鐵皮石斛發(fā)酵酒品質(zhì)特性研究

任運紅，徐雅囡，鐘淳菲，楊子銀，杜 冰*

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州 510642；2.中國科學院華南植物園，廣東廣州 510650）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科石斛屬植物鐵皮石斛的干燥莖，因表皮呈鐵綠色而得名[1]。鐵皮石斛含有大量的多糖、生物堿、氨基酸、花色苷等營養(yǎng)成分，具有滋陰清熱、益胃生津的功效，在我國藥用歷史悠久，可入胃經(jīng)、腎經(jīng)，具有抗疲勞、抗腫瘤、祛痰鎮(zhèn)咳等獨特的藥用價值[2-4]。因其具有顯著的保健功效且口感良好，傳統(tǒng)上鐵皮石斛在民間廣泛被用于生食、榨汁、燉湯、泡茶、泡酒等[5-7]，而工業(yè)上通常加工成鐵皮石斛功能性飲料、鐵皮石斛保健品、鐵皮石斛護膚品等[8-9]。但是目前大多數(shù)鐵皮石斛產(chǎn)品還處于初級加工階段，對其精深加工不足、新產(chǎn)品研發(fā)力度不夠。

隨著人們對中草藥鐵皮石斛關注度的提高，在其傳統(tǒng)加工方法上，益生菌發(fā)酵作為一種新技術，也逐漸應用于鐵皮石斛產(chǎn)品的加工中。王超等[10]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)鼠李糖乳桿菌發(fā)酵得到的鐵皮石斛汁pH降低，有機酸含量及活菌數(shù)有所增加。薛燕等[11]采用液態(tài)發(fā)酵法發(fā)酵鐵皮石斛，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛多糖含量增加，抗氧化能力提高。目前，石斛酒主要采用浸泡的方式，但是經(jīng)簡單泡制制得的鐵皮石斛酒，不能有效地溶出其中的活性成分，降低了營養(yǎng)成分的利用率，使得產(chǎn)品口感不佳，保健作用不明顯，并常伴有飲后上頭或酒后不適等情況[12]。本課題組曾麗萍等[13]前期優(yōu)化了產(chǎn)乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）混合發(fā)酵鐵皮石斛酒工藝，本研究通過對比發(fā)酵前后鐵皮石斛酒的理化性質(zhì)及組成成分，進一步評價其品質(zhì)特性，為鐵皮石斛發(fā)酵酒的產(chǎn)品研發(fā)提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

鐵皮石斛：紅河群鑫石斛種植有限公司。

1.1.2 菌種

產(chǎn)乳酸芽孢桿菌（Bacillussp.）DU-106：篩選自傳統(tǒng)發(fā)酵奶酪，現(xiàn)由華南農(nóng)業(yè)大學新資源食品及功能性原料評價及研究中心鑒定及保存，并委托廣州市微生物所制成1×1012CFU/g的菌粉，作為發(fā)酵實驗備用；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）171：安琪酵母公司，為本實驗室保存，菌粉濃度為108CFU/g。

1.1.3 試劑

葡萄糖、亞硝酸鈉、硝酸鈉、氫氧化鈉、無水硫酸鈉、鹽酸、氯化鉀、氯仿、苯酚、甲醇、乙醚、乙醇：均為國產(chǎn)分析純；偏磷酸（優(yōu)級醇）；乙腈、甲醇（色譜純）：天津科密歐公司；酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸：美國Sigma-Aldrich公司；甲酸（色譜純）：上海斯信生物科技有限公司；乙腈（色譜純）：美國Thermo Fisher公司；pH 1.0的緩沖溶液：0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67（V/V）。

1.2 儀器與設備

PHs-3C精密pH計、752-N紫外分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；WYT手持糖量計：早州中友光學儀器有限公司；GC6890-5973MSD氣相色譜-質(zhì)譜儀、1290 Infinity液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜（liquid chromatography quadrupole-time of flight mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）系統(tǒng)：美國安捷倫公司；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津公司；DHP-600電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京市永光明醫(yī)療儀器廠；BS110S精密電子天平：北京賽多利斯天平有限公司；VD-650桌上式潔凈式工作臺：蘇州凈化設備有限公司；Laborata 4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國Heidolph公司；Esquire HCT Plus 質(zhì)譜儀：美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 鐵皮石斛酒的制備

將鐵皮石斛干品去絲絡、洗凈后切成約1 cm的小段，沸水熱燙2～3 min，瀝干后按料液比1∶4（g∶mL）加入20 g/L蔗糖溶液進行調(diào)配，制得發(fā)酵體系。分別將0.1 g產(chǎn)乳酸芽孢桿菌菌粉和0.5 g釀酒酵母菌菌粉加入50 mL生理鹽水和5 g/L蔗糖溶液中，30 ℃條件下活化30 min，然后按1∶10（V/V）的比例混合制得菌種活化液。在發(fā)酵體系中添加2%的菌種活化液，30 ℃發(fā)酵7 d，得鐵皮石斛發(fā)酵酒[13]。

1.3.2 理化指標的測定

（1）pH的測定：采用pH計測定

（2）總酸含量的測定：采用pH電位法[14]測定，并進行適當修改。

（3）酒精度的測定：參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》中的方法進行測定[15]。

（4）可溶性固形物含量的測定：參照GB/T 12143—2008《飲料通用分析方法》中的方法進行測定[16]。

1.3.3 活性成分的測定

（1）多糖含量的測定：采用苯酚-硫酸法[17]測定樣品中的多糖含量。

（2）花色苷含量的測定：采用pH示差法[18]。

（3）鐵皮石斛發(fā)酵酒紅色素的測定

選擇大孔樹脂對鐵皮石斛紅色素進行純化后進行分離鑒定，條件如下：

高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析系統(tǒng)：泵型Waters 600，檢測器Waters 2998PAD，Waters C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），檢測波長520 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測溫度30 ℃，混合洗脫劑A：0.04%甲酸-H2O，B：100%乙腈，洗脫條件：0～5 min，10%～15%B；5～10 min，15%～18%B；10～20 min，18%～20%B；20～25 min，20%～23%B；25～30 min，23%～10%B；40～45 min；保持10%B。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquidchromatographmassspectrometer，LC-MS）分析系統(tǒng)：檢測波長520 nm，流速1.0 mL/min，進樣量20 μL，檢測溫度30 ℃，混合洗脫劑A：0.04%甲酸-H2O，B：100%乙腈。

電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）系統(tǒng)：正離子模式，掃描質(zhì)量范圍：100～1 000 m/z，毛細管出口電壓：121 V，Skim 1電壓：40 V，二級質(zhì)譜MS-MS 用于斷裂[M+H]+離子。

1.3.4 有機酸組成及含量的測定[19]

采用高效液相色譜法測定酒中的有機酸：色譜條件為WondaSil C18-WR（4.6×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相0.2%偏磷酸，柱溫35 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL，檢測波長210 nm。

分別以酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸為標準品，得出各自的標準曲線回歸方程為y=0.027 5x+0.081 5，R2=0.999 6、y=0.040 3x-0.011 7，R2=0.999 9、y=0.022 5x+0.008 8，R2=1、y=0.016 3x+0.001，R2=0.999 8、y=0.051x-0.0342，R2=0.999 9。樣品溶液用超純水稀釋經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后，進行測定，根據(jù)回歸方程計算含量。

1.3.5 差異性成分的測定[20]

采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測。實驗的儀器分析平臺為LC-Q-TOF-MS系統(tǒng)，分離色譜柱為C18色譜柱（100 mm×2.1mm，1.8μm）。色譜分離條件為：柱溫35℃；流速0.5mL/min；流動相組成A：乙腈，B：水（含0.2%甲酸）；ESI正、負離子采集數(shù)據(jù)，進行梯度洗脫（0～5 min，10%A；5～20 min，10%A→20%A；20～30 min，20%A→90%A；30～40 min，90%A→5%A）。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010、SPSS17.0和T檢驗（P＜0.05）進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鐵皮石斛發(fā)酵前后性質(zhì)分析

發(fā)酵前后的理化指標及活性成分變化見表1。

表1 發(fā)酵前后的理化性質(zhì)及活性成分變化Table 1 Changes of physicochemical properties and active components before and after fermentation

由表1可知，經(jīng)混合菌發(fā)酵后鐵皮石斛酒的pH值由6.20降至3.75，總酸含量增加至0.98%，酒精度增加至5.2%vol，可溶性固形物含量由17%下降至8%。產(chǎn)乳酸芽孢桿菌主要產(chǎn)生乳酸[21]，其代謝產(chǎn)物使得樣品溶液中總酸含量升高，pH降低。而經(jīng)乳酸芽孢桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵的鐵皮石斛酒能達到色澤均勻、酸度適宜、口感柔和、香氣宜人的效果。

混合菌發(fā)酵鐵皮石斛液中的多糖含量增加至4.99 g/L?；旌暇l(fā)酵使多糖含量增加，增加的部分多糖可能是胞外多糖（exopolysaccharides，EPS），更可能的是在發(fā)酵過程中，物質(zhì)傳遞效率高，促進了鐵皮石斛中多糖的溶出，增加了鐵皮石斛酒的活性成分含量。鐵皮石斛樣品經(jīng)混合菌發(fā)酵后，總花色苷含量由11.06 mg/L升高至16.82 mg/L，上升了50%?；旌暇l(fā)酵提供的酸性環(huán)境，有利于鐵皮石斛發(fā)酵酒中花色苷的保存，提高其穩(wěn)定性[22]，且樣品經(jīng)過發(fā)酵，能夠調(diào)節(jié)溶液的滲透壓、pH值、水分活度等[23]，從而相應地提高花色苷類物質(zhì)的溶出率，增加鐵皮石斛發(fā)酵酒營養(yǎng)成分的含量。

2.2 鐵皮石斛發(fā)酵酒紅色素的檢測分析

未發(fā)酵時的鐵皮石斛汁液由于富含花色苷呈淺紫色[24]，而經(jīng)過發(fā)酵后的鐵皮石斛發(fā)酵酒呈粉紅色，為了判別鐵皮石斛發(fā)酵酒中花色苷成分是否被破壞，采用LC-MS分析系統(tǒng)及ESI-MS系統(tǒng)對鐵皮石斛發(fā)酵酒中的紅色素進行了分析，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 鐵皮石斛酒紅色素的液相色譜圖Fig.1 Liquid chromatography of Dendrobium candidum wine red pigment

圖2 鐵皮石斛酒紅色素鑒定出的花色苷Fig.2 Anthocyanins identified from Dendrobium candidum wine red pigment

由圖1可知，鐵皮石斛發(fā)酵酒紅色素液相色譜圖有三個較明顯的峰，分別在23 min、25 min和28 min處有吸收峰。由圖2可知，經(jīng)過質(zhì)譜分析實驗、離子碎片分析以及比對參考文獻，從鐵皮石斛發(fā)酵酒中只鑒定出了飛燕草素-3-O-p-香豆酰葡萄糖苷，該物質(zhì)為紅色素的主要成分。

2.3 發(fā)酵前后有機酸組成及含量分析

發(fā)酵前后的有機酸組成級含量分析結(jié)果見圖3。由圖3可知，發(fā)酵前鐵皮石斛中有機酸主要為蘋果酸和檸檬酸。經(jīng)產(chǎn)乳酸芽孢桿菌和釀酒酵母菌混合發(fā)酵后，酒石酸含量增加至280.39 mg/L；乳酸含量增加至126.28 mg/L；蘋果酸含量由53.01 mg/L下降至33.86 mg/L；乙酸含量由0.3 mg/L增加至55.19 mg/L；檸檬酸含量由3.1 mg/L增加至16.78 mg/L。在發(fā)酵過程中產(chǎn)乳酸芽孢桿菌產(chǎn)生口感柔和的乳酸，中和了蘋果酸引起的澀味，改善了石斛酒的口感。短鏈脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFA）能夠參與腸道免疫穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，乙酸作為常見的SCFA之一，是膽固醇的主要來源，可被腦、心臟和肌肉等多種組織器官利用[25]，而檸檬酸能夠保護細胞和組織損傷[26]。因此，發(fā)酵后酒體中乳酸、乙酸、檸檬酸含量明顯增加，提高了鐵皮石斛酒的營養(yǎng)價值，具有更佳的保健效果。

2.4 發(fā)酵前后酒體中組分的差異性分析

發(fā)酵前后發(fā)酵系統(tǒng)中化合物的主成分分析（principal component analysis，PCA）結(jié)果見圖4，火山圖見圖5。

圖4 發(fā)酵前后石斛酒成分的主成分分析結(jié)果Fig.4 Principal component analysis results of components of Dendrobium candidum wine before and after fermentation

圖5 發(fā)酵前后石斛酒成分分析火山圖Fig.5 Volcano plot of composition analysis of Dendrobium candidum wine before and after fermentation

由圖4、圖5可知，經(jīng)主成分分析，主成分1（PC1）值為81.42%，主成分2（PC2）值為5.4%，從離散程度看，發(fā)酵前后的樣品分別聚為一類，說明發(fā)酵前后組分差異顯著?；鹕綀D中紅色標記的化合物即為通過了T測驗（P＜0.05）及FC＞2.0篩選出來的對應組間差異物質(zhì)。經(jīng)軟件檢索鑒定發(fā)酵后顯著差異物質(zhì)，可以發(fā)現(xiàn)，混合菌發(fā)酵后共產(chǎn)生了6種化合物，其中5種含有羧基官能團，分別為2，5-二羥基-3-噻吩羧酸、（4-羥基丁氧基）乙酸、5-（羥基甲基）-1,3-二氧戊環(huán)-4-羧酸、（2S，3R）-3-（羥甲基）-2-環(huán)氧乙烷羧酸、（2S，3R）-2,3-二羥基-4-氧代丁酸，可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生的各種有機酸反應而取代，酯類物質(zhì)（丁酸羥基甲酯）則是混合菌發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物。發(fā)酵產(chǎn)生的有機酸化合物及酯類化合物，不僅改善了鐵皮石斛酒的口感，還賦予其獨特的香氣，使產(chǎn)品效果更佳。

3 結(jié)論

本實驗在最優(yōu)發(fā)酵條件下（產(chǎn)乳酸芽孢桿菌∶釀酒酵母=1∶10（V/V），2%菌種活化液，發(fā)酵溫度30 ℃，發(fā)酵時間7 d）混合發(fā)酵鐵皮石斛，發(fā)酵后鐵皮石斛酒的pH值由6.20降至3.75，總酸含量上升至0.98%，酒精度增加至5.2%vol，可溶性固形物含量由17%下降至8%。發(fā)酵后鐵皮石斛酒中活性成分含量增加，其中多糖含量增加至4.99 g/L，花色苷含量由11.06 mg/L增加至16.82 mg/L。有機酸含量也發(fā)生明顯變化，其中酒石酸含量升高至280.39 mg/L，乳酸含量升高至126.28 mg/L，蘋果酸含量由53.01 mg/L降低至33.86 mg/L，乙酸含量由0.30 mg/L升高至55.19 mg/L，檸檬酸含量由3.10 mg/L升高至16.78 mg/L。同時，發(fā)酵前后組分差異顯著，發(fā)酵后產(chǎn)生了6種化合物，分別為2,5-二羥基-3-噻吩羧酸、（4-羥基丁氧基）乙酸、5-（羥基甲基）-1,3-二氧戊環(huán)-4-羧酸、（2S，3R）-3-（羥甲基）-2-環(huán)氧乙烷羧酸、（2S，3R）-2,3-二羥基-4-氧代丁酸。因此混合菌發(fā)酵，不僅保留了鐵皮石斛中的營養(yǎng)成分，而且提高了原料中活性成分的溶出率，并且兼?zhèn)浣?jīng)產(chǎn)乳酸芽孢桿菌和釀酒酵母菌發(fā)酵代謝產(chǎn)生的生理功效，提高了鐵皮石斛酒的保健作用，為鐵皮石斛保健產(chǎn)品的新研發(fā)提供參考。