貯藏溫度對青方腐乳生物胺和理化性質(zhì)的影響

馬艷莉，席曉麗，李大偉，梁靜靜，李素萍，丁玉峰，王 頡，郭書賢

（1.南陽理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南南陽 473004；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000）

青方腐乳又名青腐乳，俗稱臭豆腐，是腐乳的一大類[1]。它是以大豆為主要原料，在后期發(fā)酵過程中，加低度鹽水湯料釀制而成的表里顏色呈青色或豆青色的腐乳，其具有刺激性的臭味，但臭里透香[2-3]，最有名的是北京王致和臭豆腐。由于青方腐乳發(fā)酵后使一部分蛋白質(zhì)的硫氫基和氨基游離出來產(chǎn)生了以硫化物氣味為主的臭味，所以青方的風(fēng)味很容易被感覺到[1，4]。與其他類型相比，青方腐乳蛋白質(zhì)分解較徹底，氨基酸含量豐富，特別是青方腐乳中含有較多的丙氨酸，有獨(dú)特的甜味和酯香味[1，3]。

青方腐乳作為一種富含蛋白質(zhì)的佐餐制品，經(jīng)長期發(fā)酵很容易產(chǎn)生生物胺。生物胺是一類含氮低分子質(zhì)量化合物的總稱[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，生物胺廣泛存在于各種食品中，尤其是富含蛋白質(zhì)及氨基酸的強(qiáng)化食品和發(fā)酵食品，常見的主要有色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、組胺、酪胺、亞精胺、精胺等[6]。微量生物胺是生物體內(nèi)的正常生理成分，在機(jī)體中發(fā)揮著重要的作用。高濃度的生物胺不僅會(huì)影響食品風(fēng)味甚至改變其成分[7]，人體一旦攝入過量的生物胺，尤其是多種生物胺同時(shí)攝入，會(huì)引起中毒、心悸、惡心、呼吸紊亂、高血壓等癥狀，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)危及生命[8-9]。有關(guān)生物胺的報(bào)道表明，組胺對人體健康影響最大，8～40 mg就會(huì)輕微中毒，超過100 mg就會(huì)產(chǎn)生嚴(yán)重中毒反應(yīng)，甚至?xí)霈F(xiàn)休克。酪胺的毒性僅次于組胺，超過100 mg會(huì)出現(xiàn)偏頭痛等癥狀[10-11]。目前，有關(guān)腐乳中生物胺的報(bào)道大部分集中在工藝條件對其含量的影響、產(chǎn)生物胺菌株的鑒定以及檢測方法以及腐乳的功能性作用方面。而關(guān)于腐乳開蓋后貯藏過程中生物胺的研究報(bào)道較少。QIUS等[12-13]研究了在腐乳成熟期添加乙醇對生物胺含量的影響，發(fā)現(xiàn)添加乙醇對實(shí)驗(yàn)室制得的腐乳生物胺總量有降低作用。TSAI Y H等[14]對臺(tái)灣地區(qū)22個(gè)腐乳樣品中組胺含量以及合成組胺的微生物進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)枯草桿菌菌種可以合成組胺，但合成能力較低。劉振峰等[15]采用高效液相色譜法檢測了中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中的10種生物胺，發(fā)現(xiàn)不同樣品的生物胺含量差異很大。食品中生物胺的測定分析方法主要有薄層色譜法[16]、氣相色譜法[17]、離子色譜法[18]、毛細(xì)血管電泳法[19]和高效液相色譜法[20]等，其中高效液相色譜法檢測靈敏度高，重現(xiàn)性好，是測定生物胺含量的有效方法。本實(shí)驗(yàn)青方腐乳生物胺的測定采用高效液相色譜法。

腐乳開蓋后易受微生物污染，可能存在生物胺超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。本試驗(yàn)選取了同一生產(chǎn)日期同一品牌的市售青方腐乳，研究開蓋后貯藏在不同溫度下其生物胺含量、水分活度（water activity，Aw）、pH、氨基酸態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化，探討生物胺與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性，以期為青方腐乳食用安全性提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

青方腐乳（同一生產(chǎn)日期同一品牌）：市售。

1.1.2 化學(xué)試劑

腐胺、色胺、組胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亞精胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞97%）：美國Sigma-Aldrich試劑有限公司；乙腈（色譜純）：上海Merck試劑有限公司；丹磺酰氯（純度≥98%）：上海麥克林試劑有限公司；純凈水：杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；丙酮、濃鹽酸（37%）、氨水、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、乙酸銨、甲醛（38%）、氯化鈉（均為分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

610L真空冷凍干燥機(jī)：新陽速凍設(shè)備制造有限公司；2695型高效液相色譜儀：美國Waters儀器有限公司；Eclipse XDB-C18液相色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國Agilent儀器有限公司；CP214電子分析天平：奧斯豪儀器上海有限公司；5424R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；XHF-DY攪拌分離器：上海奧克斯儀器有限公司；QL-861渦旋機(jī)：海門市其林貝爾儀器制造有限公司；STARTER2100酸度計(jì)：寧波新芝生物科技有限公司；Novasina CH-8533水分活度測定儀：瑞士步琦有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理方法

將購買的8瓶青方腐乳開蓋后分別在4 ℃、15 ℃、25 ℃、35 ℃條件下各放兩瓶，之后在0、15 d、30 d、45 d、60 d取樣測定生物胺含量、水分活度、pH和氨基酸態(tài)氮含量等指標(biāo)。

1.3.2 生物胺的測定

青方腐乳生物胺的測定采用高效液相色譜法，具體操作參照李大偉等[20]的方法。

1.3.3 理化指標(biāo)的測定

（1）水分活度的測定

水分活度（Aw）用水分活度測定儀進(jìn)行測定，具體操作如下：在溫度18～25 ℃，相對濕度50%～80%的條件下，用飽和鹽溶液校正水分活度儀，稱取約1 g（精確至0.01 g）試樣，迅速放入樣品皿中，封閉測量倉，每隔5 min記錄水分活度儀的響應(yīng)值。當(dāng)相鄰兩次響應(yīng)值之差＜0.005時(shí)，即為Aw測定值。待儀器充分平衡后，同一樣品重復(fù)測定3次。

（2）pH的測定

pH的測定參照劉振鋒[21]的方法并作部分修改，稱5.0 g樣品于50 mL離心管中，加20 mL去離子水利用均質(zhì)機(jī)分散均質(zhì)，然后4 ℃、3 600×g條件下離心25 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用去離子水定容后取出40 mL，用pH計(jì)直接測量，每個(gè)樣品重復(fù)檢測3次。

（3）氨基酸態(tài)氮含量的測定

氨基酸態(tài)氮（amino acid nitrogen，AAN）含量的測定參照行標(biāo)SB/T 10170—2007《腐乳》[22]中的方法進(jìn)行。

1.3.4 相關(guān)性分析

水分活度、pH、溫度等可以通過影響微生物繁殖以及酶系的活性進(jìn)而影響生物胺的合成。因此，理化指標(biāo)與生物胺之間存在一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)將所得的生物胺含量和理化指標(biāo)的數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，選擇雙變量，用Pearson相關(guān)系數(shù)以P值在0.05水平下具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義來確定。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 22.0分析，數(shù)據(jù)方差分析（analysis of variance，ANOVA）及其差異顯著性分析使用Duncan多重比較，繪圖使用Origin8.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度對青方腐乳生物胺的影響

溫度對生物胺的產(chǎn)生有重要的影響，孟勇等[23]研究不同貯藏溫度對中華絨螯蟹生物胺的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，溫度越高，生物胺產(chǎn)生速度越快。青方腐乳開蓋后在不同溫度下貯藏時(shí)，生物胺的含量測定結(jié)果見表1。由表1可知，貯藏溫度對不同生物胺的含量變化有不同影響。隨開蓋貯藏時(shí)間的延長，色胺、苯乙胺、腐胺和酪胺的變化規(guī)律類似，呈先升高后降低趨勢，尸胺呈先升高后降低再升高的趨勢。不同貯藏溫度下，剛開蓋的青方腐乳中未檢測到精胺和亞精胺。剛開蓋時(shí)，組胺含量均＜100 mg/kg，貯藏15 d時(shí)組胺含量均＞100 mg/kg，超過了美國食品藥品監(jiān)督管理局（food and drug administration，F(xiàn)DA）對水產(chǎn)中組胺的推薦限量值＜50 mg/kg[24]，有可能會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀。青方腐乳酪胺含量在不同溫度條件下貯藏至30 d（除25 ℃第30天）時(shí)，酪胺含量均＞100 mg/kg。貯藏前30 d，隨著貯藏時(shí)間的延長，25 ℃和35 ℃貯藏的青方腐乳，苯乙胺含量比4 ℃和15 ℃的要高，說明苯乙胺形成的適宜溫度在25～35 ℃。貯藏前中期（0～30 d）的組胺在25 ℃和35 ℃含量增長較快；貯藏后期（30～60 d）組胺含量降低。可能是由于微生物的污染導(dǎo)致pH的降低，抑制了酶的活性，也有可能是腐乳在貯藏后期水解的組氨酸含量降低。

表1 市售青方腐乳樣品開蓋后在不同溫度下貯藏生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amine contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

綜上所述，從食用安全角度考慮，腐乳開蓋后盡量在15 d之內(nèi)食用完。從本次試驗(yàn)結(jié)果來看，即使在4 ℃貯藏的條件下，在第15天也可能存在組胺中毒的現(xiàn)象。

2.2 不同貯藏溫度下理化指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化

2.2.1 不同溫度下貯藏水分活度的動(dòng)態(tài)變化

對不同溫度貯藏的青腐乳水分活度變化進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。由圖1可知，4 ℃貯藏的青方腐乳Aw呈先上升后下降在上升的趨勢，15 ℃貯藏的青方腐乳Aw一直處于緩慢上升的趨勢。在25 ℃和35℃貯藏的青方腐乳Aw的變化趨勢相一致，都是先下降后上升在下降的趨勢。在整個(gè)貯藏過程中，青腐乳4種不同貯藏溫度條件下Aw均＞0.84，微生物能夠生長繁殖，可能產(chǎn)生脫羧酶。

圖1 市售青方腐乳樣品開蓋后不同溫度下貯藏水分活度的變化Fig.1 Changes of water activity of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.2.2 不同溫度下貯藏pH的動(dòng)態(tài)變化

測定不同貯藏溫度下的青方腐乳pH，結(jié)果見圖2。由圖2可知，15 ℃、25 ℃、35 ℃貯藏的開蓋青方腐乳pH在整個(gè)貯藏期變化規(guī)律基本一致，且都在貯藏第15天pH達(dá)到最大值，說明不同貯藏溫度對青方腐乳pH變化規(guī)律影響不大，青方腐乳貯藏15 d時(shí)pH達(dá)最大值，可能是由于微生物分泌蛋白酶的作用，將蛋白質(zhì)降解為氨基酸，隨后進(jìn)一步脫氨基產(chǎn)生氨，導(dǎo)致pH 值明顯上升，貯藏15 d后pH 值有下降趨勢，可能是由于酸性氨基酸增加、有機(jī)酸產(chǎn)生等引起總酸含量升高。35 ℃貯藏的腐乳pH均高于25 ℃貯藏的腐乳，這與35 ℃貯藏的腐乳總胺含量高于25 ℃貯藏的腐乳相一致。腐乳貯藏過程中pH的動(dòng)態(tài)變化，也側(cè)面反應(yīng)出腐乳生物胺的動(dòng)態(tài)變化。受試青方腐乳的pH均在7.0～7.7之間，可能是青方腐乳中氨類含量較高，或是蛋白質(zhì)過度水解使生物胺等堿類物質(zhì)含量增加。

圖2 市售青方腐乳樣品開蓋后不同貯藏溫度下pH值的變化Fig.2 Changes of pH value of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.2.3 不同溫度下貯藏氨基酸態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化

不同溫度下貯藏，青方腐乳氨基酸態(tài)氮的動(dòng)態(tài)變化結(jié)果見圖3。

由圖3可知，4 ℃、15 ℃、25 ℃貯藏的青方腐乳開蓋開始時(shí)AAN含量差異不顯著，但在其整個(gè)貯藏過程中，AAN含量變化規(guī)律不同，4 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量在整個(gè)貯藏過程中一直處于上升狀態(tài)且在第60天達(dá)到最大值（0.54 g/100 g）；15 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量先升高后降低再升高，在第30天達(dá)到最大值（0.537 g/100 g）；25 ℃貯藏的青方腐乳AAN含量在整個(gè)貯藏過程中變化規(guī)律和15 ℃貯藏的腐乳變化規(guī)律相一致，但在第60天達(dá)到最大值。在貯藏的前15 d，貯藏溫度越高，氨基酸態(tài)氮增加越快。貯藏過程中AAN含量的變化一定程度上也可反映總胺含量的動(dòng)態(tài)變化。

圖3 市售青方腐乳樣品開蓋后不同溫度貯藏條件下氨基酸態(tài)氮含量的變化Fig.3 Changes of amino acid nitrogen contents of commercial grey sufu samples stored at different temperature after opening the lid

2.3 生物胺與理化指標(biāo)的相關(guān)性分析

生物胺與理化指標(biāo)之間的相關(guān)性用SPSS 22.0進(jìn)行分析，結(jié)果見表2。

由表2可知，pH值與苯乙胺、尸胺、組胺和亞精胺呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；水分活度與所測的8種生物胺無顯著的相關(guān)性（P＞0.05）；腐胺與色胺、苯乙胺、尸胺、組胺、酪胺和精胺呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01）；色胺與苯乙胺、尸胺呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。發(fā)酵食品中產(chǎn)生的瓜氨酸能在不同酶的作用下合成腐胺的前體物質(zhì)精氨酸和鳥氨酸，而腐胺是精胺和亞精胺的前體物質(zhì)；有文獻(xiàn)報(bào)道，胍基丁胺的存在也能誘導(dǎo)微生物合成腐胺，而組胺和酪胺能影響胍基丁胺的合成，從而影響到腐胺的合成[25]，所以可能是不同的生物胺之間存在轉(zhuǎn)化。

3 結(jié)論

通過研究貯藏溫度對市售青方腐乳開蓋后生物胺的影響，初步明確青方腐乳在四種溫度下貯藏至第15天時(shí)，苯乙胺和組胺含量分別超過30 mg/kg和100 mg/kg（即FDA的推薦的限量值），可能會(huì)產(chǎn)生一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。各種生物胺與理化指標(biāo)存在一定的相關(guān)性，說明Aw、pH和氨基酸態(tài)氮的變化也可從側(cè)面反映出總胺含量的動(dòng)態(tài)變化。目前，我國對食品中生物胺的限量標(biāo)準(zhǔn)大部分是關(guān)于魚類組胺的，腐乳中的生物胺含量還未有標(biāo)準(zhǔn)限定。就此試驗(yàn)結(jié)果來看，青方腐乳開蓋后即使在4 ℃貯藏，在第15天也可能存在組胺和苯乙胺中毒的風(fēng)險(xiǎn)為了食用安全，腐乳開蓋后應(yīng)盡量在15 d內(nèi)食用完。