宏基因組測(cè)序技術(shù)在傳統(tǒng)釀造食品微生物群落分析中應(yīng)用研究進(jìn)展

高 航，張 欣，趙 燕*，王文平，續(xù)丹丹，王 鵬

（1.北京食品科學(xué)研究院，北京 100068；2.北京市食品釀造所，北京 100050）

我國(guó)傳統(tǒng)釀造食品歷史悠久，種類豐富，以其獨(dú)特的魅力廣受歡迎。醬油、醬類、食醋、腐乳、白酒和泡菜等都是最常見的傳統(tǒng)釀造食品，它們是以谷類、豆類或蔬菜等為原料，將自然界的微生物引入發(fā)酵過程中共同作用而形成風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食品[1]。

傳統(tǒng)釀造技術(shù)多采用固態(tài)或半固態(tài)發(fā)酵工藝，在開放或半開放式的環(huán)境下，通過微生物群落的盛衰交替和協(xié)同作用釀制食品的過程[2-4]。經(jīng)過漫長(zhǎng)的馴化與篩選，不同地區(qū)的釀造食品形成了較為穩(wěn)定的工藝與微生物群落，賦予了釀造食品獨(dú)特的風(fēng)味、滋味和豐富的營(yíng)養(yǎng)。研究表明，醋酸菌產(chǎn)生以醋酸為主的有機(jī)酸，對(duì)高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠具有良好的抗肥胖和抗炎活性[5]；黃酒釀造過程中以霉菌和酵母菌為主代謝產(chǎn)生的功能性多糖，可以抑制小鼠的淋巴細(xì)胞增殖而增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫活性[6]；在研究傳統(tǒng)釀造醬油的生理活性時(shí)發(fā)現(xiàn)，以1.8 mL/kg的劑量灌胃高尿酸大鼠30 d，其血清尿酸水平及黃嘌呤氧化酶得到了良好的抑制，緩解了高尿酸癥狀[7]。在系統(tǒng)地剖析釀造過程中微生物群落的基礎(chǔ)上，深入挖掘功能基因和微生物間的相互作用關(guān)系，能更充分地改善與提升釀造食品的品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)[8-9]。近年來，應(yīng)用不同生物技術(shù)研究釀造食品中的微生物群落成為了熱點(diǎn)[10-11]，其結(jié)果為開發(fā)出“色、香、味、營(yíng)養(yǎng)”俱全的釀造食品奠定理論基礎(chǔ)。

在微生物學(xué)研究領(lǐng)域中，99%以上的微生物都是目前未（難）被純培養(yǎng)的，這對(duì)于具有高度物種多樣性的傳統(tǒng)釀造食品而言，進(jìn)一步了解其微生物群落結(jié)構(gòu)和功能具有更大的挑戰(zhàn)[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，傳統(tǒng)釀造食品微生物群落結(jié)構(gòu)的研究已不僅僅局限于傳統(tǒng)的可分離培養(yǎng)微生物研究[13]。高通量測(cè)序技術(shù)的更新、測(cè)序成本的降低以及測(cè)序通量的擴(kuò)展等優(yōu)勢(shì)不斷加強(qiáng)，為直接分析群落中全部微生物的種群組成、分布及其動(dòng)態(tài)演替提供了有利的技術(shù)支撐[14-15]。宏基因組測(cè)序技術(shù)不僅提供了更為豐富的微生物物種的基因信息，而且還有效提高了檢測(cè)效率和結(jié)果準(zhǔn)確性，為研究者更全面地解析微生物群落結(jié)構(gòu)、變化規(guī)律并挖掘潛在的功能基因提供契機(jī)，從而得以進(jìn)一步開展對(duì)傳統(tǒng)釀造食品的深入探索[16]。本文將對(duì)宏基因組測(cè)序技術(shù)在傳統(tǒng)釀造食品微生物群落研究中的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述，并分析討論其面臨的主要問題和發(fā)展趨勢(shì)，為釀造食品的科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)提供相關(guān)理論基礎(chǔ)。

1 宏基因組測(cè)序技術(shù)

1.1 宏基因組測(cè)序技術(shù)概述

1991年，DELONG E F等[17]首次提出環(huán)境基因組學(xué)（environmental genomics）的概念，在對(duì)太平洋浮游生物進(jìn)行系統(tǒng)分類時(shí)，通過直接提取脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）并構(gòu)建基因文庫(kù)，發(fā)現(xiàn)了15種全新的細(xì)菌序列，這是第一次不依賴于純培養(yǎng)的基因組分析而發(fā)現(xiàn)新物種的報(bào)道。1998年，HANDELSMAN J等[18]研究土壤微生物群落時(shí)首次將“特定環(huán)境中全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和”定義為宏基因組（metagenome）。目前，宏基因組的定義又被更正為特定環(huán)境中細(xì)菌和真菌遺傳物質(zhì)的總和。宏基因組測(cè)序技術(shù)正是以高通量測(cè)序?yàn)橐劳?，通過樣品和基因（組）的富集、提取特定環(huán)境中的基因組DNA、構(gòu)建宏基因組文庫(kù)和篩選目的基因等流程來研究微生物的方法，從而達(dá)到研究宏基因組的目的[19]（見圖1）。

圖1 宏基因組測(cè)序技術(shù)流程Fig.1 Sequencing process of metagenomics

宏基因組測(cè)序技術(shù)的結(jié)果除了包含群落中各種微生物的分類信息以外，更包含了所有微生物的基因信息。隨著高通量測(cè)序成本的逐漸降低，宏基因組測(cè)序技術(shù)也因而應(yīng)用在更多領(lǐng)域的微生物研究中，包括對(duì)大量不可培養(yǎng)的微生物，以及新的微生物或功能基因的認(rèn)知，極大地增加了人類對(duì)不可培養(yǎng)微生物群落的組成、演替、功能及其互相作用的認(rèn)識(shí)，開辟了微生物與環(huán)境或微生物與微生物之間的相互作用關(guān)系研究的新方法。

1.2 高通量測(cè)序技術(shù)在宏基因組測(cè)序中的應(yīng)用

高通量測(cè)序技術(shù)是現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)，其特點(diǎn)是成本低、通量高、速度快，可以快速產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)[20]。1977年Sanger測(cè)序技術(shù)誕生并在“人類基因組計(jì)劃”中被廣泛使用，被稱為“第一代測(cè)序技術(shù)”[21]。第一代測(cè)序技術(shù)具有讀長(zhǎng)較長(zhǎng)、準(zhǔn)確率較高的特點(diǎn)，但其通量較低，分析時(shí)間較長(zhǎng)等無法滿足大批量的數(shù)據(jù)分析。第二代測(cè)序技術(shù)依托的高通量測(cè)序平臺(tái)，包括Illumina公司的Solexa Genoma Analyzer測(cè)序平臺(tái)、羅氏公司的454GS FIX測(cè)序平臺(tái)和ABI公司的SOLiD測(cè)序平臺(tái)，它們的測(cè)序深度可以在一定程度上彌補(bǔ)讀長(zhǎng)較短所帶來的問題，深入并且快速的測(cè)序過程也使它們得以成為現(xiàn)今應(yīng)用最廣泛的測(cè)序技術(shù)[22]。而第三代測(cè)序技術(shù)是一種集高通量、快速度、讀長(zhǎng)更長(zhǎng)及低成本等多種優(yōu)點(diǎn)于一身的新型測(cè)序技術(shù)，它的出現(xiàn)為宏基因組學(xué)的研究注入了新活力[23]。

1.2.1 基于宏基因組測(cè)序技術(shù)的微生物群落分析

在原核微生物中，與23SrRNA和5SrRNA相比，16SrRNA包含適量且足夠的信息量和序列長(zhǎng)度，因此作為研究物種進(jìn)化關(guān)系的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[24]。16S rRNA的微生物群落分析可產(chǎn)生深度的16S rRNA測(cè)序數(shù)據(jù)，并通過比對(duì)或聚類的分析方法，將16S rRNA序列聚類成分類操作單元（operational taxonomic unit，OTU），利用OTU的數(shù)目、各個(gè)OTU的序列數(shù)來分析估計(jì)物種多樣性和豐度，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)數(shù)據(jù)來源的微生物物種和微生物群落的物種構(gòu)成進(jìn)行分析[25]。在真核微生物中，真菌DNA的堿基組成遺傳穩(wěn)定，不易受環(huán)境影響，而且在其生長(zhǎng)的任何階段均可獲得。內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）在不同菌株間存在豐富的變異，對(duì)ITS區(qū)進(jìn)行序列分析豐富了真核生物核糖體基因ITS的序列信息。ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域，其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯，通過對(duì)ITS序列進(jìn)行DNA測(cè)序，進(jìn)而將測(cè)序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，為真菌分類鑒定等研究提供了十分重要的資料和依據(jù)[26]。但是，在鑒定物種方面，16S rRNA和ITS的分類精度是有限的，一般僅能夠精確分類到屬水平，其序列很多注釋不到種水平。其原因是16S rRNA和ITS測(cè)序技術(shù)能夠區(qū)分非常相近的高變區(qū)的特異性序列片段有可能不在擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，即非全長(zhǎng)的可變區(qū)序列覆蓋范圍不夠?qū)е聼o法鑒定到種[27]。然而，同一種的不同個(gè)體在基因組信息上也會(huì)有差異，只分類到屬是遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠的。

宏基因組測(cè)序技術(shù)是先將微生物基因組DNA隨機(jī)打斷成若干條500 bp的小片段，并在片段兩端加上通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增測(cè)序，然后再進(jìn)行組裝拼接得到基因序列，眾多基因即可構(gòu)成完整的基因組[28]。因此，在物種鑒定過程中，宏基因組測(cè)序技術(shù)并不受高突變區(qū)的影響，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。此外，宏基因組測(cè)序得到的微生物群落基因信息，還可進(jìn)一步開展特定環(huán)境中微生物群體基因組成及功能分析、微生物群體的多樣性與豐度演替變化等研究，為深入分析微生物與環(huán)境、微生物與宿主之間的關(guān)系以及挖掘具有特定功能的基因提供有力的支撐[29]。

宏基因組測(cè)序無需分離純培養(yǎng)微生物，直接對(duì)樣品中微生物群落的總基因進(jìn)行測(cè)序和分析，可同時(shí)鑒定出細(xì)菌和真菌，不僅保證了低豐度的微生物可以被檢測(cè)出來，而且檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確，較大地?cái)U(kuò)展了微生物資源的利用，為復(fù)雜的微生物群落體系研究提供了有效工具[30]。宏基因組深度測(cè)序可以揭示或估計(jì)環(huán)境中真實(shí)的物種多樣性和遺傳多樣性，挖掘具有應(yīng)用價(jià)值的基因資源，應(yīng)用于開發(fā)新的微生物活性物質(zhì)。目前，宏基因組測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用在食品微生物[31]、腸道微生物[32]等多領(lǐng)域的微生物群落研究中。

1.2.2 基于宏基因組測(cè)序技術(shù)的功能基因分析

基于16S rRNA和ITS測(cè)序技術(shù)只能依賴于基因庫(kù)中已知基因序列進(jìn)行分析，而缺乏具體的功能基因信息。相比之下，宏基因組測(cè)序技術(shù)在一定程度上彌補(bǔ)了這些缺陷，使得人們可以更系統(tǒng)地研究微生物群落結(jié)構(gòu)及其功能基因，全面分析其組成、變化規(guī)律、親緣進(jìn)化并挖掘出潛力豐富的功能基因，從而得以進(jìn)一步揭開釀造食品微生物群落的奧秘[33]。

功能基因的篩選無需依賴于已知的基因信息，因此可能得到新的基因和產(chǎn)物；但其受制于外源基因在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，并因檢測(cè)手段的局限性和有效性只能在大量分析的基礎(chǔ)上篩選出極少的具有活性的基因。鑒于此，發(fā)展高通量、高靈敏度、快速簡(jiǎn)便的篩選方法或體系十分必要[34]。高通量測(cè)序數(shù)據(jù)首先映射到微生物基因組和基因的已知數(shù)據(jù)庫(kù)（如美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫(kù)或京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)），并獲得每個(gè)宏基因組樣本的基因目錄，顯然此種方法需要有足夠的數(shù)據(jù)庫(kù)支撐[35]。針對(duì)宏基因組測(cè)序技術(shù)的數(shù)據(jù)分析，一般分為基于比對(duì)的方法和不基于比對(duì)的方法，二者均通過對(duì)基因豐度水平的估計(jì)實(shí)現(xiàn)對(duì)基因進(jìn)行預(yù)測(cè)或者功能性分析?；诒葘?duì)的序列比較方法通常先被映射到已知的基因或者生化路徑代謝數(shù)據(jù)庫(kù)中，再對(duì)基因或基因家族的豐度水平進(jìn)行估計(jì)，最后結(jié)合一些功能基因、代謝通路、信號(hào)通路等數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)研究者感興趣的部分進(jìn)行分析或進(jìn)行基因預(yù)測(cè)[36]。不基于比對(duì)方法克服了基于比對(duì)的方法對(duì)有限的參考數(shù)據(jù)庫(kù)的依賴，其通過統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)度為k的元組出現(xiàn)的頻度而計(jì)算，在未知物種為主的宏基因組分析中，以長(zhǎng)度k分析的優(yōu)勢(shì)非常明顯，是宏基因組的一個(gè)重要的研究方向[37]。

2 宏基因組測(cè)序技術(shù)在傳統(tǒng)釀造食品中的應(yīng)用

2.1 傳統(tǒng)釀造食品中微生物群落結(jié)構(gòu)的解析

2.1.1 微生物群落組成分析

傳統(tǒng)的釀造食品多在開放式環(huán)境中經(jīng)混菌發(fā)酵形成，其中富含復(fù)雜多樣的微生物群落結(jié)構(gòu)體系[38]。目前，只有少部分優(yōu)勢(shì)菌種通過純培養(yǎng)技術(shù)鑒定出來，而基于16S rRNA克隆建庫(kù)[39]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）[40]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）[41]等無需純培養(yǎng)的分析技術(shù)，也只能鑒定出豐度較高或參考數(shù)據(jù)庫(kù)中可供參考的基因信息。更全面地了解不同發(fā)酵階段的微生物群落組成，是提高釀造食品品質(zhì)和發(fā)酵效率的必要條件。因此，基于宏基因組測(cè)序技術(shù)能鑒定出更低豐度的微生物群落及精準(zhǔn)鑒定到種級(jí)別的優(yōu)勢(shì)上，廣泛地應(yīng)用在更全面和更微小的微生物群落體系研究中。

在印度米酒酒曲（Xaj-pitha）的研究中，BORA S S等[42]首次應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)揭示了更為全面的微生物群落特征，其中鑒定出的微生物包括以乳酸菌為主的細(xì)菌、根霉、毛霉和曲霉等產(chǎn)淀粉酶菌株；以季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii），威克漢姆西弗酵母（Wickerhamomyces ciferrii）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為主的產(chǎn)乙醇菌株等。但對(duì)于所獲得的宏基因組數(shù)據(jù)，作者僅報(bào)道了分類學(xué)結(jié)果，并沒有進(jìn)一步分析功能基因組和代謝途徑。NIE Z等[43]應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)在傳統(tǒng)食醋中首次發(fā)現(xiàn)了相對(duì)豐度不到0.1%的念珠藻屬（Nostoc），類諾卡氏菌屬（Nocardioides），丙酸菌屬（Propionibacterium），克雷伯氏菌屬（Klebsiella）和片球菌屬（Pediococcus）。在工業(yè)生產(chǎn)中，念珠藻屬可產(chǎn)生200多種次生代謝物，被用于蛋白質(zhì)、維生素和多不飽和脂肪酸的生物來源[44]；而丙酸菌屬的發(fā)酵也可大量生產(chǎn)維生素B12[45]。此類菌種雖然豐度較低，但是功能卻不可忽視，尤其通過其在工業(yè)生產(chǎn)中的作用可推測(cè)在食醋的生產(chǎn)發(fā)酵中可能具有類似作用。對(duì)比前人通過培養(yǎng)方式，僅能分離鑒定出食醋在發(fā)酵過程中的醋酸菌（主要包括醋桿菌屬、葡萄糖桿菌屬和葡萄糖醋酸桿菌屬）、乳酸菌（主要包括乳桿菌屬和乳球菌屬）和芽孢桿菌屬[46]，而宏基因組測(cè)序技術(shù)大大提高了微生物菌種的覆蓋率。類似地，孫煒寧等[47]利用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)東北酸菜進(jìn)行了深入研究，應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)首次在東北酸菜中鑒定出屬于腸桿菌的果膠桿菌（Pectobacterium）和拉恩氏菌（Rahnella）。在食品安全方面，腸桿菌可能導(dǎo)致食品污染，甚至可能引發(fā)的食源性疾病。酸菜中腸桿菌的存在主要與酸菜直接使用未清洗的白菜作為腌制材料以及低鹽濃度（0.5%～1.0%）的發(fā)酵液有密切的關(guān)系。因此，在酸菜發(fā)酵中檢測(cè)和控制發(fā)酵體系中腸桿菌科細(xì)菌的豐度和動(dòng)態(tài)變化情況有助于積極控制和消除發(fā)酵蔬菜中亞硝酸鹽和生物胺帶來的危害。唐婧等[48]分別提取2011-2013年的茅臺(tái)酒酒曲微生物總基因組DNA，基于宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)茅臺(tái)酒酒曲細(xì)菌群落多樣性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，茅臺(tái)酒酒曲微生物群落構(gòu)成穩(wěn)定，主要分布于γ-變形菌綱（50%以上）和芽孢桿菌綱（30%以上），分屬于魏斯氏菌、片球菌、明串球菌、糖多孢菌、歐文氏菌、真絲菌、短狀桿菌、鞘氨醇桿菌、醋酸桿菌、糖單孢菌、鹽單胞菌和德庫(kù)菌。因此，宏基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用在保證茅臺(tái)酒的微生物群落穩(wěn)定方面提供了一定的技術(shù)支撐。

2.1.2 微生物菌群動(dòng)態(tài)演替分析

宏基因組測(cè)序技術(shù)不僅可以快速準(zhǔn)確地解析微生物群落的結(jié)構(gòu)，并且可以同步確定各種微生物的相對(duì)豐度變化水平[49]。釀造食品通過微生物菌群的代謝生成各類物質(zhì)，賦予釀造食品不同的風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)功能[50]。在釀造過程中，菌群結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替直接影響代謝產(chǎn)物的形成，微生態(tài)調(diào)控被視為改善傳統(tǒng)釀造食品風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的關(guān)鍵與核心技術(shù)[51]。聶志強(qiáng)等[52]應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)天津獨(dú)流老醋醋酸發(fā)酵過程中的群落變化研究中發(fā)現(xiàn)，在醋酸發(fā)酵過程中，醋醅中一些相對(duì)豐度較低的細(xì)菌（相對(duì)豐度均在0.01%以上）也發(fā)生著較大的變化。其中，類諾卡氏菌屬（Nocardioides）的相對(duì)豐度呈上升的趨勢(shì)，在末期相對(duì)豐度達(dá)到0.06%，說明其具有較強(qiáng)的醋酸耐受性。假單胞菌屬（Pseudomonas）隨著醋酸發(fā)酵的進(jìn)行相對(duì)豐度從0.14%下降到0.04%后逐漸消失，說明醋酸對(duì)假單胞菌屬菌的影響較大。另外，埃希氏桿菌屬在發(fā)酵前期到中期呈增加的趨勢(shì)，而克雷伯氏菌屬卻僅出現(xiàn)在發(fā)酵末期，說明克雷伯氏菌有一定醋酸耐受性。在整個(gè)發(fā)酵周期中，相對(duì)豐度＞0.01%的細(xì)菌達(dá)到10種，說明食醋固態(tài)釀造過程中來源于樣品和環(huán)境中的多種微生物能夠自發(fā)地繁殖、富集，這也導(dǎo)致了傳統(tǒng)食醋豐富的風(fēng)味。

在研究傳統(tǒng)釀造醬油的微生物群落過程中，WEI C L等[53]采用PCR-DGGE法研究發(fā)現(xiàn)，在醬油的整個(gè)發(fā)酵過程中，以四種葡萄球菌屬（Staphylococcus）和四種桿菌屬（Bacillus）為優(yōu)勢(shì)菌，庫(kù)特氏菌（Kurthia）和克雷伯氏（Klebsiella）在制曲階段出現(xiàn)，在糖化階段逐漸消失。WANG H等[54]基于宏基因組學(xué)技術(shù)，比較了醬油發(fā)酵中制曲和糖化階段的細(xì)菌群落變化。制曲階段共鑒定出29屬細(xì)菌，后期7個(gè)屬消失；糖化階段鑒定出34屬細(xì)菌，后期又出現(xiàn)了12個(gè)新的細(xì)菌屬。制曲和糖化階段的優(yōu)勢(shì)菌種分別為庫(kù)特氏菌（Kurthia）、魏斯氏菌屬（Weissella）、葡萄球菌（Staphylococcus）和葡萄球菌（Staphylococcus）、庫(kù)特氏菌（Kurthia）、腸球菌（Enterococcus）、明串珠菌（Leuconostoc）。在制曲和糖化階段，含量?jī)H有0.21%的四體球菌屬（Tetragenococcus）也同樣被鑒定出來。通過比較，DGGE法與宏基因組測(cè)序法得到的結(jié)果在微生物豐度方面相似。顯然，宏基因組測(cè)序法比其他研究方法獲得了更高的物種覆蓋率，從而全面闡明釀造過程中微生物群落的動(dòng)態(tài)變化。

宏基因組測(cè)序技術(shù)的另一大優(yōu)勢(shì)即為可同時(shí)鑒定出真菌和細(xì)菌的群落變化，這一特點(diǎn)大大提高了檢測(cè)效率，同時(shí)也減少了因方法選擇的局限性帶來某部分微生物物種信息的缺失。因此，宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用受到越來越多研究者的青睞。XU D D等[55]在研究腐乳發(fā)酵過程中真菌和細(xì)菌群落的動(dòng)態(tài)變化時(shí)發(fā)現(xiàn)，腐乳發(fā)酵前期以毛孢菌屬、放線菌屬和隱球菌屬為主，發(fā)酵后期以紅曲霉屬和曲霉屬為主。此外，在加入混合料后首次檢測(cè)到芽孢桿菌，但在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，芽孢桿菌數(shù)量急劇下降至極低水平（0.07%）。因此，發(fā)酵過程中各個(gè)階段微生物動(dòng)態(tài)變化的研究結(jié)果可進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)腐乳安全性和質(zhì)量的評(píng)價(jià)。

2.2 傳統(tǒng)釀造食品中功能微生物或功能基因的鑒定

中國(guó)傳統(tǒng)釀造食品中微生物物種的高度多樣性使得進(jìn)一步分析微生物群落的代謝功能成為一個(gè)更大的挑戰(zhàn)。功能微生物和功能基因的鑒定有助于更清晰地在眾多微生物菌群中錨定對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)或功能起到重要作用的微生物群落或基因，以便能更準(zhǔn)確地進(jìn)行分析研究[56]。WU L等[57]采用宏基因組測(cè)序技術(shù)對(duì)香醋的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能微生物進(jìn)行了研究，進(jìn)而了解與食醋風(fēng)味相關(guān)的微生物菌群。結(jié)果顯示，食醋中細(xì)菌、真核生物和古細(xì)菌的相對(duì)豐度分別為91.75%、0.19%和8.06%。此外，共有來自951屬細(xì)菌的蛋白編碼基因被鑒定出來，其中42.3%與代謝通路相關(guān)，28.3%與遺傳信息相關(guān)，還有10.1%與環(huán)境信息相關(guān)。食醋的風(fēng)味研究結(jié)果表明，乙偶姻是在醋酸發(fā)酵過程中提高香醋風(fēng)味的重要物質(zhì)，其合成受到多種代謝途徑的調(diào)控[58]。然而，在以往的研究中，探索產(chǎn)生乙偶姻的具體微生物并未被清晰的識(shí)別出來，而宏基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用可在已知的乙偶姻代謝途徑中瞄定功能微生物進(jìn)行深入研究。LU Z M等[59]通過宏基因組測(cè)序技術(shù)，在物種水平上揭示了乙偶姻代謝途徑中微生物的分布差異。乙偶姻代謝途徑主要是在乙酰乳酸合酶和乙酰乳酸脫羧酶共同調(diào)控下完成。結(jié)果顯示，乙酰乳酸合酶主要由布氏乳桿菌（L.buchneri）（21.0%）和巴氏桿菌（A.pasteurianus）（29.3%）產(chǎn)生；而布氏乳桿菌（L.buchneri）（26.5%）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）（11.6%）、巴氏桿菌（A.pasteurianus）（5.6%）、發(fā)酵乳桿菌（L.fermentum）（3.2%）和短乳桿菌（L.brevis）（2.8%）參與了乙酰乳酸脫羧酶的合成代謝。雙乙酰是合成乙偶姻主要的前體物質(zhì)，巴氏醋桿菌（Acetobacter pasteurianus）和四種乳酸菌，包括布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）、羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）是醋酸發(fā)酵過程中促使雙乙酰向乙偶姻轉(zhuǎn)化的功能微生物菌種。GUO M等[60]在研究中國(guó)傳統(tǒng)釀造白酒時(shí)發(fā)現(xiàn)，真核生物占整個(gè)微生物群落的比例很小[（6.0±1.4）%]。但它們對(duì)白酒發(fā)酵過程中代謝產(chǎn)生乙醇有重要作用，半乳酵母菌能產(chǎn)生高活性的纖維素酶，以有效地進(jìn)行酶的糖化。乳桿菌（Lactobacillus）、互養(yǎng)單胞菌（Syntrophomonas）、甲烷囊菌（Methanoculleus）、甲烷桿菌屬（Methanobacterium）、芽孢桿菌（Bacillus）、梭狀桿菌（Clostridium）、耐堿酵母屬（Galactomyces）、念珠菌（Candida）、畢赤酵母（Pichia）、青霉菌（Penicillium）和曲霉菌（Aspergillus）是白酒中的活性微生物群落，這些微生物也與白酒中主要的風(fēng)味成分形成（己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等）所一致。此類微生物與乳酸、乙醇、丁酸、乳酸乙酯、短鏈脂肪酸、乙酯的生成有直接關(guān)系。從某種意義上說，白酒的風(fēng)味化合物微生物群落結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。PARK J M等[61]研究泡菜29 d發(fā)酵過程的宏基因組，揭示了一系列碳水化合物異養(yǎng)乳酸發(fā)酵的相關(guān)基因，這與檢測(cè)到發(fā)酵產(chǎn)物甘露醇、乳酸、乙酸乙酯、乙醇等相吻合。將宏基因組序列與不同菌屬微生物基因組序列比較發(fā)現(xiàn)，大部分的宏基因組測(cè)序序列與腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）和沙克乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）的基因序列具有高度相似性，表明泡菜發(fā)酵過程中這兩種菌很可能發(fā)揮了重要作用。

2.3 傳統(tǒng)釀造食品中微生物與環(huán)境的相互作用關(guān)系

中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品開放程度高、微生物構(gòu)成復(fù)雜，發(fā)酵過程并非單個(gè)微生物的疊加，還存在復(fù)雜的交互作用機(jī)制，包括細(xì)胞與細(xì)胞之間的物理接觸、代謝物交換、水平基因轉(zhuǎn)移等方式，這些多種多樣的作用方式最終形成了微生物之間的共生、競(jìng)爭(zhēng)、偏利共生及偏害共生等交互作用關(guān)系，進(jìn)而影響了群落整體的組成結(jié)構(gòu)以及功能[62]。除微生物群落內(nèi)部的互作以外，微生物與環(huán)境之間也有復(fù)雜的交互作用關(guān)系。隨著發(fā)酵過程的推進(jìn)，釀造微生態(tài)環(huán)境也不斷改變，進(jìn)而又作用于微生物群落，影響著群落的結(jié)構(gòu)和功能，并最終影響產(chǎn)品品質(zhì)[63]。因此，系統(tǒng)理解傳統(tǒng)釀造食品的發(fā)酵進(jìn)程，需要明晰微生物與環(huán)境之間的相互作用關(guān)系，才能有效建立調(diào)控群落功能的策略。

在中國(guó)傳統(tǒng)的白酒釀造過程中，來自于原材料、大曲及窖泥等環(huán)境中的各種微生物已逐漸形成了穩(wěn)定的微生物群落結(jié)構(gòu)，從而對(duì)白酒品質(zhì)和風(fēng)味產(chǎn)生重要的影響。GUO M等[60]應(yīng)用宏基因組測(cè)序技術(shù)研究了來自瀘州、綿陽(yáng)和成都三地的白酒品質(zhì)與環(huán)境的相互作用規(guī)律。結(jié)果顯示，在釀造過程中，酒的品質(zhì)特征與產(chǎn)地微生物群落高度相關(guān)。不同的地理環(huán)境促使窖泥累積了不同微生物群落，進(jìn)一步影響了白酒品質(zhì)和風(fēng)味。瀘州、綿陽(yáng)和成都三地的窖泥中含有共同菌種133屬，而瀘州地區(qū)的窖泥還檢測(cè)出了188個(gè)特異屬，綿陽(yáng)和成都地區(qū)僅有29和13屬特異菌，這些菌屬發(fā)酵產(chǎn)生不同強(qiáng)度的己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯等，賦予了終產(chǎn)品不同的特征風(fēng)味。在對(duì)三種白酒的揮發(fā)性成分分析時(shí)表明，不同產(chǎn)地的白酒表現(xiàn)出明顯的感官特征區(qū)別，瀘州地區(qū)的豐富微生物群落促使了優(yōu)質(zhì)白酒的生產(chǎn)。因此，深入研究不同產(chǎn)地的產(chǎn)品中微生物群落差異，有助于明確地域因素對(duì)釀造食品品質(zhì)的影響。

3 展望

近年來，宏基因組測(cè)序技術(shù)在分析傳統(tǒng)釀造食品的微生物群落組成、微生物群落的動(dòng)態(tài)演替、功能基因或功能微生物以及微生物與環(huán)境的相互作用關(guān)系中取得了一些進(jìn)展，為釀造食品的深入研究或工業(yè)生產(chǎn)都起到了一定的積極作用。然而，宏基因組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用依舊存在著一些不可避免的局限性，如宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)量較大，分析有一定的難度；測(cè)序分析費(fèi)用較高，大大增加了樣品重復(fù)性試驗(yàn)的成本。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，三代測(cè)序技術(shù)如PacBio RS很好地彌補(bǔ)了第一、二代測(cè)序技術(shù)的不足，為宏基因組測(cè)序技術(shù)更準(zhǔn)確、更便捷的應(yīng)用提供了更有力的技術(shù)支撐。

宏基因組測(cè)序技術(shù)在研究微生物多樣性或明確功能基因方面都有無可代替的作用，但是在微生物的巨大體系中，信使核糖核酸（messenger ribonucleic acid，mRNA）、核糖體核糖核酸（ribosome ribonucleic acid，rRNA）、轉(zhuǎn)運(yùn)核糖核酸（transfer ribonucleic acid，tRNA）、非編碼核糖核酸（noncoding ribonucleic acid，ncRNA）以及蛋白質(zhì)均是行使細(xì)胞功能的重要承擔(dān)者。因此，在獲取微生物基因信息的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確微生物的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，才能準(zhǔn)確描述微生物的功能和狀態(tài)。宏基因組學(xué)與宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)等多組學(xué)技術(shù)的聯(lián)用將有助于更清晰地了解傳統(tǒng)釀造食品中微生物的群落結(jié)構(gòu)演替、相互作用、功能菌株對(duì)食品品質(zhì)和風(fēng)味的貢獻(xiàn)，并挖掘出新的功能基因。未來，生物信息學(xué)、分子生物學(xué)等多學(xué)科理論知識(shí)的豐富以及更新一代測(cè)序技術(shù)、更加完善的基因數(shù)據(jù)庫(kù)、先進(jìn)的數(shù)據(jù)分析工具的應(yīng)用以及多種組學(xué)方法的結(jié)合將給釀造食品微生物的研究帶來新的曙光。