• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    基于葉綠體rbcL序列擴(kuò)增的天南星藥材及其常見混偽品的分子鑒定研究

    2020-06-08 06:39:52許貞劉春生胡小松隋丞琳崔秀梅侯鳳祥顧選
    環(huán)球中醫(yī)藥 2020年4期
    關(guān)鍵詞:天南星偽品種間

    許貞 劉春生 胡小松 隋丞琳 崔秀梅 侯鳳祥 顧選

    藥材天南星為天南星科植物天南星Arisaemaerubescens(Wall.)Schott、異葉天南星ArisaemaheterophyllumBl.或東北天南星ArisaemaamurenseMaxim.的干燥塊莖,性溫,味苦辛,歸肺、肝、脾經(jīng),具有散結(jié)消腫的功效[1]。天南星藥材通常被加工成制天南星或膽南星飲片,具有化痰、息風(fēng)止痙等功效,常用于頑痰咳嗽、風(fēng)痰眩暈、中風(fēng)痰壅、口眼斜等癥[2],臨床需求量大。此外,天南星入藥能夠起到祛痰、抗炎以及散結(jié)消腫的作用,所以其常用于抗腫瘤藥物組方之中。有研究表明,鮮天南星水提取物可對(duì)小鼠子宮纖維瘤起到一定的抑制作用[3],且不同來源的天南星外用對(duì)大鼠外傷性血瘀有很好的治療作用[4]。由于天南星科植物眾多,全國各地用藥習(xí)慣不同,往往就地取材入藥,本草記載也存在同名異物,同物異名等情況,導(dǎo)致中藥材天南星的市場基原混亂,很難辨別。市場上,天南星主流基原為天南星A.erubescens,除正品天南星外,常有天南星科其他種類如半夏屬掌葉半夏Pinelliapedatisecta、半夏Pinelliaternata、菖蒲屬菖蒲Acoruscalamus、千年健屬千年健Homalomenaocculta等充作天南星用或混淆使用。天南星科植物多有毒,毒性反應(yīng)主要表現(xiàn)對(duì)口腔、咽喉及皮膚黏膜有很強(qiáng)的刺激性[5],且不同物種毒性強(qiáng)度不同。吳紫君等[6]研究結(jié)果表明,天南星科3種有毒中藥天南星、半夏、白附子生品均有明顯的急性毒性,其中以生半夏毒性最強(qiáng)。因此,正品天南星的正本清源和準(zhǔn)確鑒定對(duì)于用藥安全顯得十分重要。

    目前,天南星真?zhèn)舞b別的方法除性狀[7]外,還有薄層鑒別法[8]、指紋圖譜鑒別法[9-10]、近紅外光學(xué)鑒別[11-12]等方法。雖然傳統(tǒng)的鑒別方法能夠?qū)μ炷闲沁M(jìn)行鑒別,但鑒別方法復(fù)雜,適用范圍較窄,且結(jié)果易受到產(chǎn)地、采摘時(shí)間、儲(chǔ)存條件等因素的影響,具有一定的局限性。而傳統(tǒng)性狀鑒別需要極大的工作經(jīng)驗(yàn)積累,無法快速普及。因此,為保證中藥材臨床用藥的安全、有效性,亟需建立一種穩(wěn)定、快速、準(zhǔn)確的鑒別方法。自2003年首次提出“DNA條形碼”這一概念,DNA條形碼分子鑒定技術(shù)飛速發(fā)展,為傳統(tǒng)形態(tài)分類學(xué)帶來了新的發(fā)展機(jī)遇[13-14]。DNA條形碼技術(shù)作為一種新興的鑒定技術(shù),可用于中藥材的基原鑒定,并且具有快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。陳士林等[15]基于大樣本量實(shí)驗(yàn)創(chuàng)建了中藥材DNA條形碼分子鑒定體系,并提出中藥材DNA條形碼分子鑒定指導(dǎo)原則。目前該指導(dǎo)原則已納入《中華人民共和國藥典》(2015版)。近年來DNA條形碼技術(shù)在中藥真?zhèn)舞b別中應(yīng)用越來越廣[16-17]。

    本研究收集市場天南星正品及其常見混偽品,運(yùn)用分子鑒定技術(shù),采用葉綠體核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶大亞基(Ribulose 1,5-bisphosphate carboxylase-oxygenase large subunit,rbcL)基因序列引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增、測序,結(jié)合Genbank數(shù)據(jù)庫,通過計(jì)算種內(nèi)、種間K2-P遺傳距離及構(gòu)建N-J樹對(duì)不同樣品進(jìn)行鑒定,旨在對(duì)天南星藥材及其常見混偽品進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別,為市場上的天南星藥材的質(zhì)量評(píng)價(jià)和用藥準(zhǔn)確提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 儀器和試劑

    MM400冷凍混合球磨儀(德國RETSCH公司),各種量程的微量移液器(德國 Eppendorf 公司),高速離心機(jī)(德國Sigma公司),BIO-RAD T100 Thermal Cycler PCR儀(德國Biomerta公司),Bio-Rad型電泳儀,JY-SPDT型水平電泳槽(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司),BG-gdsAUTD520凝膠成像分析系統(tǒng)。

    廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒(TIANGEN),2×Taq plus per mastermix(含染料)(北京博邁德發(fā)展有限公司),瓊脂糖G-10(賽百盛公司)。

    引物由上海生工生物工程股份有限公司合成,所用試劑均為分析純。

    1.2 材料

    實(shí)驗(yàn)材料為植物塊莖,總計(jì)13份,均來源于北京華邈藥業(yè)有限公司,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為天南星藥材及其常見混偽品,憑證標(biāo)本保存于北京中醫(yī)藥大學(xué)標(biāo)本館,其余各基原物種rbcL序列均下載于GenBank核酸數(shù)據(jù)庫。材料來源及樣品信息見表1。

    1.3 DNA提取

    取樣品約20 mg,經(jīng)球磨儀粉碎后,根據(jù)天根廣譜植物基因組DNA快速提取試劑盒使用說明提取DNA,微量核酸定量儀檢測所得DNA質(zhì)量。

    1.4 PCR擴(kuò)增

    采用30 μL反應(yīng)體系:樣品總DNA為2 μL,rbcL正反向引物(F-5′-ATGTCACCACAAACAGAAACT-3′;R-5′-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-3′)各1 μL,2×Mix聚合酶15 μL,ddH2O補(bǔ)足。

    PCR反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性3分鐘,30個(gè)循環(huán):95℃變性30秒,62℃退火30秒,72℃延伸1分鐘,72℃總延伸5分鐘。

    1.5 測序分析

    擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析,紫外燈下檢驗(yàn),在500 bp左右處出現(xiàn)單一、明亮、清晰的條帶,剩余PCR產(chǎn)物由北京小師弟商貿(mào)有限公司進(jìn)行測序分析。每個(gè)樣品均采用正反雙向測序,以保證測序結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    1.6 序列比對(duì)及N-J系統(tǒng)聚類樹建立

    使用ContigExpress及DNAMAN軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行拼接及序列比對(duì),MEGA 5.0軟件對(duì)序列長度、變異位點(diǎn)、保守位點(diǎn)以及堿基組成進(jìn)行分析,計(jì)算種間種內(nèi)變異特點(diǎn)的最小種間距離、最大種內(nèi)距離并構(gòu)建N-J系統(tǒng)聚類樹,進(jìn)而評(píng)估該序列用于鑒別天南星及其混偽品的可靠性。

    2 結(jié)果

    本研究分析了天南星科4個(gè)屬8個(gè)種共21個(gè)樣本,其中除了13號(hào)樣品(Sample 13)未能擴(kuò)增成功外,其余樣品均獲得測序結(jié)果。經(jīng)過序列校正,對(duì)序列進(jìn)行分析。

    表1 樣品信息表

    2.1 rbcL序列分析

    對(duì)實(shí)驗(yàn)樣品(Sample 1~13)及GenBank下載的天南星及其常見混偽品rbcL序列進(jìn)行分析,其中樣品編號(hào)Sample 1、Sample 6~12為天南星(A.erubescens),樣品編號(hào)Sample 2為三裂葉半夏(P.tripartite),樣品編號(hào)Sample 3~5為虎掌南星(P.pedatisecta)。樣品測序結(jié)果序列拼接后顯示,rbcL序列長度約為580 bp。對(duì)樣品的堿基組成進(jìn)行分析,不同種堿基組成如表2所示。樣本中G+C含量分布為43.6%~45.3%。G+C含量菖蒲(A.calamus)與其他7種差異較大,剩余7種G+C含量的整體差異較小,表明親緣關(guān)系可能較近,但是種間未重疊,說明種間存在明顯的遺傳變異。

    表2 8種天南星科樣本rbcL序列堿基組成(%)

    2.2 遺傳距離分析

    使用MEGA5.0軟件基于K2-P模型計(jì)算各樣品種內(nèi)及種間遺傳距離。分析結(jié)果表明,樣本中最大種內(nèi)遺傳距離為0.2%,種間遺傳距離如表3所示。結(jié)果顯示種間遺傳距離變化范圍為0.3%~9.2%。其中,中藥天南星的正品來源天南星(A.erubescens)、異葉天南星(A.heterophyllum)、東北天南星(A.amurense)種間遺傳距離相對(duì)較小,顯示其親緣關(guān)系較近;天南星屬與菖蒲屬種間遺傳距離最大,顯示其二者親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

    2.3 基于rbcL序列的天南星及其混偽品變異位點(diǎn)分析

    結(jié)合測序結(jié)果,運(yùn)用DNAMAN分析軟件對(duì)GenBank下載序列與樣品序列的rbcL序列變異位點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)分析,結(jié)果顯示,除天南星(A.erubescens)種內(nèi)存在1處變異位點(diǎn)外,其余種內(nèi)均無變異位點(diǎn),說明rbcL序列在同種內(nèi)具有較高的保守性?;趓bcL序列的種間變異位點(diǎn)如表4所示,結(jié)果顯示一共存在56處變異位點(diǎn),其中菖蒲屬(Acoruscalamus)變異位點(diǎn)最多,其次為千年健屬千年健(Homalomenaocculta),顯示其親緣關(guān)系較遠(yuǎn),而天南星屬與半夏屬變異位點(diǎn)較少,顯示其親緣關(guān)系較近。

    表3 8種天南星科樣本種間遺傳距離

    注: 編號(hào)1為天南星,編號(hào)2為異葉天南星,編號(hào)3為東北天南星,編號(hào)4為東臺(tái)南星,編號(hào)5為菖蒲,編號(hào)6為虎掌南星,編號(hào)7為三裂葉半夏,編號(hào)8為千年健。

    2.4 基于rbcL序列的天南星及其混偽品N-J系統(tǒng)聚類樹構(gòu)建

    測序結(jié)果經(jīng)過軟件處理后,使用MEGA 5.0軟件基于rbcL序列對(duì)天南星及其混偽品進(jìn)行系統(tǒng)聚類樹的構(gòu)建,結(jié)果如圖1所示,在天南星N-J系統(tǒng)聚類樹中發(fā)現(xiàn),同種不同樣本嚴(yán)格聚為一支,且節(jié)點(diǎn)處支持率極高,證明天南星rbcL序列在種內(nèi)具有高度保守性。且天南星正品來源天南星(A.erubescens)、異葉天南星(A.heterophyllum)、東北天南星(A.amurense)親緣關(guān)系較近,與其他市場常見混偽品嚴(yán)格區(qū)別。顯示rbcL序列對(duì)正品天南星及其市場常見混偽品具有很好的鑒別能力。

    3 討論

    天南星科藥材種類繁多,植物分布廣泛[18-19],植株及塊莖形態(tài)多有相似,難以辨別[20],藥材性狀易混淆,故而導(dǎo)致市場上用藥比較混亂。且天南星科中藥多有毒[21],毒性各有不同,因而品種不清導(dǎo)致的混用極可能造成用藥安全隱患。本實(shí)驗(yàn)采集市場天南星正品及其混偽品,旨在將其明確區(qū)分。

    目前關(guān)于中藥材鑒定的方法多種多樣,但傳統(tǒng)性狀鑒別方法具有一定的局限性,遠(yuǎn)紅外、指紋圖譜等方法操作復(fù)雜。而近些年來發(fā)展較快的DNA分子鑒定技術(shù)與傳統(tǒng)鑒定相結(jié)合的方法,可大大提高藥材鑒定的效率。且研究結(jié)果表明,分子鑒定技術(shù)能夠有效解決中藥材的真?zhèn)螁栴},符合中藥材鑒定簡單、精確的特點(diǎn),有明確的判斷標(biāo)準(zhǔn),能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)中藥材及其基原物種的準(zhǔn)確鑒定。目前,已有多種基因片段被作為植物的通用條形碼而廣泛使用,如ITS 2、psbA-trnH、matK、rbcL等[22]。生命條形碼聯(lián)盟植物工作組推薦將編碼rbcL和成熟酶K(Maturase K,matK)的基因作為陸生植物的DNA條形碼序列[23]。Newmaster 等發(fā)現(xiàn)rbcL能夠鑒別同屬85%左右的物種,認(rèn)為rbcL在植物類群中可作為DNA條形碼候選序列,具有較好的鑒定效率[24]。

    表4 8種天南星科樣本變異位點(diǎn)分析

    注: 編號(hào)1為天南星,編號(hào)2為異葉天南星,編號(hào)3為東北天南星,編號(hào)4為東臺(tái)南星,編號(hào)5為菖蒲,編號(hào)6為虎掌南星,編號(hào)7為三裂葉半夏,編號(hào)8為千年健。

    注:編號(hào)1~3為天南星,編號(hào)4~6為異葉天南星,編號(hào)7~9為東北天南星,編號(hào)10~12為東臺(tái)南星,編號(hào)13~14為菖蒲,編號(hào)15~17為虎掌南星,編號(hào)18為三裂葉半夏,編號(hào)19~20為千年健。圖1 天南星及其市場常見

    混偽品rbcL N-J樹(Bootstrap>1000)

    目前,關(guān)于中藥天南星的DNA分子鑒定已有報(bào)道,劉利平等[25]考察了4個(gè)DNA條形碼(psbK-psbI,matK,rbcL,atpF-atpH)對(duì)天南星及其易混品的鑒定能力,結(jié)果表明atpF-atpH序列和psbK-psbI序列較為適用,rbcL的鑒定成功率僅為41.67%。

    本實(shí)驗(yàn)中選擇了較為常用的3種DNA條形碼進(jìn)行擴(kuò)增比較,包括ITS、psbA-trnH和rbcL。由于收集的樣品來自市場,樣品表面難免存在真菌污染的情況,實(shí)驗(yàn)過程中在采取ITS通用序列擴(kuò)增測序時(shí)發(fā)現(xiàn)因真菌污染導(dǎo)致擴(kuò)增成功率不高,峰圖雜亂,甚至測出真菌序列,鑒定效率較低。在對(duì)rbcL序列與psbA-trnH序列使用通用引物對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)發(fā)現(xiàn),psbA-trnH引物對(duì)序列進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)出現(xiàn)擴(kuò)增失敗率較高的情況,故而本實(shí)驗(yàn)主要采用葉綠體rbcL序列對(duì)天南星及其市場常見混偽品進(jìn)行鑒別研究。實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)rbcL序列具有易擴(kuò)增、通用性好、Blast比對(duì)簡單的特點(diǎn),且其鑒別效率高,可完全將天南星正品與其常見混偽品分開。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明rbcL不僅可將天南星及其混偽品準(zhǔn)確區(qū)分,且在實(shí)驗(yàn)條件下擴(kuò)增成功率92.31%,測序成功率100%,鑒定成功率100%,效果均高于前人研究(擴(kuò)增成功率88.16%,測序成功率96.88%,鑒定成功率41.67%)。通過對(duì)比前人實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)前人實(shí)驗(yàn)材料大多為天南星屬植物,而本實(shí)驗(yàn)主要涉及多個(gè)屬種之間樣品的鑒別,故而推測rbcL序列對(duì)于鑒別同屬不同種物種效率較低,對(duì)于不同屬種之間的鑒別則表現(xiàn)出較高的鑒別效率。另外,前人所用實(shí)驗(yàn)材料為植物葉片,實(shí)驗(yàn)材料所選用的植株部位不同,鑒定效率可能也有所不同。

    葉綠體基因組序列具有一定的保守性,且擴(kuò)增葉綠體片段的引物是通用的,便于實(shí)驗(yàn)操作,采用葉綠體片段序列進(jìn)行植物物種鑒定可避免污染(如真菌),大大提高鑒定效率,在植物物種的分子鑒定方面具有較好的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    天南星偽品種間
    干旱條件對(duì)鬼針草和醉魚草種間相互作用及生長的影響
    植物研究(2023年5期)2023-09-09 08:01:22
    天南星的臨床應(yīng)用及其用量探究
    三峽庫區(qū)支流花溪河浮游植物種間關(guān)聯(lián)及影響因子分析
    天南星和虎掌的本草考證
    冬沖夏草與摻偽品的鑒別研究
    中草藥天南星的研究進(jìn)展
    A Network Pharmacology Analysis of Cang Fu Dao Tan Formula for the Treatment of Obese Polycystic Ovary Syndrome
    近紅外光譜技術(shù)鑒別白及粉及其混偽品
    電子舌技術(shù)鑒別川貝母粉及其摻偽品
    中成藥(2017年9期)2017-12-19 13:34:58
    應(yīng)用rbcL條形碼鑒別高良姜及其偽品大高良姜
    婷婷色麻豆天堂久久| 欧美性长视频在线观看| 视频区欧美日本亚洲| h视频一区二区三区| 国产精品一区二区精品视频观看| 高清av免费在线| 久久精品亚洲av国产电影网| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 成人国语在线视频| 亚洲国产欧美一区二区综合| www.999成人在线观看| 少妇 在线观看| 一级毛片电影观看| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费看十八禁软件| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 9191精品国产免费久久| 黄色毛片三级朝国网站| 色视频在线一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 欧美黑人欧美精品刺激| 一区二区三区乱码不卡18| www.精华液| 一级毛片我不卡| 国产视频首页在线观看| 国产97色在线日韩免费| 国产精品成人在线| av网站免费在线观看视频| 亚洲国产看品久久| 久热爱精品视频在线9| 日日摸夜夜添夜夜爱| 黄片播放在线免费| 美女扒开内裤让男人捅视频| 久久九九热精品免费| 考比视频在线观看| 午夜视频精品福利| 一级a爱视频在线免费观看| 青春草亚洲视频在线观看| 最新的欧美精品一区二区| 赤兔流量卡办理| av在线app专区| 999久久久国产精品视频| 999精品在线视频| 无限看片的www在线观看| 黄色毛片三级朝国网站| 亚洲欧洲日产国产| 中文字幕人妻熟女乱码| 一级,二级,三级黄色视频| 免费高清在线观看日韩| 国产一区有黄有色的免费视频| 99久久人妻综合| 欧美成人精品欧美一级黄| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产高清不卡午夜福利| 国产日韩欧美亚洲二区| 国产精品久久久久成人av| 精品一区二区三区av网在线观看 | videosex国产| 日韩精品免费视频一区二区三区| 免费看av在线观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 蜜桃在线观看..| 妹子高潮喷水视频| 视频区图区小说| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 久久久久精品人妻al黑| 在线观看免费视频网站a站| 国产成人免费无遮挡视频| 日本av免费视频播放| 精品少妇黑人巨大在线播放| 午夜影院在线不卡| 亚洲精品在线美女| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 搡老乐熟女国产| 首页视频小说图片口味搜索 | 成年女人毛片免费观看观看9 | 国产xxxxx性猛交| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 亚洲成人免费av在线播放| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲色图综合在线观看| 最黄视频免费看| 欧美日韩综合久久久久久| 黑丝袜美女国产一区| 亚洲视频免费观看视频| 午夜免费观看性视频| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 国产精品99久久99久久久不卡| 亚洲色图综合在线观看| svipshipincom国产片| 香蕉国产在线看| 免费观看av网站的网址| 一二三四社区在线视频社区8| 午夜影院在线不卡| 十八禁高潮呻吟视频| 水蜜桃什么品种好| 大陆偷拍与自拍| 水蜜桃什么品种好| 免费在线观看日本一区| 欧美精品av麻豆av| 又大又爽又粗| 精品一区二区三卡| 久久久久网色| 成人国语在线视频| 99热网站在线观看| 91成人精品电影| 精品卡一卡二卡四卡免费| 在线观看人妻少妇| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 精品久久久久久电影网| 欧美xxⅹ黑人| 高清视频免费观看一区二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| av不卡在线播放| 久久久久精品国产欧美久久久 | av天堂久久9| 国产成人91sexporn| 老鸭窝网址在线观看| videosex国产| 久久亚洲国产成人精品v| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 老司机在亚洲福利影院| 国精品久久久久久国模美| 婷婷丁香在线五月| 这个男人来自地球电影免费观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久国产精品男人的天堂亚洲| 亚洲中文字幕日韩| 99九九在线精品视频| 国产精品三级大全| 国产色视频综合| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 亚洲成人免费电影在线观看 | 日本欧美视频一区| 国产视频一区二区在线看| 精品少妇内射三级| 黑人猛操日本美女一级片| e午夜精品久久久久久久| 国产精品偷伦视频观看了| 人体艺术视频欧美日本| 蜜桃在线观看..| videos熟女内射| 啦啦啦啦在线视频资源| 一本综合久久免费| 午夜免费鲁丝| 国产男人的电影天堂91| 欧美日韩福利视频一区二区| 久久精品国产亚洲av高清一级| 久久精品国产亚洲av涩爱| 精品国产一区二区三区四区第35| 国产片特级美女逼逼视频| 国产免费视频播放在线视频| 中文字幕最新亚洲高清| 国产精品亚洲av一区麻豆| 美女主播在线视频| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲综合色网址| 亚洲国产av新网站| 久久性视频一级片| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产精品999| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲专区中文字幕在线| 国产日韩欧美视频二区| av不卡在线播放| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 两个人看的免费小视频| 午夜日韩欧美国产| 国产1区2区3区精品| 午夜福利视频精品| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 超碰成人久久| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 亚洲欧美精品自产自拍| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 涩涩av久久男人的天堂| 亚洲 国产 在线| 18禁观看日本| 晚上一个人看的免费电影| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 妹子高潮喷水视频| 欧美日韩黄片免| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 老司机亚洲免费影院| 2021少妇久久久久久久久久久| 9热在线视频观看99| 亚洲精品日本国产第一区| 国产精品一二三区在线看| 亚洲精品一区蜜桃| 国产午夜精品一二区理论片| 久久久久精品人妻al黑| 欧美日本中文国产一区发布| www.999成人在线观看| 人妻一区二区av| 十八禁网站网址无遮挡| 国产三级黄色录像| 视频在线观看一区二区三区| 人体艺术视频欧美日本| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲欧美激情在线| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 在线观看免费视频网站a站| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 黄片小视频在线播放| 最新的欧美精品一区二区| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av片天天在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 成人国产一区最新在线观看 | 777米奇影视久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲精品成人av观看孕妇| 在线观看一区二区三区激情| 视频在线观看一区二区三区| 一边亲一边摸免费视频| 精品少妇内射三级| 久热这里只有精品99| 免费高清在线观看日韩| 中文字幕人妻熟女乱码| 99九九在线精品视频| 久热爱精品视频在线9| 尾随美女入室| 国产在线观看jvid| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 免费少妇av软件| 久久久国产一区二区| 中国美女看黄片| 深夜精品福利| 在线观看国产h片| 亚洲成人免费av在线播放| 国产精品 国内视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 黄片播放在线免费| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 九色亚洲精品在线播放| 国产精品三级大全| 电影成人av| 精品国产一区二区三区四区第35| 精品少妇内射三级| 男的添女的下面高潮视频| 国产精品一区二区精品视频观看| 久久免费观看电影| 久久av网站| 好男人电影高清在线观看| 久久热在线av| 久久这里只有精品19| 91精品三级在线观看| 亚洲国产精品国产精品| 99久久综合免费| 只有这里有精品99| 一级黄色大片毛片| 少妇人妻久久综合中文| 99国产精品免费福利视频| 欧美精品亚洲一区二区| 日本vs欧美在线观看视频| 最近中文字幕2019免费版| 在线观看www视频免费| 久久精品亚洲熟妇少妇任你| 亚洲国产日韩一区二区| 精品国产乱码久久久久久男人| 多毛熟女@视频| a 毛片基地| 啦啦啦 在线观看视频| 69精品国产乱码久久久| av片东京热男人的天堂| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 女人精品久久久久毛片| 99久久综合免费| 日韩电影二区| 一区二区av电影网| 99国产精品一区二区三区| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲av日韩在线播放| 国产淫语在线视频| 国产精品国产三级专区第一集| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 99热国产这里只有精品6| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲中文字幕日韩| 国产国语露脸激情在线看| 在线观看一区二区三区激情| 无限看片的www在线观看| 亚洲伊人久久精品综合| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 视频区图区小说| bbb黄色大片| 只有这里有精品99| 国产男女超爽视频在线观看| 香蕉丝袜av| av天堂在线播放| 亚洲av男天堂| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 国精品久久久久久国模美| 黑丝袜美女国产一区| av天堂在线播放| 少妇 在线观看| 欧美国产精品va在线观看不卡| 狂野欧美激情性xxxx| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 国产视频首页在线观看| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产深夜福利视频在线观看| 午夜福利视频精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 国产真人三级小视频在线观看| 满18在线观看网站| 欧美黄色淫秽网站| 色婷婷久久久亚洲欧美| 亚洲成色77777| 麻豆国产av国片精品| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲伊人色综图| 日韩av不卡免费在线播放| 亚洲欧美一区二区三区久久| 国产主播在线观看一区二区 | 欧美人与性动交α欧美软件| 久久精品国产亚洲av涩爱| 在线观看免费午夜福利视频| 国产精品99久久99久久久不卡| 18禁国产床啪视频网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产黄色视频一区二区在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 色网站视频免费| 国产男人的电影天堂91| 久久人人97超碰香蕉20202| 久热这里只有精品99| 成年av动漫网址| 亚洲,一卡二卡三卡| 大香蕉久久网| 爱豆传媒免费全集在线观看| 亚洲国产看品久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 中国美女看黄片| 老汉色∧v一级毛片| 电影成人av| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 久久精品国产a三级三级三级| 91国产中文字幕| 国产亚洲一区二区精品| a级毛片在线看网站| 国产精品熟女久久久久浪| 母亲3免费完整高清在线观看| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 爱豆传媒免费全集在线观看| 99久久综合免费| 一级黄片播放器| 热99久久久久精品小说推荐| 黄片小视频在线播放| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产片特级美女逼逼视频| 一区福利在线观看| 多毛熟女@视频| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 嫁个100分男人电影在线观看 | 97人妻天天添夜夜摸| 国产激情久久老熟女| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕高清在线视频| 日韩一区二区三区影片| 免费黄频网站在线观看国产| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产精品亚洲av一区麻豆| 色视频在线一区二区三区| 高清欧美精品videossex| 少妇粗大呻吟视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 又紧又爽又黄一区二区| 十八禁网站网址无遮挡| 欧美精品一区二区免费开放| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 熟女av电影| 欧美精品一区二区大全| 欧美黄色淫秽网站| 赤兔流量卡办理| 日韩av不卡免费在线播放| 日韩av免费高清视频| 亚洲精品第二区| 国产成人精品在线电影| 国产亚洲欧美精品永久| 少妇粗大呻吟视频| 大型av网站在线播放| 亚洲国产欧美一区二区综合| 人人澡人人妻人| 宅男免费午夜| 久久久国产一区二区| 久久综合国产亚洲精品| 欧美日韩亚洲高清精品| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 又黄又粗又硬又大视频| 大话2 男鬼变身卡| 午夜福利在线免费观看网站| 日日摸夜夜添夜夜爱| 麻豆乱淫一区二区| 精品一区二区三区av网在线观看 | 欧美精品一区二区免费开放| 蜜桃在线观看..| 99re6热这里在线精品视频| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 午夜福利乱码中文字幕| 成人免费观看视频高清| 欧美精品一区二区免费开放| 我的亚洲天堂| 亚洲精品在线美女| 男女床上黄色一级片免费看| 日本av免费视频播放| 人人澡人人妻人| 久久久精品区二区三区| 亚洲人成网站在线观看播放| 日韩人妻精品一区2区三区| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 婷婷色综合www| 十八禁高潮呻吟视频| 人体艺术视频欧美日本| 人体艺术视频欧美日本| 少妇人妻 视频| 亚洲成人手机| 精品亚洲成a人片在线观看| 在线观看人妻少妇| 黄色一级大片看看| a级毛片在线看网站| 国产精品亚洲av一区麻豆| 一本久久精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 亚洲成人手机| 一个人免费看片子| 大型av网站在线播放| 男女高潮啪啪啪动态图| 亚洲av综合色区一区| 亚洲久久久国产精品| 精品国产乱码久久久久久小说| 真人做人爱边吃奶动态| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 美女大奶头黄色视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| av电影中文网址| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产片内射在线| 午夜精品国产一区二区电影| 亚洲一码二码三码区别大吗| 成人影院久久| 丝瓜视频免费看黄片| 久久久久久久久久久久大奶| 一级毛片女人18水好多 | 麻豆国产av国片精品| 不卡av一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 亚洲成国产人片在线观看| 国产精品一二三区在线看| 国产精品一区二区在线观看99| 色综合欧美亚洲国产小说| 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品国产av在线观看| 国产极品粉嫩免费观看在线| 高清欧美精品videossex| 久久av网站| 性少妇av在线| 亚洲成人免费电影在线观看 | 日韩制服骚丝袜av| 欧美日韩av久久| av有码第一页| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 久热爱精品视频在线9| 久久久精品区二区三区| 久久久国产精品麻豆| 国产亚洲欧美精品永久| 国产一级毛片在线| 精品免费久久久久久久清纯 | 午夜激情久久久久久久| 飞空精品影院首页| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 久久ye,这里只有精品| 亚洲精品av麻豆狂野| 丝袜在线中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| 激情五月婷婷亚洲| av电影中文网址| 婷婷色综合www| 美女福利国产在线| 高清欧美精品videossex| 欧美人与性动交α欧美软件| 十八禁高潮呻吟视频| 免费人妻精品一区二区三区视频| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品少妇内射三级| 精品一品国产午夜福利视频| 麻豆国产av国片精品| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 大片免费播放器 马上看| 免费看不卡的av| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲成人免费电影在线观看 | 国产高清国产精品国产三级| 国产一级毛片在线| 交换朋友夫妻互换小说| 日日爽夜夜爽网站| 成人午夜精彩视频在线观看| 亚洲人成电影免费在线| 女性被躁到高潮视频| 国产精品.久久久| 精品久久蜜臀av无| 女性被躁到高潮视频| 看免费成人av毛片| 欧美少妇被猛烈插入视频| 新久久久久国产一级毛片| 精品熟女少妇八av免费久了| 一级黄片播放器| 国产熟女欧美一区二区| 一区福利在线观看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产精品欧美亚洲77777| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 久久99精品国语久久久| 热99国产精品久久久久久7| 女性生殖器流出的白浆| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 日韩电影二区| 久久精品久久久久久噜噜老黄| a 毛片基地| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产精品欧美亚洲77777| 精品国产一区二区三区四区第35| 亚洲av男天堂| 国产成人欧美| 中文欧美无线码| 9热在线视频观看99| 国产伦人伦偷精品视频| 大片免费播放器 马上看| 99re6热这里在线精品视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 成年动漫av网址| 黄色片一级片一级黄色片| 国产一级毛片在线| 91国产中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 在线观看免费日韩欧美大片| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 免费观看av网站的网址| 99久久综合免费| 十八禁网站网址无遮挡| av天堂久久9| 欧美97在线视频| 丝袜在线中文字幕| 久久九九热精品免费| 亚洲欧美一区二区三区国产| 国产有黄有色有爽视频| 久久 成人 亚洲| 91精品三级在线观看| 精品第一国产精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 99热网站在线观看| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成年人黄色毛片网站| 久热爱精品视频在线9| 久久免费观看电影| 97人妻天天添夜夜摸| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 性色av乱码一区二区三区2| 美国免费a级毛片| 国产免费现黄频在线看| 精品少妇久久久久久888优播| 国产伦理片在线播放av一区| 国产高清国产精品国产三级| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 两人在一起打扑克的视频| 亚洲伊人色综图| av片东京热男人的天堂| 亚洲国产精品国产精品| 日本av免费视频播放| 在线观看www视频免费| 中文欧美无线码| 婷婷成人精品国产| 18在线观看网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡 | 精品人妻1区二区| 操美女的视频在线观看| 一个人免费看片子| 中文字幕色久视频| 国产淫语在线视频| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 国产一区有黄有色的免费视频| 精品欧美一区二区三区在线| 午夜福利乱码中文字幕| 国产精品一区二区在线不卡| 久久天堂一区二区三区四区| 在线观看国产h片| 亚洲,欧美精品.| 国产99久久九九免费精品| 捣出白浆h1v1| 99久久99久久久精品蜜桃|