堿性和支鏈氨基酸對啤酒高濃釀造酵母發(fā)酵性能的影響

廖劍橋，雷宏杰，黃 豪，姜 甜，徐懷德*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無錫 214000）

啤酒是一種歷史悠久的釀造酒，以麥芽、水為原料，添加酒花及其他輔料，經(jīng)啤酒酵母釀制而成。啤酒營養(yǎng)豐富，酒精含量低，故有“液體面包”之稱[1]。啤酒高濃釀造技術(shù)是采用高濃麥汁（麥汁濃度＞16°P）進(jìn)行發(fā)酵，再以富含CO2的脫氧水稀釋至規(guī)定酒精度[2]，具有提高設(shè)備利用率，提高啤酒產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本以及節(jié)約能源和勞動(dòng)力，提高啤酒生物及非生物穩(wěn)定性，提高輔料利用率，增加每單位可發(fā)酵物的乙醇產(chǎn)量等優(yōu)點(diǎn)[2-3]。但是，啤酒高濃釀造也面臨著一些問題，如發(fā)酵時(shí)間長導(dǎo)致酵母細(xì)胞壓力增大，泡沫穩(wěn)定性降低，風(fēng)味變差以及酒花利用率降低等[2]。除此之外，在啤酒高濃釀造過程中，酵母還面臨著更為嚴(yán)苛的環(huán)境條件，如發(fā)酵前期的高滲透壓和發(fā)酵后期的高乙醇毒性等。研究表明，乙醇對酵母細(xì)胞生長具有強(qiáng)烈的抑制作用[4]。乙醇可干擾酵母細(xì)胞膜脂組織，擾亂膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的構(gòu)象和功能，增加質(zhì)膜通透性[5-6]；高濃度的乙醇會干擾酵母細(xì)胞壁的正常功能，抑制細(xì)胞的生長及乙醇的進(jìn)一步生成[7-8]。游離氨基氮（free amino nitrogen，F(xiàn)AN），是能夠被酵母同化利用的含氮物質(zhì)，包括游離氨基酸、銨離子與小分子肽等[9]。FAN的缺乏是啤酒高濃釀造中導(dǎo)致酵母適應(yīng)環(huán)境脅迫能力變差的主要原因，氮源嚴(yán)重缺乏甚至?xí)?dǎo)致發(fā)酵停滯[10]。為了解決這些問題，前人已經(jīng)提出了多種方法，如補(bǔ)充氨基酸與肽[11]，添加大豆活性肽[12]、小麥面筋水解物[13]，或添加蛋白酶以增加麥汁中FAN水平[2]。在高濃麥汁中添加氮源被證明是一種有效的方法。

由于堿性氨基酸與支鏈氨基酸是酵母細(xì)胞生長所必需的氨基酸，細(xì)胞無法自身合成，只能靠從外界環(huán)境中攝取，而氮源缺乏是高濃麥汁的主要缺陷。因此，為了探究這六種氨基酸對啤酒高濃釀造過程中酵母生理特性和發(fā)酵性能的影響，本研究通過在高濃麥汁中分別添加六種氨基酸：精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile），研究其對酵母生長和活細(xì)胞率、麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量、啤酒風(fēng)味物質(zhì)形成的影響，為啤酒高濃釀造工業(yè)生產(chǎn)中氮源的選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種與原料

Lager啤酒酵母（Saccharomyces pastorianus）：安琪酵母股份有限公司；大麥芽：廈門市老啤匠貿(mào)易有限公司；酒花顆粒：西安雪花啤酒有限公司；麥芽糖漿：江蘇先卓食品科技股份有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

精氨酸（Arg）、賴氨酸（Lys）、組氨酸（His）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、異亮氨酸（Ile）：北京索萊寶科技有限公司；亞甲基藍(lán)：天津博迪化工股份有限公司；KH2PO4、Na2HPO4·12H2O：廣東光華科技股份有限公司；2-辛醇：范德（北京）生物科技有限公司。實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LRN-250CL低溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PAL-1數(shù)字手持袖珍折射儀：日本ATAGO（愛宕）公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GL-10MD大容量高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)儀器有限公司；E100LED MV生物顯微鏡：日本尼康公司；DMA 35安東帕便攜式密度計(jì)：奧地利安東帕有限公司；UV1780紫外-可見分光光度計(jì)：日本島津公司；QP2010 Ultra氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 高濃麥汁制備

在任璐等[14]的方法上調(diào)整原麥汁制備工藝參數(shù)。麥芽經(jīng)粉碎后，以1∶4（g∶mL）的料液比，加入45 ℃蒸餾水進(jìn)行攪拌、糖化，糖化條件：45 ℃，30 min；63 ℃，60 min；72 ℃，10 min；78 ℃，10 min，以1 ℃/min的速率升溫。糖化結(jié)束后，將原麥汁冷卻至約45 ℃過濾，將濾液煮沸并保持沸騰狀態(tài)90 min。在麥汁沸騰過程中添加所用麥芽質(zhì)量0.2%的酒花顆粒，采用三次添加法[15]進(jìn)行酒花顆粒添加：煮沸10 min時(shí)添加酒花總量的10%，35 min時(shí)添加55%，煮沸結(jié)束前10min加入剩余35%酒花。煮沸結(jié)束后趁熱過濾，加入蒸餾水將原麥汁濃度調(diào)整至12°P，再加入麥芽糖漿，調(diào)整至24°P，形成高濃麥汁。裝瓶，進(jìn)行高壓蒸汽滅菌（121 ℃，15 min）。

1.3.2 啤酒發(fā)酵

接種酵母前，在無菌條件下，向高濃麥汁中分別添加六種氨基酸：Arg、His、Lys、Val、Leu、Ile，添加量為400 mg/L。對照組中不添加任何氨基酸（對照組中三種堿性氨基酸Arg、Lys、His的含量分別為406 mg/L、134 mg/L、213 mg/L，三種支鏈氨基酸Val、Leu、Ile的含量分別為343mg/L、471mg/L、209 mg/L）?；钚愿山湍附?jīng)活化后，加入高濃麥汁中，接種量為2 g/L。于12 ℃條件下進(jìn)行發(fā)酵，每日搖瓶稱質(zhì)量。發(fā)酵結(jié)束后，離心（6 000 r/min，4 ℃，10 min），分別取酵母泥與上清液。上清液保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.3 酵母計(jì)數(shù)和活細(xì)胞率

將離心所得酵母泥稱質(zhì)量，再用血球計(jì)數(shù)板對酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)以及活細(xì)胞率的測定：將酵母泥用生理鹽水（0.9%NaCl溶液）以1∶100的比例進(jìn)行稀釋后，在0.1 mL的細(xì)胞懸浮液中加入0.9 mL磷酸亞甲基藍(lán)溶液（pH=4.6），振蕩混勻，靜置染色10 min后，在顯微鏡下通過血球計(jì)數(shù)板對活細(xì)胞和死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，其中，死亡的細(xì)胞會被亞甲基藍(lán)染成藍(lán)色?；罴?xì)胞率計(jì)算公式如下：

1.3.4 麥汁發(fā)酵度

使用附溫比重瓶法測定發(fā)酵前后麥汁濃度：將上清液緩慢倒入25 mL附溫比重瓶中，插入溫度計(jì)，避免產(chǎn)生氣泡，準(zhǔn)確稱量其在20 ℃條件下的質(zhì)量，同樣方法測出蒸餾水在20 ℃條件下的質(zhì)量。根據(jù)二者比值，查比重和浸出物質(zhì)量百分含量對照表得出麥汁在20 ℃條件下浸出物含量，以°P表示。麥汁發(fā)酵度計(jì)算公式如下：

1.3.5 酒精度測定

取上清液與蒸餾水各50 mL，一并加入蒸餾燒瓶中進(jìn)行蒸餾，用容量瓶準(zhǔn)確收集50 mL餾出液。再用安東帕便攜式密度計(jì)直接測定讀取酒精度，以體積分?jǐn)?shù)表示%vol。

1.3.6 風(fēng)味物質(zhì)測定

使用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀測定啤酒中的風(fēng)味物質(zhì)，采用與常婷婷[16]相同的條件進(jìn)行分析：在20 mL頂空瓶中加入6 mL樣品和1.5 g NaCl，以及20 mg/mL的2-辛醇標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，此時(shí)樣品中2-辛醇實(shí)際質(zhì)量濃度為66.7 μg/mL，加蓋密封后進(jìn)行測定分析。未知化合物經(jīng)計(jì)算機(jī)檢索同時(shí)與美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）和Wileylibrary數(shù)據(jù)庫相匹配，保留SI＞85的結(jié)果，所得風(fēng)味物質(zhì)為相對于內(nèi)標(biāo)的含量。

氣相色譜條件：色譜柱為DB-1 ms 毛細(xì)管柱（60 m×0.25 mm×0.25 μm）；起始柱溫：40 ℃；進(jìn)樣口溫度230 ℃；程序升溫：40 ℃保持3 min，然后以4 ℃/min 速度升到120 ℃，再以6 ℃/min 升到240 ℃，保持9 min；載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min；不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，電子電離（electronic ionization，EI）源，電子能量70eV，質(zhì)量掃描范圍35～400amu。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，采用Minitab 18（Minitab Inc.）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Fisher最小顯著差別（least significant difference，LSD）法進(jìn)行顯著性分析。其中，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。使用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加不同氨基酸對啤酒高濃釀造過程中CO2失質(zhì)量的影響

由圖1可知，發(fā)酵開始的第1天，各組CO2失質(zhì)量均較低，發(fā)酵非常緩慢，是細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境的過程。從第2天開始，CO2失質(zhì)量增加，曲線斜率增大。由于麥汁中營養(yǎng)物質(zhì)充足，酵母細(xì)胞得以快速繁殖，參與發(fā)酵的酵母數(shù)量急劇增加，無氧發(fā)酵活躍。各組CO2失質(zhì)量在第3天為最大，其中Val組高達(dá)17.2 g/L。隨后，總CO2失質(zhì)量趨于穩(wěn)定，酵母細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，在此期間，代謝產(chǎn)物逐漸積累增多，當(dāng)CO2失質(zhì)量趨于平穩(wěn)時(shí)，乙醇的產(chǎn)量也趨于穩(wěn)定，因此，在細(xì)胞進(jìn)入衰亡期前、總CO2失質(zhì)量趨于穩(wěn)定時(shí)，終止發(fā)酵。

圖1 發(fā)酵期間各組CO2質(zhì)量損失Fig.1 CO2 mass loss of each group during fermentation

發(fā)酵開始至第5天，各組間CO2失質(zhì)量差異顯著（P＜0.05），直至發(fā)酵結(jié)束，對照組CO2失質(zhì)量（87.7 g/L）低于所有添加氨基酸的實(shí)驗(yàn)組。Arg組發(fā)酵前5 d CO2失質(zhì)量一直高于其他組。從第6天開始至發(fā)酵結(jié)束，添加Val、Leu與Arg的實(shí)驗(yàn)組CO2失質(zhì)量始終高于其他組，分別為92.4 g/L、92.7 g/L與91.2 g/L。結(jié)果表明，高濃麥汁中添加堿性氨基酸及支鏈氨基酸可顯著提高Lager酵母的發(fā)酵速率及發(fā)酵活力（P＜0.05）。其中，Arg、Val以及Leu效果優(yōu)于其他3種氨基酸。

2.2 添加不同氨基酸對酵母細(xì)胞生長和活細(xì)胞率的影響

啤酒高濃釀造過程中添加大豆蛋白酶解物，可增強(qiáng)酵母的乙醇耐受性、滲透壓耐受性，改善細(xì)胞的代謝環(huán)境，提高酵母凈增長量[12]。由圖2可知，Arg的添加對酵母細(xì)胞的生長促進(jìn)效果最好，達(dá)1.64×108cells/mL，顯著高于對照組（1.33×108cells/mL）（P＜0.05）。CHENG Y等[17]的研究表明，Arg具有保護(hù)酵母細(xì)胞免受乙醇脅迫的作用，可以促進(jìn)細(xì)胞在乙醇脅迫下的生長。其他氨基酸的添加對酵母細(xì)胞的生長無顯著影響。

圖2 發(fā)酵結(jié)束時(shí)各組酵母總細(xì)胞數(shù)Fig.2 Total yeast cells number of each group at the end of fermentation

由圖3可知，His添加組的活細(xì)胞率顯著高于對照組（P＜0.05），達(dá)82.69%，而對照組僅為76.77%。明明[18]研究表明，在培養(yǎng)基中添加乙醇，對酵母菌的細(xì)胞生長有抑制作用，尤其在高濃度時(shí)的抑制作用更強(qiáng)。其余各氨基酸添加組的活細(xì)胞率與對照組無顯著差異（P＞0.05），但是，由于各組乙醇產(chǎn)量均顯著高于對照組乙醇產(chǎn)量（P＜0.05），因此，各組在發(fā)酵結(jié)束時(shí)面臨更嚴(yán)峻的環(huán)境脅迫。而添加各氨基酸的實(shí)驗(yàn)組能在乙醇產(chǎn)量較對照組更高的情況下，保持酵母總細(xì)胞數(shù)以及活細(xì)胞率與對照組相當(dāng)?shù)乃?，甚至更?yōu)（Arg、His添加組），表明在高濃釀造中添加這六種氨基酸可以顯著增強(qiáng)酵母細(xì)胞對乙醇的耐受性，保證酵母細(xì)胞的生長繁殖及存活率。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，更高的酵母總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞率，有利于酵母的重復(fù)利用。

圖3 發(fā)酵結(jié)束時(shí)各組酵母活細(xì)胞率Fig.3 Yeast cell viability of each group at the end of fermentation

2.3 添加不同氨基酸對麥汁發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量的影響

由圖4可知，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵度從高到低依次為：Val＞Leu＞Arg＞Ile＞Lys＞His＞對照組。高濃麥汁中由于加入了大量幾乎不含氮的麥芽糖漿，導(dǎo)致其中FAN水平降低。低水平的FAN會導(dǎo)致酵母增殖緩慢，使發(fā)酵滯緩甚至停滯[19-20]。對照組發(fā)酵度最低，為79.29%。麥汁中充足的FAN可以確保酵母細(xì)胞快速增殖，從而保證良好的發(fā)酵性能，在常濃釀造過程中，F(xiàn)AN水平與酵母生長成正比，在高濃釀造中，則需要更高水平的FAN以保證發(fā)酵能正常進(jìn)行。因此，各添加氨基酸的實(shí)驗(yàn)組，發(fā)酵度均極顯著高于未添加任何氮源物質(zhì)的對照組（P＜0.01），其中Val組發(fā)酵度最高，為83.65%，其次為添加Leu和Arg的實(shí)驗(yàn)組，分別為82.95%、82.93%。這與YANG H等[11]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 添加不同氨基酸對各組麥汁發(fā)酵度的影響Fig.4 Effect of different amino acids supplementations on wort fermentation degree of each group

高濃麥汁中可發(fā)酵糖含量高，因此在發(fā)酵后期會產(chǎn)生更多的乙醇。然而，酒精作為酵母細(xì)胞的代謝產(chǎn)物，反過來會抑制乙醇的生成，這種抑制效果較常濃釀造時(shí)的抑制效果更為強(qiáng)烈。TANO M等[21]實(shí)驗(yàn)表明，外源添加乙醇會導(dǎo)致甘蔗汁發(fā)酵的乙醇產(chǎn)量降低。此外，某些氨基酸缺陷型菌株（即自身不能合成相應(yīng)的氨基酸）對乙醇更為敏感：與色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸代謝相關(guān)基因的缺失菌株對8%乙醇敏感[22]。若能夠提高酵母細(xì)胞對乙醇的耐受性，則有利于緩解乙醇對酵母的抑制作用：一些氨基酸積累型突變菌株則對外界的環(huán)境脅迫，包括乙醇脅迫等，表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐受性[23-25]。

由圖5可知，添加六種氨基酸的實(shí)驗(yàn)組，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，乙醇產(chǎn)量均極顯著高于對照組（P＜0.01），其中添加Val、Leu、Arg的實(shí)驗(yàn)組乙醇產(chǎn)量最高，分別為11.97%（V/V）、11.90%（V/V）及11.83%（V/V），且三者之間無顯著差異（P＞0.05），對照組乙醇產(chǎn)量最低，僅為11.30%。乙醇產(chǎn)量與發(fā)酵度呈現(xiàn)出相同的趨勢，這表明酵母發(fā)酵利用麥汁中糖的程度，與產(chǎn)生乙醇的能力呈正相關(guān)性，即發(fā)酵度越高，對糖的消耗利用越充分，相應(yīng)產(chǎn)生乙醇的量就越多。發(fā)酵度和乙醇產(chǎn)量的提高，對于實(shí)際生產(chǎn)具有重要的意義：在使用相同原料量的情況下，添加氨基酸可促進(jìn)酵母對原料的充分利用，避免浪費(fèi)，并且可以提高乙醇產(chǎn)量，增加產(chǎn)能。

圖5 添加不同氨基酸對各組乙醇產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of different amino acids supplementations on ethanol yield of each group

2.4 添加不同氨基酸對啤酒風(fēng)味物質(zhì)的影響

表1 添加不同氨基酸對各組啤酒風(fēng)味物質(zhì)組成的影響Table 1 Effect of different amino acids supplementations on the composition of beer flavor of each group

由表1可知，Leu組乙酸異戊酯的含量大幅升高，導(dǎo)致其總酯的含量也大幅升高，Val組的總酯含量有所降低，其他各氨基酸添加組的酯類含量與對照組無顯著差異（P＞0.05），但是對高級醇的含量卻有較大影響：Lys添加組的總高級醇含量較對照組有所較低，僅為129.60 mg/L，此外，堿性氨基酸對啤酒的風(fēng)味物質(zhì)并無太大影響。氨基酸在酵母細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行分解代謝，通過Ehrlich途徑生成少一個(gè)碳原子的高級醇，即Val、Leu、Ile分別是異丁醇、異戊醇及活性戊醇的前體物質(zhì)。三種支鏈氨基酸對高級醇含量影響最為明顯：Val組異丁醇含量較其他組明顯升高，高達(dá)21.53 mg/L。甄會英等[26-27]研究結(jié)果均表明，添加Val會顯著提升葡萄酒或山楂酒中異丁醇的含量，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Leu組異戊醇含量遠(yuǎn)高于其他實(shí)驗(yàn)組，為196.62 mg/L，由于異戊醇含量的提高，導(dǎo)致乙酸異戊酯含量也有明顯的提高，達(dá)92.93 mg/L。醇酯比是指酒中高級醇與酯類含量的比例，能夠反映啤酒風(fēng)味的協(xié)調(diào)程度，過高或者過低均對風(fēng)味有不良影響，醇酯比在4左右時(shí)，啤酒的風(fēng)味比較協(xié)調(diào)，且不易導(dǎo)致“上頭”[28-29]。因此，添加His、Val與Leu可提高醇酯比，對啤酒的風(fēng)味有積極作用。

3 結(jié)論

在高濃釀造過程中添加Arg、Lys、His三種堿性氨基酸及Val、Leu、Ile三種支鏈氨基酸，可有效提高酵母發(fā)酵速率、酵母總細(xì)胞數(shù)及活細(xì)胞率。與對照組相比，添加該六種氨基酸，均能顯著提高麥汁發(fā)酵度，提高乙醇產(chǎn)量，其中，Val、Leu、Arg三種氨基酸效果最好。除Leu外其他五種氨基酸對酯類的含量無顯著影響，Lys可降低總高級醇含量，而Val、Leu、Ile三種支鏈氨基酸則分別大幅度增加了異丁醇、異戊醇及活性戊醇等高級醇的含量，Leu還極大地增加了乙酸異戊酯的含量。因此，在實(shí)際生產(chǎn)中，這六種氨基酸的添加可提高發(fā)酵速度，縮短生產(chǎn)周期，有利于酵母的重復(fù)使用，改善啤酒風(fēng)味。本研究為啤酒高濃釀造工業(yè)生產(chǎn)中氮源的優(yōu)化提供了有力的理論支持。堿性氨基酸和支鏈氨基酸在細(xì)胞及分子水平上對酵母發(fā)酵性能的具體影響仍有待進(jìn)一步研究。