發(fā)酵紅樹莓汁乳酸菌的篩選及抗氧化活性研究

王 惠，趙國群，馮鳳琴

（1.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北石家莊 050018；2.浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058）

乳酸菌是一類能利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸的細(xì)菌的通稱[1]。乳酸菌具有改善胃腸道、降低膽固醇、增強(qiáng)免疫力以及抗氧化等多種生理功能，已廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，是公認(rèn)的益生菌[2]。益生菌發(fā)酵果蔬汁是近年來功能性食品研究的熱點(diǎn)之一。益生菌發(fā)酵不僅能夠增加果蔬汁有機(jī)酸、香氣物質(zhì)的種類，改善風(fēng)味，而且還能夠提高降血糖、抗氧化等保健功效。任婷婷等[3]用混合乳酸菌發(fā)酵蘋果漿，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵后酯類、醇類和酮類揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)含量增加，蘋果漿風(fēng)味顯著改善。FILANNINO P等[4]用乳酸菌發(fā)酵櫻桃汁，研究發(fā)酵前后酚類物質(zhì)的變化，發(fā)現(xiàn)一些大分子的酚類物質(zhì)被分解轉(zhuǎn)化為小分子的酚類物質(zhì)，提高了生物利用度。ANKOLEKAR C等[5]研究發(fā)現(xiàn)，通過乳酸菌發(fā)酵可提高梨汁的降血糖和降血壓性能。

樹莓（Rubus corchorifoliusL.）又名山拋?zhàn)?、覆盆子和托盤等，為薔薇科懸鉤子屬灌木型植物。樹莓果實(shí)甘爽多汁，含有豐富的鞣花酸、黃酮和水楊酸等多種生物活性成分[6]。樹莓成熟后極易腐爛，不耐貯運(yùn)，目前大部分樹莓果實(shí)都用于加工樹莓汁、樹莓醬、樹莓酒等食品[7]。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，非常有必要進(jìn)一步開發(fā)功能性樹莓加工產(chǎn)品。常曼曼等[8]采用保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）發(fā)酵紅樹莓汁，發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵能產(chǎn)生愉悅的風(fēng)味物質(zhì)，使口感柔和爽口，但總酚含量和總黃酮含量顯著下降。樹莓汁的乳酸菌發(fā)酵研究的總體相對(duì)較少，目前尚沒有適于樹莓汁發(fā)酵的專用乳酸菌菌種。影響果蔬汁乳酸發(fā)酵質(zhì)量的因素包括果蔬品種、成熟度、發(fā)酵菌種、發(fā)酵工藝等，選擇能適應(yīng)果蔬汁發(fā)酵條件且風(fēng)味優(yōu)良的乳酸菌種尤為關(guān)鍵。

本研究從抗氧化活性、胃腸道環(huán)境耐受性、抑菌性能及菌體生長能力四個(gè)方面對(duì)12株乳酸菌進(jìn)行評(píng)價(jià)篩選，從中篩選出優(yōu)良乳酸菌株；并采用優(yōu)選菌株發(fā)酵紅樹莓汁，以期為功能性發(fā)酵樹莓汁飲料的產(chǎn)業(yè)化開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株及原材料

短桿菌（Lactobacillus brevis）S1、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）W1、SL、LGG、干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）YSHM3、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）W3、副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YN4、YJ1、YJ4、YJ10、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）T34、Lactobacillus acidipiscis（YJ5）：浙江大學(xué)食品營養(yǎng)健康益生菌菌種保藏庫；冷凍紅樹莓（品種：哈瑞太茲）：上海禪蓮生物科技有限公司；人工胃液：北京索萊寶科技有限公司；人工小腸液：上海源葉生物科技有限公司；。

1.1.2 化學(xué)試劑

總抗氧化能力檢測試劑盒（（2,2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）diammonium salt，ABTS））、總抗氧化能力檢測試劑盒（（鐵離子還原/抗氧化能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP））：碧云天生物技術(shù)研究所；果膠酶（酶活50 000 U/g）：寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：美國Sigma公司；1,10-鄰菲羅啉（純度＞98%）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

MRS、LB培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

L18-Y928S破壁機(jī)：九陽股份有限公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī)：安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；M200PRO酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；LRH-25OF生化培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PHSJ-4F pH計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；FS-250超聲處理器：上海生析超聲儀器有限公司。1100型高效液相色譜儀：美國安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 發(fā)酵紅樹莓汁的加工工藝及操作要點(diǎn)

冷凍樹莓→解凍→打漿→酶解→調(diào)糖→滅菌→接種→發(fā)酵→發(fā)酵紅樹莓汁

操作要點(diǎn)：

解凍、打漿：冷凍紅樹莓果實(shí)在室溫條件下自然解凍，用破壁機(jī)打漿。

酶解：紅樹莓打漿后加入2%果膠酶，40 ℃水浴中酶解3 h，2層紗布過濾，得到紅樹莓汁。

成分調(diào)整：加入白砂糖調(diào)節(jié)其糖度至16.5°Bx。

滅菌：85 ℃條件下滅菌20 min，保存?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌的活化：將保存的乳酸菌株接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h?；罨蟮娜樗峋糜? ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

接種：按4%的接種量接入活化后的乳酸菌。

發(fā)酵：在37 ℃條件下進(jìn)行厭氧發(fā)酵，定時(shí)取樣測定活菌數(shù)，當(dāng)活菌數(shù)不再增加時(shí)，終止發(fā)酵。

1.3.2 無菌體發(fā)酵液和菌懸液的制備

將乳酸菌活化后接種于MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，培養(yǎng)液在8 000 r/min條件下離心5 min，將菌體和上清液分離。收集的菌體用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）洗滌2次，然后再將菌體用無菌PBS制成菌懸液，并調(diào)整菌懸液OD600nm值=1。上清液用0.22 μm的無菌濾膜過濾，即得無菌體發(fā)酵液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 抗氧化活性測定

（1）清除DPPH自由基能力的測定[9]

吸取0.5 mL樣品，加入0.5 mmol/L的DPPH-乙醇溶液0.5 mL，室溫避光條件下靜置反應(yīng)30 min后，5 000 r/min離心10 min，取上清液在波長517 nm處，測其吸光度值。對(duì)照組將樣品換為無菌PBS溶液，空白組將DPPH-乙醇溶液換為乙醇溶液。DPPH自由基清除率的計(jì)算公式如下：

式中：A為樣品組吸光度值；Ai為空白組吸光度值；A0為對(duì)照組的吸光度值。

（2）清除羥基自由基能力的測定[10]

吸取0.5 mL 2.5 mmol/L的1，10-鄰菲羅啉加入1.0 mL的PBS緩沖液中，混勻，向混合液中加入0.5 mL 2.5 mmol/L的硫酸亞鐵，混勻，加入0.5 mL 2.5 mmol/L的過氧化氫，混勻，最后加入0.5 mmol/L的處理后的樣品，混勻后置于37 ℃條件下，反應(yīng)2 h。其中對(duì)照組將樣品換成等量的蒸餾水，空白組將過氧化氫和樣品都換成等量的蒸餾水。反應(yīng)完成后，8 000 r/min離心10 min，取上清液，在波長536 nm條件下測定OD536nm值。羥基自由基清除率的計(jì)算公式如下：

（3）ABTS法測定總抗氧化能力

按照試劑盒要求配制ABTS工作液和測定操作。利用試劑盒中的Trolox標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出樣品的ABTS 總抗氧化能力。

（4）FRAP法測定總抗氧化能力

按照試劑盒要求配制FRAP工作液和測定操作。利用試劑盒中的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)品得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出樣品的FRAP總抗氧化能力。

1.3.4 胃腸道環(huán)境耐受性的測定

參考趙芳等[11]的方法，采用模擬胃腸道環(huán)境測定乳酸菌株的耐受性。將活化好的乳酸菌在8 000 r/min條件下離心5 min，棄上清液，用無菌PBS洗滌菌體2次，再用PBS重懸菌體至原來體積。取0.5 mL菌懸液加入4.5 mL人工胃液，于37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別在0 h、3 h時(shí)，取樣采用平板稀釋法[12]測定其活菌數(shù)。然后，吸取0.5 mL處理3 h的含菌人工胃液與4.5 mL人工腸液混合，繼續(xù)于37 ℃厭氧靜置培養(yǎng)，在8 h時(shí)取樣測定其活菌數(shù)，計(jì)算存活率。

1.3.5 抑菌性能的測定

使用瓊脂孔擴(kuò)散法測定乳酸菌株的抑菌性能[13]。取20 mL滅菌冷卻至45 ℃的LB固體培養(yǎng)基分別與1 mL大腸桿菌（Escherichia coli）、金色葡萄球菌菌液（Staphylococcus aureus）（105～106CFU/mL）一起倒入平板混勻，待凝固后于平板上打孔，孔徑為8 mm。將已制備好的無菌上清液（將培養(yǎng)好的乳酸菌液離心，上清液用0.22 μm的微孔濾膜過濾除菌，置于-80 ℃保存）100 μL加入孔中，以等體積已滅菌的MRS培養(yǎng)基為對(duì)照，置于4 ℃冰箱中擴(kuò)散12 h，取出放入37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，測量其抑菌圈直徑。

1.3.6 分析檢測

總黃酮的測定采用NaNO2-Al（NO2）3-NaOH比色法[14]、總酚含量的測定采用福林酚法[15]、總酸的測定采用酸堿滴定法[16]、有機(jī)酸的測定采用高效液相色譜法[17]。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，試驗(yàn)結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（Mean+SD）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良乳酸菌株的篩選

2.1.1 不同菌株菌懸液及發(fā)酵液的抗氧化活性

乳酸菌具有抗氧化作用，但菌株之間的抗氧化活性具有較大的差異[18-19]。由表1可知，同一株菌的不同組分的DPPH自由基清除能力不同，無菌體發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力優(yōu)于細(xì)胞菌懸液，這一結(jié)果與林祥娜等[19]的研究結(jié)果一致。12株乳酸菌無菌體發(fā)酵液均具有較好的清除DPPH自由基能力，其清除能力在59.98%～71.23%之間，其中清除能力較強(qiáng)的依次為菌株YJ5＞菌株YJ1＞菌株SL，而菌株YN4的清除能力最弱；12株乳酸菌細(xì)胞菌懸液的清除DPPH自由基能力較弱，其清除能力在9.02%～13.53%之間，其中清除能力較強(qiáng)的依次為菌株YJ1＞菌株YN4＞菌株W3，而菌株W1的清除能力最弱。

由表2可知，細(xì)胞菌懸液的羥基自由基清除能力強(qiáng)于無菌體發(fā)酵液。12株乳酸菌的細(xì)胞菌懸液均具有較強(qiáng)的清除羥基自由基能力，但菌株之間的清除能力有顯著的差異。細(xì)胞菌懸液羥基自由基清除能力最強(qiáng)的為菌株T34，其次是菌株YJ1和菌株YJ5，而菌株SL清除能力最弱；12株乳酸菌無菌體發(fā)酵液的清除羥基自由基能力較弱，且菌株之間的差異較小，其中清除能力較強(qiáng)的依次為菌株YJ1＞菌株YN4＞菌株YJ10。

表1 不同乳酸菌菌株菌懸液及發(fā)酵液的DPPH自由基清除能力Table 1 DPPH free radical scavenging capacity of suspension and fermentation broth of different lactic acid bacteria

表2 不同乳酸菌菌株菌懸液及發(fā)酵液的羥基自由基清除能力Table 2 Hydroxyl free radical scavenging capacity of suspension and fermentation broth of different lactic acid bacteria

2.1.2 模擬胃腸道環(huán)境耐受性

益生菌被攝入人體后，在人體腸道中存活和定殖能力的強(qiáng)弱直接決定著其是否能發(fā)揮益生作用，因此耐胃酸、腸液等特性是優(yōu)良乳酸菌作為益生菌的一個(gè)重要指標(biāo)[11]。由表3可知，不同乳酸菌株對(duì)人工胃液、人工腸液的耐受性有很大的差異。菌株SL對(duì)胃腸道環(huán)境具有良好的耐受性，經(jīng)過胃腸液處理后其細(xì)胞存活率達(dá)73.43%，而菌株YN4對(duì)胃腸道環(huán)境耐受性很差，其細(xì)胞存活率僅為15.71%。在所試驗(yàn)的12株乳酸菌中，對(duì)胃腸道環(huán)境耐受性最好的三株菌依次是SL、YJ1和T34。

表3 不同乳酸菌菌株模擬胃腸道環(huán)境耐受性Table 3 Tolerance of different lactic acid bacteria to simulated gastrointestinal environment

2.1.3 抑菌性能

由表4可知，12株乳酸菌均對(duì)大腸桿菌、金色葡萄球菌具有顯著的抑制作用（P＜0.05），其中對(duì)金色葡萄球菌的抑菌性能好于對(duì)大腸桿菌，同一菌株對(duì)金色葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑。對(duì)于抑制大腸桿菌而言，抑菌性能最好的依次為菌株YJ10＞菌株YJ1＞菌株SL，而對(duì)于抑制金色葡萄球菌而言，菌株YJ1的抑菌圈直徑最大（26.85 mm），其次是菌株W1（25.57 mm）和菌株YN4（25.44 mm）。菌株YJ1對(duì)大腸桿菌和金色葡萄球菌均表現(xiàn)出良好的抑菌性能，其抑菌圈直徑分別達(dá)到17.46 mm和26.85 mm。

表4 不同乳酸菌菌株的抑菌活性Table 4 Antibacterial activity of different lactic acid bacteria

2.1.4 樹莓汁中的生長能力

根據(jù)上述試驗(yàn)結(jié)果，從抗氧化活性、胃腸道環(huán)境耐受性和抑菌性能三個(gè)指標(biāo)綜合考慮，12株乳酸菌中綜合性能最好的為菌株YJ1，菌株SL、YJ5、YJ10 和T34綜合性能也較好。除了具有良好的抗氧化活性、胃腸道環(huán)境耐受性和抑菌性能外，在發(fā)酵紅樹莓汁時(shí)，還要求乳酸菌能在高酸度的紅樹莓汁中良好生長。由圖1可知，菌株YJ1、SL、T34、YJ5和YJ10均可在紅樹莓汁中良好生長，其中生長最好的是菌株YJ1，發(fā)酵36 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，9.45 lg CFU/mL；YJ10生長得相對(duì)較差，發(fā)酵48 h時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大值，8.55 lg CFU/mL。綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，選擇副干酪乳桿菌YJ1為最佳的紅樹莓汁乳酸菌發(fā)酵菌株。

圖1 不同乳酸菌株在紅樹莓汁中的生長能力Fig.1 Growth capacity of lactic acid bacteria in red raspberry juice

2.2 發(fā)酵前后紅樹莓汁成分的變化

按4%接種量將副干酪乳桿菌YJ1接入紅樹莓汁中，37℃厭氧發(fā)酵60 h。發(fā)酵結(jié)束后，測定發(fā)酵紅樹莓汁的總黃酮、總酚、可滴定酸和有機(jī)酸含量，結(jié)果見表5。

由表5可知，經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，樹莓汁中總黃酮和總酚含量都有了極顯著的增加（P＜0.01），其中總黃酮含量增加了23%，總酚含量增加了18.58%，這與冉玉兵等[20]的結(jié)果一致，其原因可能與發(fā)酵過程中乳酸菌的生物降解作用或酸水解反應(yīng)將聚合酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成更多簡單酚類物質(zhì)有關(guān)，或可能由于發(fā)酵過程中產(chǎn)生的微生物酶類（如葡糖甘酶、淀粉酶），分解植物細(xì)胞壁或淀粉，進(jìn)而促進(jìn)了多酚類物質(zhì)的釋放；然而，常曼曼等[8]發(fā)現(xiàn)，與紅樹莓原汁相比，乳酸菌發(fā)酵后的樹莓汁總酚含量和總黃酮含量顯著下降，其原因可能與使用的原料及乳酸菌種有關(guān)。從表5還可發(fā)現(xiàn)，與發(fā)酵前的紅樹莓原汁相比，發(fā)酵后的樹莓汁總酸極顯著增加（P＜0.01），這是由于乳酸菌在樹莓汁中生長產(chǎn)酸的緣故。紅樹莓果實(shí)的主要有機(jī)酸為檸檬酸、蘋果酸、富馬酸等。經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵，檸檬酸和蘋果酸含量減少，特別是檸檬酸含量降低了35.54%，而乳酸、乙酸、酒石酸和富馬酸含量增加，其中乳酸含量的增加量最大，達(dá)到了27.04 g/L。乳酸的酸味柔和，有后酸味，乳酸含量的增加使得紅樹莓汁口感更加柔和。

表5 發(fā)酵前后紅樹莓汁成分對(duì)比Table 5 Comparison of components in red raspberry juice before and after fermentation

2.3 發(fā)酵紅樹莓汁的抗氧化活性

將副干酪乳桿菌YJ1接入紅樹莓汁中，37 ℃厭氧發(fā)酵60 h，發(fā)酵結(jié)束后測定紅樹莓汁的抗氧化活性，結(jié)果見表6。由表6可知，與未發(fā)酵的紅樹莓汁相比，發(fā)酵后紅樹莓汁清除DPPH、羥基自由基的能力有了明顯改善，其DPPH清除能力提高了22.92%，羥基自由基清除能力提高了15.63%。發(fā)酵后紅樹莓汁ABTS總抗氧化能力從23.27 mmol/L增加至31.72 mmol/L，增加了36.31%；發(fā)酵后紅樹莓汁FRAP總抗氧化能力從18.92 mmol/L增加至26.39 mmol/L，增加了39.48%。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵提高了紅樹莓汁的抗氧化活性。造成這種結(jié)果的原因，可能與乳酸菌發(fā)酵后樹莓汁中總黃酮和總酚含量顯著增加（見表5）有關(guān)。

表6 發(fā)酵紅樹莓汁的抗氧化活性Table 6 Antioxidant activity of fermented red raspberry juice

3 結(jié)論

從抗氧化活性、胃腸道環(huán)境耐受性、抑菌性能及紅樹莓汁中生長能力四個(gè)方面對(duì)12株乳酸菌進(jìn)行了綜合評(píng)價(jià)篩選，從中篩選出1株優(yōu)良乳酸菌株，即副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）YJ1。采用副干酪乳桿菌YJ1發(fā)酵紅樹莓汁，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過乳酸菌發(fā)酵的紅樹莓汁中總黃酮、總酚含量分別增加了23%、18.58%。發(fā)酵后紅樹莓汁總酸也極顯著增加（P＜0.01），其中增加的有機(jī)酸主要是乳酸。與未發(fā)酵的紅樹莓原汁相比，發(fā)酵后的紅樹莓汁體外抗氧化活性顯著提高（P＜0.01），其DPPH和羥基自由基清除能力分別提高了22.92%、15.63%；ABTS和FRAP總抗氧化能力分別增加了36.31%、39.48%。結(jié)果表明，乳酸菌發(fā)酵紅樹莓汁具有一定的抗氧化活性。