基于高通量測序分析不同年份閩南腌制蘿卜干中細(xì)菌多樣性

鄒毅輝，黃紅宣，蔡藝敏，王小平

（漳州衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院藥學(xué)系，福建漳州 363000）

閩南地區(qū)陳年腌制的蘿卜干又稱老菜脯，是將白蘿卜切條后，經(jīng)過日曬和鹽腌后藏于老壇中發(fā)酵多年而成，年份越久，顏色越黑，風(fēng)味越獨特，具有清熱生津、增進食欲、促進消化、降低膽固醇等作用，還含有抗癌和抑菌活性成分[1-3]。由于閩南陳年蘿卜干腌制發(fā)酵時間較長，阻礙了其商品化進程。如何能加速其發(fā)酵過程，同時又不影響其食用價值，是目前迫切需要解決的問題。由于乳酸菌制劑發(fā)酵蔬菜可以縮短發(fā)酵周期，提高產(chǎn)品安全性和品質(zhì)而備受研究者的關(guān)注[4-5]。

當(dāng)前大多數(shù)對傳統(tǒng)發(fā)酵食品發(fā)酵劑的研究都是在傳統(tǒng)微生物技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過從環(huán)境中篩選符合預(yù)期的菌種來對其發(fā)酵過程進行研究，此方法并不能將環(huán)境中所有的微生物進行分離、純化和培養(yǎng)，也不能說明各菌種之間的相互交叉作用，不能全面的解釋各微生物在食品發(fā)酵過程中所起的作用[6]。高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing，HTS）又稱下一代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology，NGS）在當(dāng)今的食品質(zhì)量和安全性研究中，它已變得越來越重要。NGS可以在一次運行中產(chǎn)生數(shù)百萬個序列，并部分避免了依賴培養(yǎng)物的方法中的某些固有偏差。根據(jù)序列信息，可以鑒定出不同的微生物分類群，包括無法培養(yǎng)和難以通過培養(yǎng)方法檢測到的微生物，都能更大程度地了解發(fā)酵食品及其微生物之間的關(guān)系[7]。高通量測序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性及動態(tài)演替規(guī)律的研究[8-13]。

目前，國內(nèi)外未見對閩南陳年腌制蘿卜干中細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)的研究報道。本研究以閩南地區(qū)的蘿卜干為研究對象，運用高通量測序技術(shù)研究不同年份閩南陳年腌制蘿卜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，考察陳年腌制蘿卜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律。采用下一代測序（NGS）技術(shù)對不同年份蘿卜干進行測序，初步探索了蘿卜干發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成，發(fā)酵過程中細(xì)菌群落的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律，并采用聚類分析（cluster analysis，CA）和主成分分析（principal component analysis，PCA）分析不同年份閩南腌制蘿卜干細(xì)菌菌群差異，為后續(xù)縮短閩南陳年腌制蘿卜發(fā)酵時間提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

2018年05月到08月在福建漳浦縣農(nóng)貿(mào)市場家庭式工坊供貨戶采購腌制于密封老壇中的發(fā)酵年份為3年（編號LL03）、5年（編號LL05）、10年（編號LL10）、15年（編號LL15）、20年（編號LL20）的蘿卜干，儲存于實驗室-20 ℃冰箱保存。5種樣品均呈長條狀，質(zhì)軟帶韌性，氣濃香、味咸，其中LL03表面和斷面呈淺棕色；LL05表面和斷面呈棕褐色；LL10表面和斷面呈黑褐色、易折斷；LL15表面和斷面呈黑褐色、易折斷；LL20表面和斷面呈烏黑色、易折斷。

1.1.2 化學(xué)試劑

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil 脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：美國OMEGA公司；Qubit3.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司；2×TaqMaster Mix：南京諾唯贊生物科技有限公司；MagicPure Size Selection DNA Beads：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：深圳拓能達科技有限公司；DYY-6C電泳儀：北京市六一儀器廠；T100TM Thermal Cyeler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國BIORAD公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取、PCR擴增及Illumina Miseq測序

用液氮研磨不同年份的蘿卜干樣本后，參照E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA試劑盒的使用說明書進行DNA提取，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒精確定量基因組DNA，以融合了Miseq測序平臺的16S rRNA V3-V4通用引物341F和805R進行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增。利用Qubit3.0 DNA檢測試劑盒從2%瓊脂糖凝膠回收DNA，精確定量后在Illumina公司的Miseq 2×300 bp平臺進行測序。

1.3.2 數(shù)據(jù)分析

利用Cutadapt軟件、Pear軟件、Prinseq軟件、Usearch軟件和uchime軟件進行序列的質(zhì)量篩選和優(yōu)化[14-15]。以97%的相似度對樣本序列進行操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）聚類，利用Alpha分析物種多樣性和豐富度；PCA分析樣本物種組成相似度[16]；利用RDP classifier及Silva數(shù)據(jù)庫分析樣本中不同分類水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及組成[17]。按照生物學(xué)樣品處理基本要求，所有樣品均有3個生物學(xué)重復(fù)樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本16S rRNA基因序列質(zhì)量評估及Alpha多樣性[18]

5個樣本質(zhì)控后共產(chǎn)生247 538條有效序列，平均序列長度為416 bp，使用97%相似度的OTU，總共聚成480個OTU，利用Mothur1.30.1做Alpha多樣性分析，結(jié)果見表1。由表1可以看出，LL20樣本的Chao指數(shù)最大，說明LL20樣本的細(xì)菌豐富度最高。細(xì)菌群落的多樣性可以用Shannon指數(shù)以及Simpson指數(shù)衡量[19]。

表1 Alpha多樣性指數(shù)統(tǒng)計Table 1 Statistics of Alpha diversity indexes

圖1 香農(nóng)指數(shù)（A）辛普森指數(shù)（B）多樣性曲線Fig.1 Diversity curves of Shannon index (A) and Simpson index (B)

由表1可以看出，樣本LL03的Shannon指數(shù)最小，Simpson指數(shù)值最大，說明LL03樣本細(xì)菌多樣性最低，樣本LL20的Shannon指數(shù)最大，Simpson指數(shù)值最小，說明LL20樣本細(xì)菌多樣性最高。利用R軟件（3.2）制作稀釋性曲線圖見圖1。由圖1可知，Shannon指數(shù)及Simpson指數(shù)曲線均隨著測序量增大趨于飽和狀態(tài)，這說明此測序深度水平下，可以反映樣品中絕大多數(shù)的細(xì)菌群落信息[20]。

通過對不同年份的蘿卜干樣品細(xì)菌多樣性（Shannon指數(shù)）分析可知，細(xì)菌多樣性隨著年份的增加而增加。細(xì)菌多樣性變化趨勢與發(fā)酵年份較長的白酒窯泥一致[12]。隨著發(fā)酵時間的延長，蘿卜干中的化學(xué)成分發(fā)生了改變[1]。有機物含量和種類的變化可能是導(dǎo)致細(xì)菌多樣性增加的主要原因。

2.2 不同發(fā)酵年份蘿卜干樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)聚類分析和主成分分析

基于OTU的樣本聚類分析和主成分分析，樣本間的距離越小說明樣本間的細(xì)菌群落越相似。樣本聚類樹分析結(jié)果見圖2A。由圖2A可知，樣品LL03在單獨的一個分枝上，樣品LL05、LL10、LL15、LL20在另一個大分枝上。由此可知，在發(fā)酵5年以上的樣本細(xì)菌群落系統(tǒng)進化的差異較小。

利用主成分分析（PCA）蘿卜干樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異程度，結(jié)果見圖2B。由圖2B可知，5個不同年份的樣本可聚為2個大類，樣品LL03單獨一簇，樣品LL05、LL10、LL15、LL20聚為一簇，其中樣品LL20處于邊緣位置，這與聚類樹分析結(jié)果基本一致。因此，可以在細(xì)菌群落組成上將蘿卜干的發(fā)酵過程分為兩個階段，3年和5年以上的蘿卜干細(xì)菌群落組成差異大。

圖2 基于OUT水平的樣本聚類分析（A）主成分分析（B）Fig.2 Cluster analysis (A) and principal component analysis (B) of samples based on OUT level

2.3 門水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

在門、科、屬分類單位上對5個不同年份的樣本中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成進行分析[21]，不同樣本中細(xì)菌在分類門水平上的分布情況見圖3。由圖3可知，5個不同年份的樣本共鑒定出21個細(xì)菌門，其中變形菌門在全部蘿卜干樣本中都占據(jù)優(yōu)勢，所占的比例達到41%以上，是樣本中的優(yōu)勢菌門。樣品LL03的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），所占的比例分別為49.8%和49.1%。而5年以上蘿卜干的優(yōu)勢菌門除了變形菌門（Proteobacteria）所占的比例保持在41.2%以上外；擬桿菌門（Bacteroidetes）相對豐度顯著下降；厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）相對豐度呈現(xiàn)逐漸增加趨勢，3年和5年以上的蘿卜干在門水平上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異較大，年份越久，細(xì)菌群落越均勻。

圖3 基于門水平樣本群落結(jié)構(gòu)Fig.3 Bacteria community structure of samples based on phylum level

研究發(fā)現(xiàn)，不同腌制發(fā)酵年份的蘿卜干的細(xì)菌多樣性、群落組成各不相同。在門水平上，3年蘿卜干優(yōu)勢門為變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），而其他年份蘿卜干的優(yōu)勢菌門為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、厚壁菌門（Firmicutes）。5年以上蘿卜干厚壁菌門（Firmicutes）相對組成豐度的增加，這也表明蘿卜干中細(xì)菌多樣性隨著發(fā)酵年份的增加而增加。

2.4 屬水平上的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異分析

不同年份蘿卜干樣本中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異在屬水平上的分布情況見圖4。由圖4可知，在5個不同年份的蘿卜干樣本中相對豐度＞1%的屬有26個。樣品LL03中的主要優(yōu)勢菌屬有鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），所占的比例為46.7%；藤黃單胞菌（Luteimonas），所占的比例為29.1%。樣品LL05中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌（Acinetobacter），所占的比例為39.6%；短波單胞菌屬（Brevundimonas）所占的比例為8.1%。樣品LL10中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌（Acinetobacter），所占的比例為24.6%；苯基桿菌屬（Phenylobacterium）所占的比例為12.4%。樣品LL15中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌（Acinetobacter），所占的比例為38.4%；馬賽菌屬（Massilia）所占的比例為10.2%。樣品LL20樣本中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌（Acinetobacter），所占的比例為16.4%；乳桿菌屬（Lac-tobacillus）所占的比例為8.17%。3年和5年以上的蘿卜干在屬水平上優(yōu)勢菌屬差異較大。

圖4 基于屬水平樣本群落結(jié)構(gòu)Fig.4 Bacteria community structure of samples based on genus level

3年的蘿卜干中的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium），鞘氨醇桿菌廣泛分布于各種復(fù)雜的極端環(huán)境，多為嚴(yán)格好氧型或兼性厭氧型。能夠利用的底物寬泛，從石油、氯乙烷等高聚物到簡單無機物都能利用，這都是它們能在貧營養(yǎng)的自養(yǎng)環(huán)境中生長和繁殖的原因。鞘氨醇桿菌能夠降解纖維素等有機物[22]，蘿卜富含碳水化合物，鞘氨醇桿菌屬可能在發(fā)酵前期起重要作用。

不動桿菌（Acinetobacter）能通過酸化環(huán)境和產(chǎn)生生物表面活性劑來抑制其他微生物的生長，而且對亞硝酸鹽有較好的降解效果，能夠在干燥的環(huán)境下長期存活，并具有保持環(huán)境干燥的能力[23]。閩南蘿卜干是通過傳統(tǒng)的日曬與鹽腌脫水方式制成，蘿卜干的含水量低[24]，這也可能是5年以上的蘿卜干的優(yōu)勢菌屬是不動桿菌的原因。不動桿菌屬的細(xì)菌多為條件致病菌，含有較高豐度的不動桿菌的蘿卜干也存在一定的安全隱患[25]。

3 結(jié)論

本研究首次分析了不同年份閩南陳年腌制蘿卜微生物群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3年的蘿卜干中的優(yōu)勢菌屬為鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium）、藤黃單胞菌（Luteimonas），5年以上的蘿卜干中的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌（Acinetobacter）。3年的蘿卜樣本與5年以上的蘿卜干在微生物群落組成上存在較大差異，年份越久，細(xì)菌群落越均勻，細(xì)菌多樣性越高。不動桿菌（Acinetobacter）在腌制蘿卜干后期占主導(dǎo)地位，可能在發(fā)酵過程中起著特殊作用，這為食品微生物的研究提供了新方向。