半連續(xù)液態(tài)深層發(fā)酵紅棗醋及其抗氧化活性

劉杰超，葛曉丹，呂真真，劉 慧，張春嶺，焦中高

（中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所，河南鄭州 450009）

果醋以水果或果汁為原料釀制而成，兼具水果和醋的營養(yǎng)與功能特性[1-2]，因此深受消費者青睞，成為功能性果蔬飲料和果品深加工的研究熱點。多種常見的水果，如蘋果、梨、桃、葡萄、柿、石榴、草莓、橙、檸檬等[3-7]都被開發(fā)成果醋或果醋飲料，賦予其獨特的營養(yǎng)價值和保健功能[8]。

紅棗是我國傳統(tǒng)的養(yǎng)生佳品，富含糖、有機酸、維生素、氨基酸、礦質(zhì)元素[9-10]以及多酚、多糖、環(huán)核苷酸、三萜類化合物等營養(yǎng)物質(zhì)和功能性成分[11]，具有補氣補血、防癌抗癌、保肝護肝、調(diào)節(jié)免疫等多種生理功效[12]，是人類健康飲食和研制開發(fā)功能性食品的重要原料。近年來隨著紅棗產(chǎn)量的快速提高和果醋飲料的興起，利用不同品種的鮮棗或殘次紅棗釀制棗醋成為研究的熱點，棗醋的釀造工藝得到了較多研究。楊小波等[13]采用滬釀1.01醋酸菌，通過正交試驗確定靈武長棗醋醋酸發(fā)酵的最佳工藝參數(shù)；王世忠等[14]采用木醋桿菌發(fā)酵冬棗酒，得到酸度為5.2 g/100 mL、棗香濃厚的冬棗醋；諶井岡[15]采用液態(tài)表面靜態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)紅棗醋，發(fā)酵時間較固態(tài)發(fā)酵大為縮短，而風味物質(zhì)含量較液態(tài)深層發(fā)酵增加。但這些研究多集中于間歇式發(fā)酵方式，周期較長。半連續(xù)液態(tài)深層發(fā)酵是在發(fā)酵后期通過周期性的排放發(fā)酵液同時補入新鮮料液的發(fā)酵方式，有利于維持醋酸菌的發(fā)酵能力，避免菌種老化，減少代謝阻遏，也不需要嚴格的無菌條件，因此在生產(chǎn)食醋或果醋方面得到廣泛應用[16]。向進樂等[17]以殘次鮮棗為原料，采用半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵法釀制棗醋，證實該方法可用于快速釀造紅棗醋，但未對不同工藝條件的影響進行進一步研究。已有研究表明，果醋發(fā)酵受原料、菌種、溶氧量以及發(fā)酵方式等的影響，尤其是溶氧量，對于醋酸菌的生長和醋酸發(fā)酵具有決定性作用[18]。

本研究以新疆灰棗釀制的紅棗酒為原料，采用半連續(xù)液態(tài)深層發(fā)酵，探討不同接種量和溶氧條件對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響，并對不同發(fā)酵批次紅棗醋的多酚含量和抗氧化活性進行比較分析，以期為紅棗醋的連續(xù)快速發(fā)酵提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅棗酒：以新疆灰棗為原料，加3倍水煮制、打漿，接入釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）發(fā)酵后經(jīng)過濾、澄清得到，酒精度為14%vol，總糖含量2.93 g/100 mL，pH為3.74。

醋酸菌菌種：巴氏醋酸桿菌（Acetobacter pasteurianus）滬釀1.01，上海佳民釀造食品有限公司。

醋酸菌培養(yǎng)基：葡萄糖1.00 g，酵母膏1.00 g，無水乙醇3.5 mL，碳酸鈣2.00 g，瓊脂1.5 g，蒸餾水100 mL，調(diào)pH值至6.8。

醋酸菌活化培養(yǎng)基：葡萄糖1%，酵母膏1%，調(diào)pH值至4.5，121 ℃滅菌20 min，使用前添加3%乙醇。

2,2-二苯基-1-三硝基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH）、Folin-酚試劑、2,2'-聯(lián)氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽[2,2-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid）diammonium salt，ABTS]、沒食子酸、蘆丁、乙酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸（均為分析純）：美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Biotech-10BG發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司；ZHWY-2112B恒溫培養(yǎng)振蕩器：上海智城分析儀器制造有限公司；1525高效液相色譜（high performance liquid chro matography，HPLC）儀：美國Waters公司；SPECORD 50型紫外/可見分光光度計：德國耶拿分析儀器股份公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與種子液培養(yǎng)

醋酸菌斜面保藏菌種經(jīng)轉(zhuǎn)接活化后接入液體活化培養(yǎng)基，在30 ℃條件下振蕩培養(yǎng)48 h，然后以10%的接種量接入4%vol棗酒，馴化培養(yǎng)48 h，至產(chǎn)酸量為（1.3～1.5）g/100 mL，作為種子液。

1.3.2 單批次發(fā)酵試驗

（1）接種量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響

10 L發(fā)酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調(diào)整酒精度為6%vol），分別按照10%、20%接種量接入培養(yǎng)好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧10%，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，在28 ℃條件下發(fā)酵，每間隔一定時間取樣測定總酸含量，考察不同接種量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響。

（2）溶氧量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響

10 L發(fā)酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調(diào)整酒精度為6%vol），按照20%接種量接入培養(yǎng)好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧量分別為5%、10%和15%，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，在28 ℃條件下發(fā)酵，每間隔一定時間取樣測定總酸含量，考察不同溶氧量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響。

1.3.3 棗醋發(fā)酵過程中有機酸組成變化

10 L發(fā)酵罐中裝入4 L棗酒（加入蒸餾水調(diào)整酒精度為6%vol），按照20%接種量接入培養(yǎng)好的醋酸菌種子液，控制通氣量保持溶氧10%，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，在28 ℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵17 h后每間隔2 h取樣分析有機酸組成，考察紅棗酒醋酸發(fā)酵過程中有機酸的變化。

1.3.4 分割留種半連續(xù)發(fā)酵試驗

使用10 L發(fā)酵罐，初始棗酒酒度4%vol，裝液系數(shù)60%，攪拌轉(zhuǎn)速500 r/min，控制通氣量保持溶氧10%，溫度28 ℃條件下發(fā)酵。當通氣量不變條件下溶氧開始上升時出醋，并補充棗酒進行下一批次發(fā)酵。發(fā)酵過程中每間隔一定時間取樣測定總酸含量，分別考察40%和50%留種量對發(fā)酵進程的影響以及醋酸發(fā)酵的穩(wěn)定性。

1.3.5 分析方法

總酸含量測定參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》，以乙酸計?？偡硬捎肍olin-酚法[19]測定，以沒食子酸為標準品制作標準曲線計算含量?？傸S酮采用硝酸鋁比色法[20]測定，以蘆丁為標準品制作標準曲線計算含量。

有機酸組成分析采用高效液相色譜法[21]，以乙酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、莽草酸、乳酸、檸檬酸、富馬酸為標準品采用外標法測定發(fā)酵液中有機酸的組成與含量。

1.3.6 抗氧化活性測定

分別采用DPPH自由基清除法[22]、鐵離子還原能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法[23]和ABTS自由基清除法[24]進行抗氧化活性測定，以抗壞血酸（vitamin C，VC）為標準品制作標準曲線計算抗氧化活性，結(jié)果以VC當量表示。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單批次發(fā)酵試驗

2.1.1 接種量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響

接種量為10%和20%時的醋酸發(fā)酵曲線見圖1。前20 h以內(nèi)發(fā)酵緩慢，21 h之后產(chǎn)酸量及產(chǎn)酸速率均快速增加，至27～31 h時產(chǎn)酸速率達到高峰，其后急劇下降，從而導致總酸含量在33～35 h時基本趨于穩(wěn)定。當接種量為20%時，發(fā)酵遲滯期明顯縮短，15 h之后就開始快速產(chǎn)酸，27 h后產(chǎn)酸速率大幅下降，總酸含量基本趨于穩(wěn)定，說明已接近發(fā)酵終點。但從最終產(chǎn)酸量來看，二者之間無顯著差異。

圖1 接種量對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響Fig.1 Effect of inoculum on acetic acid fermentation of jujube wine

2.1.2 溶氧對紅棗酒醋酸發(fā)酵的影響

醋酸發(fā)酵是一個需氧過程，溶氧條件對醋酸菌生長和酒精醋化都具有重要影響[23]。不同溶氧條件下的醋酸發(fā)酵曲線見圖2。

由圖2可知，隨著溶氧量的增加，發(fā)酵進程加快，15%溶氧量最早到達發(fā)酵終點，但由于通氣量加大造成乙醇和乙酸損失，導致最終產(chǎn)酸量較低。5%溶氧量與10%溶氧量到達發(fā)酵終點的時間相近，但最終產(chǎn)酸量略低于10%溶氧量。這可能是因為供氧量過低限制了醋酸菌的生長和發(fā)酵。

不同溶氧條件對產(chǎn)酸速率的影響見圖3。由圖3可知，從產(chǎn)酸速率來看，19h以前不同溶氧量之間差異顯著（P＜0.05），溶氧量越高，產(chǎn)酸速率越大。但15%溶氧量在19 h之后即進入穩(wěn)定產(chǎn)酸期，一直到25 h后產(chǎn)酸速率大幅降低，接近發(fā)酵終點。而5%和10%溶氧量在21 h之后產(chǎn)酸速率變化趨于一致，23 h之后進入穩(wěn)定產(chǎn)酸期，27 h后產(chǎn)酸速率大幅下降，接近發(fā)酵終點。由于前期5%溶氧量產(chǎn)酸速率較低，因此整個發(fā)酵過程其平均產(chǎn)酸速率也低于10%溶氧量。綜合考慮產(chǎn)酸量和產(chǎn)酸速率，溶氧量以10%為宜。

圖3 不同溶氧量對產(chǎn)酸速率的影響Fig.3 Effect of dissolved oxygen amount on acid production rate

2.2 棗醋發(fā)酵過程中有機酸組成變化

有機酸是果醋中最重要的風味成分和營養(yǎng)物質(zhì)，其中醋酸是發(fā)酵過程中生成的最主要的有機酸，也是果醋的特征性成分。為了解紅棗醋發(fā)酵過程中醋酸的形成規(guī)律以及其他有機酸的代謝情況，對棗醋發(fā)酵過程中有機酸的組成進行了分析，結(jié)果見表1。

表1 紅棗酒醋酸發(fā)酵過程中有機酸組成的變化Table 1 Changes of organic acid profile during acetic acid fermentation of jujube wine mg/100 mL

由表1可知，棗醋發(fā)酵液中主要含有乙酸、乳酸、檸檬酸、蘋果酸、奎寧酸、酒石酸和少量莽草酸、富馬酸。乙酸是棗醋及其發(fā)酵液中最主要的有機酸，而且在發(fā)酵過程中一直呈快速增加趨勢，發(fā)酵結(jié)束時乙酸含量達到4 812.35 mg/100 mL，是初始發(fā)酵時的23.97倍，占總有機酸的比例也從38.21%提高至94.58%，說明乙酸是發(fā)酵過程中的主要產(chǎn)物。除乙酸外，奎寧酸含量在快速產(chǎn)酸初期也增加一倍以上，但隨后又逐漸降低，至發(fā)酵末期又恢復到醋酸發(fā)酵前的水平。而蘋果酸含量則是在發(fā)酵前期大幅提升，進入快速產(chǎn)酸期后又快速降低到醋酸發(fā)酵前的水平。乳酸含量在醋酸發(fā)酵初期顯著下降（P＜0.05），其后基本維持穩(wěn)定，發(fā)酵結(jié)束時降低至43.55 mg/100 mL。酒石酸、檸檬酸、莽草酸、富馬酸含量在發(fā)酵過程中變化很小。向進樂等[25]在桃醋液態(tài)發(fā)酵的研究中也發(fā)現(xiàn)，蘋果酸含量在醋酸發(fā)酵前期大幅升高，其后又逐漸降低，而乳酸含量則在整個醋酸發(fā)酵階段一直呈降低趨勢。這可能是因為在醋酸菌快速生長與發(fā)酵過程中需要大量的能量，蘋果酸、乳酸和奎寧酸作為營養(yǎng)物質(zhì)被代謝或轉(zhuǎn)化[26]。

圖4 紅棗醋半連續(xù)液態(tài)深層發(fā)酵曲線Fig.4 Curves of semi-continuous submerged fermentation of jujube vinegar

2.3 分割留種半連續(xù)發(fā)酵

考慮到醋酸菌在連續(xù)發(fā)酵過程中一直處于高酸環(huán)境中對醋酸菌生長不利，因此采用4%vol棗酒進行分割留種半連續(xù)發(fā)酵試驗，既能達到總酸含量≥3.5%的要求，又可保持醋酸菌的旺盛生長和發(fā)酵能力。留種50%和40%條件下的半連續(xù)發(fā)酵曲線見圖4。

由圖4A可知，在連續(xù)4個批次的發(fā)酵中，產(chǎn)酸規(guī)律基本一致，發(fā)酵周期在14.5～15.5 h，總酸含量在3.77～3.95 g/100 mL。說明分割留種可以實現(xiàn)穩(wěn)定連續(xù)快速發(fā)酵。降低留種量會導致發(fā)酵周期的延長。由圖4B可知，40%留種量條件下遲滯期大幅延長，從而導致發(fā)酵周期較50%留種量延長一倍左右，但對產(chǎn)酸水平影響不大，發(fā)酵棗醋總酸含量可達3.78～3.92 g/100 mL。因此，在分割留種半連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)中，必須綜合考慮生產(chǎn)效率，兼顧發(fā)酵周期和出醋量，以確定適宜的留種量。

2.4 紅棗醋的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性

為考察半連續(xù)發(fā)酵對紅棗醋中酚類物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響，對留種50%連續(xù)發(fā)酵的4個批次的醋的總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力、Fe3+還原能力、ABTS自由基清除能力進行測定，結(jié)果見表2。

表2 紅棗酒和不同批次紅棗醋的酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性Table 2 Total phenolics,flavonoids contents and antioxidant activity of jujube liquor and different batches of jujube vinegar

由表2可知，紅棗酒經(jīng)過醋酸菌發(fā)酵后，紅棗醋中的總酚和總黃酮含量均有不同程度的提高，尤其是總黃酮含量，4個發(fā)酵批次紅棗醋較紅棗酒平均提高了42.98%，而且各批次紅棗醋與紅棗酒之間均有顯著差異（P＜0.05）；總酚含量較紅棗酒平均提高16.59%，除第1批次外，其他各批次紅棗醋與紅棗酒之間均有顯著差異（P＜0.05）。用DPPH法、FRAP法和ABTS法測定的紅棗醋的抗氧化活性和原來的紅棗酒相比也分別增加了24.66%、27.87%和38.07%。這說明紅棗酒經(jīng)醋酸菌發(fā)酵可提高其酚類物質(zhì)含量和抗氧化活性。其原因可能是發(fā)酵過程中微生物的作用促進了酚類物質(zhì)的溶出或者生物轉(zhuǎn)化導致一些酚類物質(zhì)或抗氧化成分的生成。ZOU B等[27]在對柿醋發(fā)酵過程的研究中也發(fā)現(xiàn)，醋酸發(fā)酵可顯著提高其ABTS自由基清除能力（P＜0.05），但總酚含量沒有顯著差別。枳椇酒經(jīng)醋酸發(fā)酵后，總酚、總黃酮含量以及DPPH自由基清除能力均得到明顯提高[28]。這都與本研究結(jié)果相似，也說明醋酸菌發(fā)酵可作為提升果蔬加工產(chǎn)品功能特性的一個重要手段。

3 結(jié)論

采用半連續(xù)液態(tài)深層發(fā)酵法可快速釀制紅棗醋，溶氧量以控制在10%左右為宜，分割留種量50%時發(fā)酵周期為14.5～15.5 h，較分割留種量40%時縮短一半左右。紅棗酒醋酸發(fā)酵初期伴隨奎寧酸和蘋果酸含量的大幅增加，但在后續(xù)的快速產(chǎn)酸階段又逐漸降低至發(fā)酵前的水平，而乳酸含量在醋酸發(fā)酵初期即快速降低，而后保持平穩(wěn)。棗酒經(jīng)過醋酸菌發(fā)酵后，其中的總酚和總黃酮含量以及抗氧化活性均得到不同程度的提高，因此可以作為增強紅棗產(chǎn)品功能特性的加工手段。