綠衣觀音土曲培養(yǎng)過程中微生物及酶系的動(dòng)態(tài)變化

唐 潔，陳申習(xí)，張 磊，張 龍，楊 強(qiáng)

（勁牌有限公司勁牌研究院中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北大冶 435100）

白酒發(fā)酵是一個(gè)獨(dú)特復(fù)雜的邊糖化和邊發(fā)酵過程，而酒曲是白酒釀造必不可少的糖化、發(fā)酵和生香劑[1]。傳統(tǒng)的酒曲制作是一種在開放環(huán)境中自然固態(tài)發(fā)酵過程，可以從環(huán)境和原料中富集、網(wǎng)絡(luò)各種微生物形成復(fù)雜的微生物菌群，同時(shí)產(chǎn)生重要的酶類（如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等），并且酒曲中所網(wǎng)羅的菌種豐度、協(xié)調(diào)性及在制曲過程形成的風(fēng)味前驅(qū)物質(zhì)，是酒體質(zhì)量和產(chǎn)量的重要保障[2-5]。因此，酒曲成為釀酒品控的核心指標(biāo)之一。酒曲根據(jù)培養(yǎng)達(dá)到的頂溫可分為低溫酒曲（40～50 ℃）、中溫酒曲（50～60 ℃）和高溫酒曲（60～70 ℃）；根據(jù)產(chǎn)酒的風(fēng)味主要分為清香、濃香和醬香型酒曲；根據(jù)形狀可分為大曲、小曲和麩曲[6]。綠衣觀音土曲（簡介土曲）又名“綠衣小曲”、“綠曲”、“南曲”，是清香型白酒小曲曲種之一，被廣泛應(yīng)用在湖北、湖南、江西等地[7]。綠衣觀音土曲是以觀音土、米粉、米糠為主要原料，接入曲種通過加水拌料，制成坯，入箱進(jìn)行微生物培育，開箱后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)室進(jìn)行一至七燒共7輪培養(yǎng)，然后烘干而成。

近幾年，關(guān)于酒曲微生物多樣性、風(fēng)味特征方面的研究較多。YAN S B等[8]研究發(fā)現(xiàn)，濃香型酒曲中含有14個(gè)種屬的酵母和43種風(fēng)味物質(zhì)，且優(yōu)勢(shì)菌為庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）和Saturnispora silvae；ZOU W等[9]綜述了濃香型酒曲微生物多樣性，闡明了細(xì)菌類芽孢菌屬（Bacillus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和高溫放線菌屬（Thermoactinomyces）是優(yōu)勢(shì)菌，酵母菌主要有酵母屬（Saccharomyces）、復(fù)膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、畢赤酵母屬（Pichia）、威克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）、有孢漢遜酵母屬（Hanseniaspora）、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、絲孢酵母屬（Trichosporon）、德巴利酵母屬（Debaryomyces）和鎖擲酵母屬（Sporidiobolus），霉菌主要有曲霉屬（Aspergillus）、橫梗霉屬（Lichtheimia）、嗜熱真菌屬（Thermomyces）、熱子囊菌屬（Thermoascus）、犁頭霉屬（Absidia）和地霉屬（Geotrichum）；JIN Y等[10]研究發(fā)現(xiàn)，醬香型大曲中芽孢桿菌目（Bacillales）、腸桿菌目（Enterobacteriales）和乳桿菌目（Lactobacillales）是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，而真菌中假絲酵母屬（Candida）、木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）、絲孢酵母屬（Trichosporon）和嗜熱真菌屬（Thermomyces）占主導(dǎo)地位，且建立了醬香型酒曲微生物代謝圖譜；FAN G S等[11]研究發(fā)現(xiàn)，老化有助于豐富和穩(wěn)定清香型大曲中的微生物種群，使微生物之間的相互作用重新平衡，對(duì)提高大曲質(zhì)量和確保其穩(wěn)定性具有重要意義；LIU J J等[6]研究表明，中低溫大曲如濃香型和清香型酒曲中淀粉酶活性和多樣性最高，蛋白酶在高溫大曲如醬香型酒曲中起主導(dǎo)作用，而酯酶對(duì)濃香酒曲和醬香酒曲風(fēng)味的貢獻(xiàn)度相似；申孟林等[12]概述了大曲微生物分類以及大曲中主要酶系的功能及作用。

目前的研究主要集中于對(duì)大曲微生物、酶活、風(fēng)味物質(zhì)的研究，而對(duì)清香型小曲研究較少，特別是對(duì)制曲過程中微生物及酶活的動(dòng)態(tài)變化研究甚少。本研究選取8個(gè)批次觀音土曲培養(yǎng)過程為研究對(duì)象，了解制曲過程中（包括從曲種到成品曲出庫）微生物的種類、數(shù)量、消長變化及相關(guān)酶活（糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶）變化，為監(jiān)控觀音土曲質(zhì)量、減少酒曲質(zhì)量的波動(dòng)，提供更深層次、更本質(zhì)的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品

綠衣觀音土曲樣品由勁牌有限公司傳統(tǒng)模式制曲車間提供，分別于2018年9月、10月和11月對(duì)綠衣觀音土曲培養(yǎng)過程中（曲種、入箱、一燒、二燒、三燒、四燒、五燒、六燒和七燒）樣品進(jìn)行采集，共采集8個(gè)批次，分別為0921、0927、1011、1019、1027、1103、1111、1122批次。

1.1.2 主要試劑

蛋白胨、酵母粉、葡萄糖、瓊脂粉（均為生化試劑）、吐溫20、磷酸二氫鉀、七水硫酸鎂、檸檬酸二胺、乙二胺四乙酸、乙酸、三羥甲基氨基甲烷（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；瓊脂糖（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）Mixer：賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH自然，115 ℃滅菌15 min。

改良馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基[7]：在原有PDA培養(yǎng)基中添加牛肉膏2 g/L，酵母粉2 g/L，磷酸二氫鉀2.5 g/L，吐溫20 1.5 g/L，121 ℃滅菌20 min。

WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基[7]：儲(chǔ)液A（磷酸二氫鉀5.5 g，氯化鉀4.25 g，氯化鈣1.25 g，硫酸鎂1.25 g，蒸餾水定容至400 mL）40 mL/L、儲(chǔ)液B（氯化鐵0.25 g，硫酸錳0.25 g，蒸餾水定容至100 mL）1 mL/L、儲(chǔ)液C（0.44 g溴甲酚綠溶于10 mL蒸餾水和10 mL酒精中）1 mL/L、酵母浸粉40 g/L，蛋白胨50 g/L，葡萄糖50 g/L，瓊脂2 g/L，pH 6.5，115 ℃滅菌15 min。

MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏10g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖5 g/L，乙酸鈉5 g/L，檸檬酸二胺2 g/L，吐溫80 1 g/L，七水硫酸鎂0.2 g/L，七水硫酸錳0.05 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，瓊脂20 g/L，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉浸膏3.0 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5.0 g/L，瓊脂20 g/L，pH自然，121 ℃滅菌20 min。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，葡萄糖10 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，孟加拉紅0.033 g/L，瓊脂20 g/L，氯霉素0.1 g/L，121 ℃滅菌20 min。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉3 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，氯化鉀0.5 g/L，硫酸亞鐵0.01 g/L，蔗糖30 g/L，瓊脂20 g/L，121 ℃滅菌20 min。

其中YPD培養(yǎng)基、改良PDA培養(yǎng)基和WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別添加5‰的青霉素，MRS培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基添加15‰鏈霉素。

1.2 儀器與設(shè)備

JJ1000電子天平：常熟雙杰測(cè)試儀器廠；QYC-200全溫空氣搖床：上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SFG-02B電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備儀器廠；AL204電子分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SPX-100B-Z生化培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；BCM-1600A潔凈工作臺(tái)：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；Nikon ECLIPSE E200LED MV Series顯微鏡：日本Nikon公司；2720聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國賽默飛公司；DYY-L電泳儀：北京六一生物科技有限公司；ZF-288全自動(dòng)凝膠成像分析系統(tǒng)：上海嘉鵬科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 觀音土曲制作過程中微生物平板計(jì)數(shù)及分離純化

分別稱取觀音土曲培養(yǎng)過程中（曲種、入箱、一燒～七燒）樣品10 g于裝有100 mL無菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩30 min后，吸取1 mL作梯度稀釋，選取合適的稀釋懸液涂布于計(jì)數(shù)培養(yǎng)基中，酵母總數(shù)計(jì)數(shù)采用YPD培養(yǎng)基，霉菌采用改良PDA培養(yǎng)基，細(xì)菌采用MRS培養(yǎng)基。涂布完畢后酵母和霉菌置于30 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5 d，細(xì)菌置于37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d。采用菌落記號(hào)方式對(duì)培養(yǎng)基上長出的單菌落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，根據(jù)菌落形態(tài)不同將平板上長出的單菌落劃線接種于新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)過2～3次平板劃線后得到純化的菌落轉(zhuǎn)入相應(yīng)的試管斜面于冰箱中保存。

1.3.2 菌株的鑒定

菌株的形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定方法見參考文獻(xiàn)[13]。

1.3.3 觀音土曲制作過程中酶活的測(cè)定

酸性蛋白酶酶活測(cè)定采用福林-酚法，具體方法見SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測(cè)定法》；糖化酶酶活采用3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[14]；α-淀粉酶酶活采用Yoo改良法，具體見文獻(xiàn)[15]。

2 結(jié)果與分析

2.1 觀音土曲制作過程中微生物變化情況

2.1.1 酵母菌

觀音土曲制作過程中酵母菌菌落總數(shù)的變化見圖1。由圖1可知，觀音土曲制作過程中酵母菌落總數(shù)呈逐步上升趨勢(shì)，三燒過后酵母總數(shù)上升較快。經(jīng)過富集培養(yǎng)，酵母總數(shù)由開始曲種的107CFU/g上升至四燒后的108CFU/g，且在五燒～七燒時(shí)數(shù)量達(dá)到峰值。不同批次四燒前酵母數(shù)量差別不明顯，四燒過后，11月份制作的觀音土曲中酵母總數(shù)高于9、10月份制作的觀音土曲。通過觀察酵母形態(tài)發(fā)現(xiàn)，曲種時(shí)以釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主，隨著酒曲的培養(yǎng)，從環(huán)境和原料中網(wǎng)羅和富集越來越多的非釀酒酵母（non-Saccharomyces），培養(yǎng)至二燒時(shí)非釀酒酵母的數(shù)量高于釀酒酵母。

圖1 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中酵母菌總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.1 Dynamic change of total yeast count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

采用不同的培養(yǎng)基（①YPD培養(yǎng)基；②鹽酸調(diào)YPD培養(yǎng)基pH至3.5，不滅菌，添加7%乙醇；③乳酸調(diào)YPD培養(yǎng)基pH至3.5，不滅菌；④WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基）篩選觀音土曲制備過程中的酵母菌，根據(jù)菌落形態(tài)和顏色不同，共分離出8種不同種類的酵母，其菌落形態(tài)及描述見圖2及表1。

圖2 8株酵母菌的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of 8 strains of yeast

表1 8株酵母菌的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征的描述Table 1 Description of colony and cell morphology characteristics of 8 strains of yeast

由圖2及表1可知，大部分酵母菌菌落呈圓形突起且顏色為白色，少數(shù)扁平，且表面不光滑的較多，有幾株酵母菌落較大。

8株分離的酵母菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3，鑒定結(jié)果見表2。

圖3 基于18S rRNA序列8株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of 8 strains of yeast based on 18S rRNA sequences

表2 8株酵母菌的鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of 8 strains of yeast

由圖3及表2可知，分離的酵母菌主要是釀酒微生物，如釀酒酵母、異常威克漢姆酵母、庫德里阿茲威畢赤酵母等，這些是主要的釀酒酵母和生香酵母[16-18]，其中庫德里阿茲威畢赤酵母釀酒中的生香酵母，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵食品中，具有作為益生菌和代謝產(chǎn)生物乙醇的潛力[19-20]。溶磷白地霉廣泛應(yīng)用于乳制品和酒精飲料行業(yè)中，同時(shí)也具有生物降解功能，也在醬香型白酒酒醅中分離過[21-22]。阿氏絲孢酵母普遍存在于低溫曲中，與釀酒酵母在高糖環(huán)境下混合發(fā)酵可有效降低酒中揮發(fā)性酸和乙醛的含量，同時(shí)該菌具有發(fā)酵產(chǎn)酯和產(chǎn)β-葡萄糖苷酶功能[20，23]。伯頓絲孢畢赤酵母則于高溫大曲中比較常見，具有淀粉酶活力和產(chǎn)香功能[24]。扣囊復(fù)膜孢酵母是大曲上霉的主要微生物，除高溫大曲中未發(fā)現(xiàn)外，均存在其余酒曲中，能夠表達(dá)生淀粉液化酶和糖化酶，被認(rèn)為是產(chǎn)生淀粉分解酶類的最好的子囊酵母菌之一，同時(shí)具有產(chǎn)酯能力[1，25]。

2.1.2 霉菌

采用改良PDA培養(yǎng)基跟蹤綠衣觀音土曲制備過程中霉菌總數(shù)的變化見圖4。

圖4 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中霉母菌總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.4 Dynamic change of total mold count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖4可知，霉菌的數(shù)量低于酵母和細(xì)菌，變化趨勢(shì)與酵母相近，不同批次三燒前霉母數(shù)量差別不明顯，三燒過后霉菌開始迅速增長，且11月份制作的觀音土曲中霉菌總數(shù)高于9、10月份制作的觀音土曲。通過形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)，米根霉在一燒和二燒時(shí)未檢測(cè)到，三燒過后數(shù)量明顯增加，曲種和七燒時(shí)米根霉數(shù)量為106CFU/g；曲霉在二燒時(shí)開始出現(xiàn)，數(shù)量在六燒或七燒時(shí)數(shù)量最多，為106CFU/g。

在改良PDA培養(yǎng)基分離的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用了YPD瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基和察式培養(yǎng)基對(duì)綠衣觀音土曲制備過程中霉菌進(jìn)行了分離純化，并根據(jù)霉菌菌落形態(tài)和顏色區(qū)別，共分離出7種不同種屬霉菌，其菌落形態(tài)及描述見圖5和表3，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖6，鑒定結(jié)果見表3。

圖5 7株霉菌的菌落形態(tài)Fig.5 Colony morphology of 7 strains of mold

表3 7株霉菌菌落及細(xì)胞形態(tài)特征的描述Table 3 Description of colony and cell morphology characteristics of 7 strains of mold

圖6 基于ITS rRNA序列7株霉菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 7 strains of mold based on ITS rRNA sequences

表4 7株霉菌的鑒定結(jié)果Table 4 Identification results of 7 strains of mold

由圖5、圖6及表3、表4可知，從綠衣觀音土曲中分離出的霉菌有曲霉屬、根霉屬、毛霉屬和橫梗霉屬，大多數(shù)種屬霉菌在其他香型白酒中均報(bào)道過[26-28]。其中，米根霉和棒曲霉是清香型小曲白酒優(yōu)勢(shì)霉菌[7]。米根霉是主要的糖化微生物，具有較高的糖化力和液化力，能糖化淀粉、轉(zhuǎn)化蔗糖，產(chǎn)生乳酸、反丁烯二酸及微量酒精，產(chǎn)L（+）-乳酸能力強(qiáng)[7，13]，對(duì)白酒風(fēng)味有貢獻(xiàn)作用[29]。棒曲霉同樣也具有一定的糖化酶和蛋白酶活性[7]。多枝橫梗霉具有高產(chǎn)酯酶活性，是中低溫大曲的優(yōu)勢(shì)菌[30-31]。黃曲霉具有較強(qiáng)的液化力和蛋白分解力，可用于產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶和磷酸二酯酶等，也是釀造工業(yè)中的常見菌種[30]。煙曲霉是自然界中廣泛分布的人類條件致病菌，是導(dǎo)致侵染性曲霉病的主要原因，且產(chǎn)果膠酶分解纖維素等[32]。毛霉屬常出現(xiàn)在酒曲中，能糖化淀粉并能生成少量乙醇，產(chǎn)生蛋白酶，有分解大豆蛋白的能力，我國多用來做豆腐乳、豆豉[33]。

2.1.3 細(xì)菌

綠衣觀音土曲制作過程中細(xì)菌總數(shù)的變化見圖7。

圖7 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中細(xì)菌總數(shù)的動(dòng)態(tài)變化Fig.7 Dynamic change of total bacteria count in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖7可知，綠衣觀音土曲中的細(xì)菌總數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)，峰值在一燒至三燒時(shí)出現(xiàn)，細(xì)菌數(shù)量為109CFU/g，七燒時(shí)細(xì)菌數(shù)量降至108CFU/g。入箱至三燒時(shí)數(shù)量增加最快，而此時(shí)期酵母數(shù)量變化緩慢。三燒過后，細(xì)菌數(shù)量下降，酵母數(shù)量開始明顯增加，這是由于兩大類微生物對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)所導(dǎo)致的。

采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和MRS培養(yǎng)基從綠衣觀音土曲制備過程中分離純化出好氧細(xì)菌9株和乳酸菌5種，具體菌落形態(tài)及描述見圖8和表5，系統(tǒng)發(fā)育樹見圖9，鑒定結(jié)果見表6。

圖8 細(xì)菌的菌落形態(tài)Fig.8 Colony morphology of bacteria

表5 14株細(xì)菌菌落及細(xì)胞形態(tài)特征的描述Table 5 Description of colony and cell morphology characteristics of 14 strains of bacteria

圖9 基于16S rRNA序列細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.9 Phylogenetic tree of bacteria based on 16S rRNA sequences

表6 14株細(xì)菌的鑒定結(jié)果Table 6 Identification results of 14 strains of bacteria

由圖8、圖9及表5、表6可知，分離獲得的細(xì)菌以芽孢桿菌和乳桿菌為主，其中芽孢桿菌是我國白酒釀造重要功能微生物，可水解蛋白質(zhì)和淀粉等大分子物質(zhì)，產(chǎn)丁酸及己酸等有機(jī)酸，有的還代謝產(chǎn)生吡嗪類等芳香物質(zhì)，該屬細(xì)菌為白酒發(fā)酵過程中重要的產(chǎn)酸和產(chǎn)香菌。如地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌是醬香大曲重要的產(chǎn)醬香的功能細(xì)菌，可以產(chǎn)蛋白酶和風(fēng)味物質(zhì)[33-34]。而特基拉芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶，產(chǎn)β-1,3-1,4-葡聚糖酶[35-36]。類地衣芽孢桿菌產(chǎn)抗性活性物質(zhì)，釀酒中產(chǎn)風(fēng)味物質(zhì)；可以分解氨基甲酸乙酯[37-38]。乳酸菌幾乎存在于所有的酒曲中，是白酒發(fā)酵中的主要生酸微生物，乳酸和乳酸乙酯是各種種類和香型的白酒必不可少的風(fēng)味成分。同時(shí)有些種屬乳酸菌還可以代謝產(chǎn)生蘋果酸、雙乙酰等副產(chǎn)物，對(duì)白酒風(fēng)格形成也有一定影響。因此，傳統(tǒng)研究認(rèn)為乳酸菌是白酒釀造必不可缺少的微生物。其中瑞士乳桿菌具有較強(qiáng)的蛋白水解活性，其發(fā)酵乳制品中多肽含量較高，因此具有潛在產(chǎn)生生物活性肽的能力；具有緩解高血壓、維持腸道菌群平衡、促進(jìn)鈣吸收、改善睡眠等功能，被用作保健品制成微生態(tài)制劑[39]。干酪乳桿菌作為益生菌之一被用作牛奶、酸乳、豆奶、奶油和干酪等乳制品的發(fā)酵劑及輔助發(fā)酵劑[39]，短乳桿菌具有高產(chǎn)酸能力和解毒、抑菌、提高機(jī)體免疫力等多種功能特性，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[39]。還有些一些細(xì)菌，并沒有發(fā)現(xiàn)在釀造過程中的作用，可能是雜菌，如松鼠葡萄球菌和節(jié)桿菌是致病菌[40-43]，而雞葡萄球菌則屬于非致病菌[44]。嗜溫鞘氨醇桿菌產(chǎn)絮凝劑，降解石油[45-46]，可能這些菌來自環(huán)境中。

2.2 觀音土曲制作過程中酶活變化情況

在酒曲的制作以及貯存的過程中，大曲中的微生物會(huì)代謝產(chǎn)生一系列的水解酶，如酸性蛋白酶、糖化酶、纖維素酶等。這些水解酶會(huì)將原料中大分子物質(zhì)降解成為小分子物質(zhì)供微生物生長利用，從而產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物是白酒中香味物質(zhì)或者為香味物質(zhì)提供前體物質(zhì)[47-48]。有研究表明，α-淀粉酶和蛋白酶主要是由細(xì)菌和霉菌產(chǎn)生，而糖化酶主要是由根霉、黑曲霉等霉菌產(chǎn)生[49-51]。綠衣觀音土曲制作過程中酶活變化情況見圖10。

圖10 不同批次綠衣觀音土曲制作過程中糖化酶（a）、α-淀粉酶（b）及酸性蛋白酶（c）酶活變化Fig.10 Changes of saccharifying enzyme (a),α-amylase (b) and acid proteinase activity (c) in the cultivation of different batches of Green-covering Guanyin Tuqu

由圖10可知，曲種糖化酶活力和α-淀粉酶活力最高，分別為3 000～6 000 U/g、300～600 U/g。分析原因可能是曲種作為綠衣觀音土曲生產(chǎn)的種子，其中含有一定比例強(qiáng)化的純種根霉。入箱培養(yǎng)后，糖化酶和α-淀粉酶呈逐漸上升的趨勢(shì)，均在五燒至七燒時(shí)酶活最高，七燒時(shí)糖化酶酶活為300～1 000 U/g，α-淀粉酶酶活為100～200 U/g。從微生物跟蹤檢測(cè)結(jié)果來看，曲種時(shí)米根霉數(shù)量最多，其次是五燒至七燒階段，而米根霉是產(chǎn)生糖化酶的主要微生物，這也是曲種的糖化酶酶活最高，五燒至七燒糖化酶酶活其次的原因。

相比糖化酶和α-淀粉酶，綠衣觀音土曲中酸性蛋白酶酶活較低，最高不超過50 U/g。曲種時(shí)酸性蛋白酶酶活最高，為10～50 U/g；入箱培養(yǎng)后，酸性蛋白酶酶活呈上升趨勢(shì)，六燒或七燒時(shí)酶活達(dá)到峰值，為5～50 U/g。有文獻(xiàn)報(bào)道，醬香型酒曲蛋白酶酶活最高，其次是濃香型酒曲，清香型酒曲酸性蛋白酶酶活最低[6]，說明酸性蛋白酶不是綠衣觀音土曲中主要的酶。

3 結(jié)論

綠衣觀音土曲制作培養(yǎng)過程中酵母總數(shù)呈逐步上升趨勢(shì)，三燒后酵母總數(shù)上升較快，且在五燒至七燒時(shí)數(shù)量達(dá)到峰值；細(xì)菌總數(shù)呈先上升和下降的趨勢(shì)，峰值在一燒至三燒時(shí)出現(xiàn)，數(shù)量為109CFU/g，七燒時(shí)細(xì)菌數(shù)量降至108CFU/g；霉菌的數(shù)量低于酵母和細(xì)菌。不同批次三燒前霉母數(shù)量差別不明顯，三燒過后霉菌開始迅速增長，在七燒時(shí)候達(dá)到最大（106CFU/g），且11月份制作的觀音土曲中霉菌總數(shù)高于9、10月份制作的觀音土曲。

通過形態(tài)觀察，共分離出8種酵母，經(jīng)鑒定分別為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）、阿氏絲孢酵母（Trichosporon asahii）、Apiotrichum loubieri、伯頓絲孢畢赤酵母（Hyphopichia burtonii）扣囊復(fù)膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）和溶磷白地霉（Galactomyces geotrichum）；7種霉菌主要為曲霉屬（Aspergillus）、米根霉（Rhizopus oryzae）、毛霉（Mucor）和橫梗霉屬（Lichtheimia），其中米根霉是主要的糖化菌株；9種好氧細(xì)菌和5種乳酸菌，以芽孢桿菌和乳桿菌為主，分別是枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）、類地衣芽孢桿菌（Bacillus paralicheniformis）、雞葡萄球菌（Staphylococcus gallinarum）和瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）、短乳桿菌（Lactobacillus brevis）等。

綠衣觀音土曲培養(yǎng)過程中糖化酶酶活最高，其次是α-淀粉酶，酸性蛋白酶酶活最低，且曲種中3種酶活力最高，入箱培養(yǎng)后3種酶活均呈整體上升趨勢(shì)。

本研究揭示了綠衣觀音土曲微生物及酶活的動(dòng)態(tài)變化，為微生物及觀音土曲在白酒釀造中的功能作用解析及定向調(diào)控提供技術(shù)支撐，對(duì)提升清香型小曲白酒生產(chǎn)品質(zhì)具有重要意義。