檸檬形克勒克酵母（Kloechera apiculate），其余菌株被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。通過發(fā)酵性能的測定發(fā)現(xiàn)，從產(chǎn)酒精能力、對SO2和pH為3.0酸性條件的耐受性上看，菌株GT-2最佳；從原酒感官和對酒精耐受性上看，菌株GT-1最佳；兩株菌株均來自高糖獼猴桃汁發(fā)酵液，說明高糖發(fā)酵液篩選到發(fā)酵性能優(yōu)良的釀酒酵母的幾率更大。該方法簡化了篩選流程，節(jié)省了篩選時間。綜合來看，以高糖啟動自然發(fā)酵，從發(fā)酵完成后的酒液中篩選菌株可以作為獼猴桃果酒專用酵母篩選更高效的方法。