原料預(yù)處理對柿子酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)及甲醇和高級醇的影響

呂佳瑋，劉亞瓊，路 瑤，牟建樓，商飛飛，王 頡，郭書賢，馬艷莉，*

（1.賀州學(xué)院廣西果蔬保鮮和深加工研究人才小高地，廣西賀州 542899；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定 071000；3.南陽理工學(xué)院河南省工業(yè)微生物資源與發(fā)酵技術(shù)重點實驗室，河南南陽 473004）

柿子隸屬柿科（Ebenaceae）柿屬（DiospyrosL.），與葡萄、香蕉、柑橘、蘋果并稱我國五大水果[1]。柿子中含有豐富的維生素C（vitamin C，VC），是葡萄中VC含量的10倍左右，柿子中單寧可以清除體內(nèi)自由基，并抑制細(xì)胞的癌變。此外柿子中還含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、磷、鈣、鐵等豐富的營養(yǎng)物質(zhì)。我國柿子種植面積、柿子產(chǎn)量均居世界首位。目前，我國對柿子的利用率較低，柿子主要以脫澀脆柿子、柿餅為主，還有一些柿醋、柿酒、柿汁、柿葉茶等[2]。以柿子為原料釀造的酒，酒精度低、營養(yǎng)價值高，有很好的保健功能，據(jù)測定，柿子果酒中氨基酸的含量約為36%[3]。

果酒中的甲醇主要來自于果膠水解、甘氨酸脫氨脫羧、甘氨酸脫羧亞硝酸化等，當(dāng)人體攝入甲醇后，經(jīng)代謝會產(chǎn)生甲醛和甲酸，甲酸在體內(nèi)有累積作用，積累在眼睛處會破壞視覺神經(jīng)細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞，產(chǎn)生永久性損害，最后致使失明，減少甲醇的方法主要有降低果膠的含量、提高酒精度。高級醇主要來自于降解代謝途徑[4]，柿子因富含果膠，在釀造過程中易產(chǎn)生對人體健康危害極大的甲醇。柿子酒中的高級醇主要包括異丁醇、異戊醇和正己醇，一定量的高級醇使柿子酒口感更醇厚、豐滿，協(xié)調(diào)性更強(qiáng)，高級醇的含量過高或過低都會影響酒的風(fēng)味。飲用過量的高級醇后對人體健康有害[5]。

本研究以柿子為主要原料，研究去皮、蒸煮和添加果膠酶3種預(yù)處理對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖、總酸、酒精度、甲醇以及高級醇的影響，旨在優(yōu)化柿子酒的釀造工藝，為其深加工提供理論參考和實踐指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

磨盤柿：2018年采摘于河北省保定市，采后放于4 ℃冷庫儲藏備用。

活性干酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶與纖維素酶復(fù)配酶制劑（果膠酶（2.25×104U/g），纖維素酶（9×104U/g））：法國SAS SOFRALAB OENOFRANCE公司。

氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、濃鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、苯酚、亞硫酸鈉、氯化鈉（均為分析純）：天津天利化學(xué)試劑有限公司；甲醇、乙醇、異戊醇、異丁醇、正己醇（均為色譜純）：美國藍(lán)白Labscience公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-4電熱水浴鍋：上海比朗儀器有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；ID5002C電子天平：天津天馬橫基儀器有限公司；SPX型生化培養(yǎng)箱：上海東器實業(yè)有限公司；7890B氣相色譜：美國Agilent有限公司；DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：廣東精華智能裝備有限公司；DZTW電陶爐：上?？坪銓崢I(yè)發(fā)展有限公司；PAL-α糖度計：日本愛拓公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 柿子酒釀造工藝流程

柿子→挑選→去柄→打漿→不同處理→加入酵母→發(fā)酵檢測→澄清→過濾→成品[6]

1.3.2 酵母活化

將活性干酵母按照1∶10（g∶mL）的比例和2%葡萄糖水混合于小燒杯中，小心靜置在36～38 ℃的恒溫水浴鍋中，每隔10 min輕輕搖晃一次，有豐富濃密的小氣泡產(chǎn)生，即代表活化成功，時間在20～30 min為宜。

1.3.3 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、甲醇和高級醇的影響

稱取4 000 g柿子，進(jìn)行挑選、去柄，將挑選好的柿子分為兩組，一組進(jìn)行去皮處理，另一組不做去皮處理。將兩組進(jìn)行打漿，加入0.1%的果膠酶與纖維素酶復(fù)配劑在45 ℃水浴中處理3 h。將釀酒酵母進(jìn)行活化，酵母活化同1.3.2，將活化好的酵母加入到處理好的柿子漿中，攪拌均勻，將兩組柿子漿分裝到5個發(fā)酵瓶中，每3個作為平行實驗，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，每隔1 d進(jìn)行取樣，將樣品貯藏在-4 ℃冰箱中備用。

1.3.4 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)、甲醇和高級醇的影響

稱取4 000 g柿子，進(jìn)行挑選、去柄、打漿，將柿子漿分為兩組，一組將柿子漿煮15 min，另一組不做蒸煮處理。待柿子漿冷卻，均加入0.1%的果膠酶與纖維素酶復(fù)配劑，在45 ℃水浴中處理3 h。將釀酒酵母進(jìn)行活化，酵母活化同1.3.2，將活化好的酵母加入處理好的柿子漿中，攪拌均勻，將兩組柿子漿分裝到5個發(fā)酵瓶中，每3個作為平行實驗，在24 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 d，每隔1 d進(jìn)行取樣，將樣品貯藏在-4 ℃冰箱中備用。

1.3.5 測定方法

總酸：參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》進(jìn)行測定。

酒精度：參照GB 5009.225—2016《酒中乙醇濃度的測定》進(jìn)行測定。

還原糖：參照參考文獻(xiàn)[7-8]的方法進(jìn)行測定。

甲醇、高級醇：參照參考文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行測定。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法實驗結(jié)果統(tǒng)計分析方法使用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，差異顯著性水平為0.05，使用Origin9.0作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料預(yù)處理方式對柿子酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的影響

2.1.1 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖、總酸、酒精度的影響

去皮對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖含量、總酸含量、酒精度的影響如圖1所示。

由圖1a可知，去皮處理與帶皮處理柿子酒在發(fā)酵前的還原糖含量分別為14.86 g/L、16.22 g/L，發(fā)酵過程中兩組柿子酒中還原糖含量隨發(fā)酵時間延長而下降，當(dāng)發(fā)酵到第2天時，帶皮處理的柿子酒中還原糖含量明顯低于去皮發(fā)酵，可能是因為可能是由于柿子皮上帶有的微生物進(jìn)行了生長代謝，與帶皮發(fā)酵相比，去皮發(fā)酵過程中還原糖下降更為緩慢，發(fā)酵過程更易于控制。第8天發(fā)酵結(jié)束，去皮處理的柿子酒中還原糖含量（2.09 g/L）較帶皮處理的柿子酒中還原糖含量（1.17 g/L）高44%，可能是因為帶皮處理組發(fā)酵體系黏度較高，影響微生物對還原糖的利用[10]。

由圖1b可知，去皮處理與帶皮處理柿子酒在發(fā)酵前的總酸含量分別為0.79 g/kg、1.20 g/kg，發(fā)酵過程中兩組柿子酒中總酸含量隨發(fā)酵時間延長而升高，發(fā)酵結(jié)束后，去皮處理柿子酒中總酸含量（3.94 g/kg）、較帶皮處理柿子酒中總酸含量（4.28 g/kg）低7.9%，可能是因為柿子皮中含有酸類物質(zhì)[11]。

由圖1c可知，去皮處理與帶皮處理柿子酒在發(fā)酵前的酒精度含量分別為2.35%vol、2.05%vol，兩組柿子酒的酒精度隨發(fā)酵時間的延長而不斷升高，發(fā)酵到第6天到達(dá)穩(wěn)定，發(fā)酵終點兩組柿子酒的酒精度分別為9.12%vol、9.03%vol，去皮處理組比帶皮處理組略高，可能是由于柿子皮中帶有微生物，與酵母菌形成競爭關(guān)系，去皮處理發(fā)酵液更加類似于清汁發(fā)酵，使微生物能更加充分的利用柿子中的營養(yǎng)物質(zhì)[12]。

圖1 去皮、帶皮處理對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖含量（a）、總酸含量（b）、酒精度（c）的影響Fig.1 Effects of peeling and non-peeling treatment on reducing sugar content (a),total acid content (b),and alcohol content (c) in the fermentation process of persimmon wine

2.1.2 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中理化指標(biāo)的影響

蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖含量、總酸含量、酒精度的影響如圖2所示。

由圖2a可知，蒸煮處理與不蒸煮處理柿子酒在發(fā)酵前的還原糖含量分別為11.90 g/L、12.47 g/L，兩組柿子酒的還原糖含量在發(fā)酵前期隨著發(fā)酵的進(jìn)行急劇下降，而在第4天趨于穩(wěn)定，發(fā)酵終點還原糖含量均小于4 g/L。還原糖含量隨著發(fā)酵時間的增加而減少主要是因為發(fā)酵前期酵母菌生長活躍，消耗了大量的還原糖，而到發(fā)酵后期酒精度不斷升高，大量的酵母菌死亡，不再消耗還原糖，還原糖含量趨于穩(wěn)定。發(fā)酵結(jié)束后蒸煮處理的柿子酒還原糖含量（3.26 g/L）較不蒸煮處理的柿子酒還原糖含量（2.09 g/L）高36%，可能是因為蒸煮過程中組織結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重破壞，有大量糖分流出[13]，或者蒸煮溫度較高，使柿子中自身帶的微生物死亡，減少了對還原糖的利用[14]。

由圖2b可知，蒸煮處理與不蒸煮處理柿子酒在發(fā)酵前的總酸含量分別為1.12 g/kg、0.93 g/kg，兩組柿子酒中總酸的含量隨時間的延長總體呈先上升后下降的趨勢，柿子酒中的酸主要來源有柿子中本身帶有的酸和酵母代謝產(chǎn)生的有機(jī)酸，而總酸含量下降的是因為酸與其他物質(zhì)發(fā)生了反應(yīng)，如酸與醇反應(yīng)生成酯[15]。在發(fā)酵前兩天蒸煮處理的總酸含量比不蒸煮處理的總酸含量高，可能是因為經(jīng)過蒸煮處理后，酸類物質(zhì)流出來，而隨著發(fā)酵過程的進(jìn)行不蒸煮處理經(jīng)過微生物生長代謝，總酸含量不斷升高，發(fā)酵結(jié)束后蒸煮處理的柿子酒總酸含量（4.46 g/kg）較不蒸煮處理的柿子酒中總酸含量（4.93 g/kg）低9.5%。

由2c可知，蒸煮處理與不蒸煮處理柿子酒在發(fā)酵前的酒精度含量分別為1.5%vol、1.6%vol，兩個處理釀造的柿子酒的酒精度隨發(fā)酵時間的延長而不斷升高，發(fā)酵到第6天到達(dá)穩(wěn)定，發(fā)酵終點兩個處理的酒精度分別為9.35%vol、9.15%vol，蒸煮處理略低于不蒸煮處理組，因為蒸煮后發(fā)酵體系中醋酸菌、乳酸菌被殺死[16-17]。

圖2 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中還原糖含量（a）、總酸含量（b）、酒精度（c）的影響Fig.2 Effect of cooking on reducing sugar content (a),total acid content (b),and alcohol content (c) in the fermentation process of persimmon wine

2.2 原料預(yù)處理對柿子酒發(fā)酵過程中甲醇的影響

2.2.1 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中甲醇的影響

由圖3可知，兩組柿子酒中甲醇含量隨發(fā)酵時間的延長而減少，發(fā)酵結(jié)束時，去皮處理的柿子酒中甲醇含量（62.88 g/mL）較帶皮處理的柿子酒中甲醇含量（77.68 g/mL）低19%?？赡苁且驗槭磷悠ぶ泄z含量較高，去皮處理后大大減少了果膠含量，從而減少了甲醇的含量[18]。

圖3 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中甲醇含量的影響Fig.3 Effect of peeling on methanol contents in the fermentation process of persimmon wine

2.2.2 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中甲醇的影響

由圖4可知，發(fā)酵過程中甲醇的含量隨發(fā)酵的進(jìn)行而降低，發(fā)酵初期蒸煮處理的柿子酒中甲醇含量明顯比不蒸煮處理組低，前者為255.56 mg/L，后者為888.22 mg/L，果膠分解是形成甲醇的主要途徑之一，蒸煮處理可以使果膠分解，有效減少了果膠的含量，并且蒸煮處理使柿子本身帶有的果膠甲酯酶失活[19-20]，抑制了果膠的分解，發(fā)酵結(jié)束后蒸煮處理柿子酒中甲醇的含量（41.18 mg/L）較不蒸煮處理柿子酒中甲醇含量（59.35 mg/L）低30%。

圖4 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中甲醇含量的影響Fig.4 Effect of cooking on methanol contents in the fermentation process of persimmon wine

2.3 原料預(yù)處理對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇的影響

2.3.1 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇的影響

如表1所示，兩個處理中的高級醇包括異戊醇、異丁醇和正己醇，含量隨發(fā)酵時間延長呈現(xiàn)先升高后穩(wěn)定的趨勢，在發(fā)酵第2天后達(dá)到穩(wěn)定，其中異戊醇含量相對較高，發(fā)酵結(jié)束后，原料去皮處理柿子酒中高級醇含量（5.19 g/L）較帶皮處理柿子酒中高級醇含量（3.12 g/L）高66%，可能是因為帶皮處理中帶有的微生物與釀酒微生物形成了競爭關(guān)系，減少的微生物的代謝，從而降低高級醇的含量[21]。

表1 去皮對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇含量的影響Table 1 Effect of peeling on higher alcohol contents in the fermentation process of persimmon wine

2.3.2 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇的影響

蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇的影響如表2所示，原料蒸煮處理可以大大降低高級醇的含量，并且在蒸煮處理的柿子酒中為檢測到正己醇，這可能是蒸煮處理抑制了降解代謝途徑[22]，發(fā)酵結(jié)束后蒸煮處理柿子酒中高級醇含量（2.55 g/L）較不蒸煮處理柿子酒中高級醇含量（3.78 g/L）低48%。

表2 蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中高級醇含量的影響Table 2 Effect of cooking on higher alcohol contents in the fermentation process of persimmon wine

3 結(jié)論

本實驗研究去皮、蒸煮對柿子酒發(fā)酵過程中主要理化指標(biāo)、甲醇和高級醇含量的變化，以篩選出較好的釀造柿子酒的處理方式，對柿子酒工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的應(yīng)用價值和指導(dǎo)意義。原料預(yù)處理對柿子酒的酒精度沒有顯著影響；和帶皮處理相比，原料去皮處理釀造的柿子酒中還原糖含量高44%，總酸含量低7.9%，甲醇低19%，高級醇高66%；與不蒸煮處理相比，蒸煮處理釀造的柿子酒中還原糖含量高36%，總酸含量低9.5%，甲醇含量低30%，高級醇含量低48%。所以，確定去皮、蒸煮處理為柿子酒較優(yōu)的原料處理方法。