新疆傳統(tǒng)乳品中產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選及益生特性的研究

高云云，李寶坤，盧士玲，蔣彩虹，王慶玲，董 娟

（石河子大學(xué)食品學(xué)院，新疆石河子 832000）

乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）是指發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生乳酸的一類細(xì)菌的總稱，廣泛存在于自然界中，一般被認(rèn)為是安全的（generally regards as safe，GRAS）[1]。乳酸菌胞外多糖（ex-polysaccharides，EPS）是微生物在生長(zhǎng)代謝過(guò)程中分泌到細(xì)胞外的粘液或黏附在細(xì)胞表面的莢膜多糖[2]，乳酸菌胞外多糖已被證明具有增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)[3]、抗腫瘤[4]、降膽固醇[5]、抗氧化[6]、改變發(fā)酵乳流變學(xué)特性[7]等作用。目前對(duì)與乳酸菌胞外多糖各種性質(zhì)的研究方法較為成熟，所以將其應(yīng)用于乳制品中來(lái)改變發(fā)酵乳品質(zhì)和制作功能性乳品方面有廣闊的前景。

乳酸菌作為益生菌應(yīng)具備多種對(duì)人體健康有益的生理功能，包括抑制有害菌的生長(zhǎng)、延緩機(jī)體衰老、降低膽固醇、緩解乳糖不耐癥、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡等[8]。乳酸菌發(fā)揮益生功效的前提是必須克服宿主體內(nèi)的各種不利條件，能夠耐受胃液的低pH和腸液環(huán)境中的高濃度的膽鹽及具有附著在宿主腸壁細(xì)胞的能力等，這是乳酸菌發(fā)揮作用尤為重要的條件[9-10]。近年來(lái)，乳酸菌胞外多糖由于良好的功能特在食品和醫(yī)藥行業(yè)中廣泛應(yīng)用，這使得乳酸菌受到更多的關(guān)注[11]，乳酸菌胞外多糖作為增稠劑應(yīng)用在酸奶生產(chǎn)中能夠起到改善酸奶質(zhì)地、提高產(chǎn)品穩(wěn)定性增強(qiáng)口感等作用[12]然而，國(guó)內(nèi)對(duì)于乳酸菌EPS的研究起步較晚，但近年來(lái)已取得很大的進(jìn)展[13]。關(guān)于如何準(zhǔn)確篩選產(chǎn)EPS菌株和提高產(chǎn)量是目前國(guó)內(nèi)學(xué)者研究的熱點(diǎn)。

新疆牧區(qū)少數(shù)民族在制作傳統(tǒng)乳品方面有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，這為新疆傳統(tǒng)乳制品中優(yōu)良乳酸菌菌種的開發(fā)利用提供了豐富的資源。本研究分析新疆傳統(tǒng)乳品中微生物多樣性，并篩選出了3株高產(chǎn)胞外多糖的植物乳桿菌，對(duì)菌株的潛在益生特性進(jìn)行分析，以期為進(jìn)一步利用此種菌株開發(fā)功能性食品提供良好的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

10份樣品均來(lái)自塔地區(qū)不同牧場(chǎng)。其中酸奶來(lái)源于二支河牧場(chǎng)四隊(duì)2份、二道橋鄉(xiāng)1份；酸馬奶來(lái)自霍吉爾特鄉(xiāng)和二道橋鄉(xiāng)2份；鮮馬奶來(lái)源于喀拉也木勒鄉(xiāng)1份、二道橋固牧場(chǎng)2份。樣品采集后裝入50 mL無(wú)菌離心管內(nèi)旋緊蓋并做標(biāo)記。將采集到的樣品至于低溫采樣箱中迅速運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放置在-4 ℃冰箱中，為防止微生物損失，盡快對(duì)其中的微生物進(jìn)行分離。

大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）：石河子大學(xué)畜產(chǎn)品加工實(shí)驗(yàn)室；鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus）：衡陽(yáng)師范學(xué)院。

1.1.2 化學(xué)試劑

苯酚、濃硫酸、無(wú)水乙醇、三氯化鐵、牛膽鹽、膽固醇、葡萄糖、鐵氰化鉀、磷酸等均為國(guó)產(chǎn)分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京天根生化科技限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-trinitrophenylhydrazine，DPPH）（分析純）：美國(guó)Sigma公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

脫脂乳培養(yǎng)基（EMS）[14]：90 g/L脫脂乳，3.5 g/L酵母提取物，3.5 g/L蛋白胨，10 g/L葡萄糖。MRS肉湯培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、Mueller Hinton Agar（MHA）培養(yǎng)基[15]：青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；T100TTMhermal Cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增儀：美國(guó)BIO-RAD公司；Universal Hood II凝膠成像儀：美國(guó)BIO-RAD公國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司司；Nedfuge 15R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；EONC酶標(biāo)儀：美國(guó)伯騰儀器有限公司；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳酸菌的分離純化

取酸奶、酸馬奶、鮮馬奶樣品各1 mL，用無(wú)菌生理鹽水10倍稀釋至10-5、10-6、10-7。取各濃度稀釋液100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)36 h后根據(jù)菌株在固體平板上的生長(zhǎng)情況，挑選菌落形態(tài)不同的菌株進(jìn)行革蘭氏染色及過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)。選擇革蘭氏染色陽(yáng)性過(guò)氧化氫酶陰性結(jié)果的菌株進(jìn)一步在MRS培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)后，取適量菌液接入終濃度為30%甘油中，-80 ℃保藏。

1.3.2 菌株的生物學(xué)鑒定

使用試劑盒提取菌株DNA。采用通用引物27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492r：（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'），PCR擴(kuò)增程序參照文獻(xiàn)[16]。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行序列同源性比對(duì)，并用MAGE 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

用無(wú)菌接種環(huán)蘸取一定菌液四區(qū)劃線于MRS固體培養(yǎng)基上。另取200 μL接種于ESM培養(yǎng)基中。置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后。觀察MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落形態(tài)和EMS培養(yǎng)基中的拉絲情況并做適當(dāng)記錄。

1.3.4 胞外多糖的提取及含量測(cè)定

參考LIU A等[17]的方法并做適當(dāng)修改，將活化好的菌株接3%（V/V）于MRS肉湯中，37 ℃培養(yǎng)24 h得到發(fā)酵液，發(fā)酵液于4 ℃條件下8 000 r/min 離心20 min后收集上清液。加入3倍體積的冰乙醇4 ℃過(guò)夜放置。4 ℃條件下8 000 r/min離心20 min后，將沉淀物溶解在一定體積的去離子水中，加入終濃度為8%的三氯乙酸在4 ℃保持過(guò)夜去除蛋白質(zhì)。再次離心除去沉淀，上清液置于4 ℃純水中透析48 h，每8 h換一次水。

多糖含量的測(cè)定采用苯酚-硫酸法，參照王輯等[8]的方法配制不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定各個(gè)濃度的葡萄糖溶液在波長(zhǎng)490 nm的吸光度值，分別以葡萄糖溶液濃度（x）和吸光度值（y）為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.008x+0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 7，按照回歸方程計(jì)算樣品中胞外多糖的含量。

1.3.5 產(chǎn)糖菌株的耐受性

（1）耐酸能力評(píng)價(jià)

調(diào)節(jié)MRS培養(yǎng)基的pH值為3，接種3%（V/V）活化好的乳酸菌，37 ℃培養(yǎng)4 h后將所得菌液適當(dāng)稀釋進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)[18]。

（2）膽鹽耐受性

參照DELGADO S等[19-20]的方法做部分調(diào)整。將活化好的菌液接種3%（V/V）于0、0.1%、0.2%、0.3%牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)，每小時(shí)測(cè)吸光度值（OD620nm值），直至OD620nm值上升0.3個(gè)單位，確定乳酸菌在不同濃度牛膽鹽中的生長(zhǎng)滯后期，其計(jì)算公式如下：

式中：h1為實(shí)驗(yàn)組OD620nm值上升0.3個(gè)單位需要的時(shí)間；h0為對(duì)照組OD620nm值上升0.3個(gè)單位需要的時(shí)間。

（3）人工胃液耐受性

將活化好的菌液4 000 r/min離心10 min，吸取上清液，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌沉淀兩次后重懸于等體積生理鹽水中混勻制得菌液，采用稀釋涂布平板法計(jì)算此時(shí)的菌液濃度（CFU/mL）。取1 mL菌懸液于9 mL pH值為3的模擬人工胃液中（MRS肉湯中按3 g/L添加胃蛋白酶），37 ℃厭氧培養(yǎng)3 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)[21]，菌株存活率計(jì)算公式如下：

式中：N1為3h后的菌落數(shù)，CFU/mL；N0為0h的活菌數(shù)，CFU/mL。

（4）人工腸液耐受性

取1 mL菌懸液于9 mL模擬腸液中（在MRS肉湯里添加1 g/L胰蛋白酶和3 g/L牛膽鹽），37 ℃培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)3 h后進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)。

1.3.6 產(chǎn)糖菌株DPPH自由基清除率測(cè)定

取入2 mL菌液于1 mL 0.2 mmol/L DPPH中，用無(wú)水乙醇補(bǔ)足2 mL，立刻渦旋搖勻，避光反應(yīng)30 min，測(cè)定混合液在波長(zhǎng)517nm處的吸光度值（OD517nm值）。以未加樣品為對(duì)照，無(wú)水乙醇作為空白[22]。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為1 mL的DPPH+1 mL樣品的吸光度值；Aj為1 mL溶劑+1 mL樣品的吸光度值；A0為1 mL DPPH+1 mL溶劑的吸光度值。

1.3.7 產(chǎn)糖菌株自凝聚率的測(cè)定

參考SON S H等[23]的方法作適當(dāng)修改：將活化好菌液在4 000 r/min離心20 min，用PBS洗滌細(xì)胞兩次并重懸于相同的緩沖液中，調(diào)節(jié)OD600nm值=0.3±0.05。將細(xì)菌細(xì)胞懸浮液37 ℃孵育2 h，取樣測(cè)波長(zhǎng)600 nm處吸光度值，自凝聚率計(jì)算公式如下：

式中：A0為0 h的吸光度值；A1為2 h的吸光度值。

1.3.8 產(chǎn)糖菌株表面疏水性的測(cè)定

調(diào)節(jié)菌液的初始OD600nm值=0.5±0.02。將3 mL菌懸液和1 mL二甲苯于室溫條件下混勻混合。將混合物37 ℃靜置20 min后取水相，測(cè)定其在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值（OD600nm值），表面疏水性計(jì)算公式如下：

式中：A0為0 h的吸光度值；A1為加入二甲苯后的吸光度值。

1.3.9 產(chǎn)糖菌株膽固醇去除能力

參考吳云[24]的方法做適當(dāng)修改。將活化好的菌液接3%（V/V）于膽鹽含量為0、0.1%、0.2%、0.3%且膽固醇終體積為100 μg/mL的MRS液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)24 h后，取1 mL發(fā)酵液加入4 mL無(wú)水乙醇混合均勻靜置20 min，4 ℃、5 000 r/min離心10 min，取2.5 mL 上清液加入2.5 mL磷鐵硫試劑用漩渦混合器混勻冷卻后，測(cè)定波長(zhǎng)560 nm處的吸光度值（OD560nm值），分別以膽固醇質(zhì)量濃度（x）和吸光度值（y）為橫坐標(biāo)和縱坐標(biāo)繪制膽固醇標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=0.007 1x-0.009 4（相關(guān)系數(shù)R2=0.995 5），發(fā)酵液的膽固醇含量和菌株的膽固醇去除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為培養(yǎng)前膽固醇含量，mg/mL；A1為培養(yǎng)后膽固醇含量，mg/mL。

1.3.10 產(chǎn)糖菌株抑菌能力評(píng)價(jià)

將-80 ℃保藏金黃色葡萄球菌、大腸桿菌，在BHI液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，Muelller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基純化后，使其達(dá)到對(duì)數(shù)期備用。

采用牛津杯法測(cè)定乳酸菌的抑菌活性，指示菌使用Muelller-Hinton瓊脂培養(yǎng)基調(diào)整至106～107CFU/mL倒平板待其凝固后，將已滅菌的牛津杯放于瓊脂表面上。取200 μL乳酸菌菌液于牛津杯中，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測(cè)量抑菌圈直徑。通過(guò)探究菌株對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑制作用所形成的抑菌圈直徑大小來(lái)評(píng)估益生菌對(duì)體內(nèi)致病菌感染的預(yù)防和抑制能力。

1.3.11 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2016進(jìn)行圖表的制作；利用SPSS25.0進(jìn)行差異性分析；實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)，以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的分離及鑒定

從樣品中共分離得到153株純培養(yǎng)物，經(jīng)過(guò)革蘭氏染色和過(guò)氧化氫酶實(shí)驗(yàn)初步鑒定147株為疑似乳酸菌。通過(guò)16S rDNA基因檢測(cè)分析，確定145株乳酸菌。部分乳酸菌系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化關(guān)系如圖1所示。

圖1 部分乳酸菌的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phylogenetic tree of some lactic acid bacteria

其中優(yōu)勢(shì)菌種為屎腸球菌（Enterococcus）41株約占27.8%，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）36株約占24.5%，植物乳桿菌（Lactobacillusplantarum）23株約占15.6%，其余分別為短乳桿菌（Lactobacillus brevis）10株，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）9株，保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）8株，食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria）6株，瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）4株，副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）4株，耐久腸球菌（Enterococcus durans）3株，羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）1株。

2.2 產(chǎn)胞外多糖乳酸菌的篩選

由圖2可知，在優(yōu)勢(shì)菌種屎腸球菌、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌中初篩出22株在MRS固體培養(yǎng)基和EMS培養(yǎng)基中有明顯產(chǎn)粘拉絲情況的菌株。由表1可知，用苯酚硫酸法對(duì)其所產(chǎn)多糖進(jìn)行定量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示出3株產(chǎn)胞外多糖含量較高的菌株1-3、1-6、4-1，均為植物乳桿菌。

圖2 產(chǎn)胞外多糖菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of exopolysaccharides-producing strains

表1 菌株產(chǎn)胞外多糖的產(chǎn)量Table 1 Yield of exopolysaccharides produced by strains

續(xù)表

2.3 產(chǎn)EPS植物乳桿菌的耐受性

2.3.1 耐酸能力評(píng)價(jià)

益生乳酸菌在pH值為3的環(huán)境中消化3 h后菌株的存活是作為評(píng)價(jià)菌株耐酸性的標(biāo)準(zhǔn)[25]。本實(shí)驗(yàn)中用菌株在pH值為3的環(huán)境中消化4 h來(lái)進(jìn)一步保證其在3 h的活菌數(shù)。如圖3所示，3株植物乳桿菌對(duì)低pH的生長(zhǎng)環(huán)境都有一定的耐受能力，在pH值為3的條件下處理4 h后，菌株4-1活菌數(shù)最多顯著高于鼠李糖乳桿菌（P＜0.05），但菌株1-3和1-6也表現(xiàn)出一定的耐酸能力，預(yù)示該菌株進(jìn)入消化道后具有對(duì)胃液中低pH的不利條件有較強(qiáng)的抵抗能力。

圖3 菌株耐酸能力評(píng)價(jià)Fig.3 Evaluation of acid resistance of strains

2.3.2 膽鹽耐受性

微生物在有膽鹽的環(huán)境中生長(zhǎng)會(huì)受到強(qiáng)烈抑制。因此，只有那些對(duì)高濃度膽鹽有較強(qiáng)耐受性的菌株才能在人體腸道內(nèi)存活下來(lái)并發(fā)揮作用[26]。如圖4所示，植物乳桿菌1-3相對(duì)于其他兩株菌有較強(qiáng)的膽鹽耐受性，在含量為0.1%、0.2%、0.3%的膽鹽環(huán)境中生長(zhǎng)滯后時(shí)間約為1 h、2 h、4 h。菌株4-1的生長(zhǎng)滯后時(shí)間約為2 h、4 h、7 h。菌株1-6的生長(zhǎng)滯后時(shí)間分別為2 h、6 h在膽鹽含量為0.3%的環(huán)境中生長(zhǎng)10 h后OD620nm值仍然沒有達(dá)到上升0.3，說(shuō)明菌株濃度為0.3%的膽鹽對(duì)菌株1-6的生長(zhǎng)產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。

圖4 菌株膽鹽耐受性評(píng)價(jià)Fig.4 Evaluation of bile salt tolerance of strains

2.3.3 菌株模擬腸胃耐受性

人體胃液酸性一般在pH 3左右，但由于受到飲食等因素的影響。pH值在1.5～5.0之間波動(dòng)，胃液的酸性會(huì)激活胃蛋白酶原，殺死進(jìn)入胃中的微生物。所以益生菌對(duì)胃液中的酸性環(huán)境和胃蛋白酶有一定的耐受性是其在人體內(nèi)發(fā)揮益生作用的前提[27]。人體小腸是益生菌發(fā)揮作用的場(chǎng)所，但小腸的高膽鹽環(huán)境會(huì)抑制益生菌的活性，所以益生菌對(duì)腸液也要有一定的耐受性才能發(fā)揮其益生作用[28]。3株菌的胃腸液耐受性結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，菌株4-1在人工胃液中的存活率最高達(dá)到68.74%，菌株1-6存活率最低53.07%。但菌株1-3在人工腸液中有最大的存活率達(dá)到69.97%，菌株4-1存活率最低50.01%。3株植物乳桿菌在人工胃腸液中的存活率均＞50%，說(shuō)明3株植物乳桿菌對(duì)模擬人工胃腸均有較高的耐受性。

圖5 菌株的人工胃腸液耐受性評(píng)價(jià)Fig.5 Evaluation of artificial gastrointestinal tolerance of strains

2.3.4 菌株DPPH自由基清除率

DPPH在有機(jī)溶劑中是一種穩(wěn)定的自由基，對(duì)DPPH自由基的清除可反應(yīng)出菌株具有降低過(guò)氧化自由基、烷自由基或脂質(zhì)自由基連鎖反應(yīng)的特性[29]。三株菌對(duì)DPPH自由基清除能力如圖6所示。由圖6可知，菌株1-3對(duì)DPPH自由基清除率（50.03%）明顯高于對(duì)照菌株LGG（32.77%）和菌株1-6、菌株4-1（P＜0.05），菌株4-1的DPPH自由基清除率基本與參考菌株LGG相同。目前已有研究表明植物乳桿菌DPPH自由基清除率為（8.39%～45.97%）這與目前的研究結(jié)果相類似[30-31]。XU Y等[32]研究發(fā)現(xiàn)L.plantarumKX041產(chǎn)生的EPS具有較好的清除DPPH自由基和羥基自由基的能力。本研究中3株產(chǎn)胞外多糖EPS的植物乳桿菌對(duì)DPPH自由基有較強(qiáng)的清除能力，推測(cè)其抗氧化活性與EPS活性有一定的關(guān)系，但還需進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

圖6 菌株對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.6 Scavenging rate of DPPH free radicals by strains

2.3.5 菌株的表面疏水性和自凝聚率

乳酸菌菌株的細(xì)胞表面疏水性和自聚集能力與粘附能力和腸道的定植有關(guān)[33]。自凝集是同一種菌株間相互凝集形成多細(xì)胞簇的現(xiàn)象，益生菌通過(guò)自凝集作用相互凝集到一定的數(shù)量時(shí)粘附才牢固，進(jìn)而達(dá)到菌株發(fā)揮益生功效所需要的數(shù)量。而疏水性是指非極性溶液（溶質(zhì)）在極性水中所呈現(xiàn)的不穩(wěn)定狀態(tài)，從而引起一系列熱能（熵）和分子重新分布及排列的變化。疏水性較高的菌株，對(duì)小腸組織有較高的粘附能力。菌株的自凝聚和疏水性如表2所示。由表2可知，不同菌株之間自凝聚能力和表面疏水性存在一定差異，菌株1-3的表面疏水性和自凝聚能力顯著高于其他菌株（P＜0.05）。3株植物乳桿菌都表現(xiàn)出一定自凝聚能力和疏水性，說(shuō)明該菌株有黏附在人體腸道上皮細(xì)胞和黏膜表面的可能性。

表2 菌株自凝聚及表面疏水性Table 2 Self-aggregation and surface hydrophobicity of strains

2.3.6 膽固醇降解率

高膽固醇血癥是導(dǎo)致人類發(fā)病和死亡的一個(gè)重大的健康問(wèn)題。近年來(lái)大量的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明植物乳桿菌能夠有效地降低膽固醇。由圖7可知，在添加膽鹽的培養(yǎng)基中3株植物乳桿菌降解膽固醇的能力均有所提高，表明膽鹽存在對(duì)膽固醇的降解率有一定的促進(jìn)作用。但隨著膽鹽濃度的升高其膽固醇降解率有所下降?？赡苁且?yàn)檫^(guò)高濃度的膽鹽抑制乳酸菌的生長(zhǎng)。3株植物乳桿菌都在0.1%的膽鹽濃度中有最高的膽固醇降解率。但菌株1-3的膽固醇降解率達(dá)到36.98%。這與李妮等[34]的研究結(jié)果相類似。

圖7 菌株的膽固醇降解率Fig.7 Cholesterol degradation rate of strains

2.3.7 抑菌能力評(píng)價(jià)

如圖8所示，植物乳桿菌1-3、1-6對(duì)大腸桿菌和金黃色葡糖球菌的抑制作用顯著大于菌株4-1（P＜0.05）。對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑都達(dá)到19 mm。對(duì)金黃色葡糖球菌的抑菌圈直徑都達(dá)到18 mm。而菌株4-1對(duì)大腸桿菌和金黃葡糖球菌的抑制作用較菌株1-3、1-6弱。抑菌圈直徑在15 mm左右。宋瑩龍[35]研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌12產(chǎn)生的胞外多糖對(duì)大腸桿菌，金黃色葡糖球菌等6種致病菌生物膜的形成有抑制作用。本研究中3株植物乳桿菌的高抑菌能力除了與其本身的作用之外可能也和其產(chǎn)生的胞外多糖的活性有關(guān)。

圖8 菌株1-3和1-6對(duì)大腸桿菌和金黃色葡糖球菌的抑制作用Fig.8 Inhibition of strains 1-3 and 1-6 against Escherichia coli and Staphylococcus aureus

表3 菌株對(duì)致病菌的抑菌活性Table 3 Inhibitory activities of strain against pathogens

3 結(jié)論

從新疆傳統(tǒng)乳品中分離出147株乳酸菌，通過(guò)表型鑒定及苯酚硫酸篩選出22株產(chǎn)胞外多糖含量較高的菌株，其中三株植物乳桿菌1-3、1-6、4-1的產(chǎn)量達(dá)到240 mg/L。潛在益生特性研究結(jié)果顯示，菌株1-3、1-6、4-1在酸性環(huán)境中的活菌總數(shù)都達(dá)到107CFU/mL，在模擬人工胃腸液中的存活率都大于50%。菌株1-3表現(xiàn)出最高的膽鹽耐受性，對(duì)DPPH自由基的清除能力達(dá)到50%、自凝聚力最大為59.3%及對(duì)二甲苯的粘附性為68.3%，在膽鹽濃度為0.1%時(shí)膽固醇去除率最高達(dá)到36.98%，且對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有較強(qiáng)的抑制能力。因此植物乳桿菌1-3可作為潛在益生菌用于功能性產(chǎn)品的開發(fā)。