奈諾沙星對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌體外抗菌活性的研究

董 穎，陳瑩瑩，魏彤竹，陳 愉*

0 引言

軍團(tuán)菌(Legionella)是引起流行性、散發(fā)性社區(qū)獲得性肺炎和醫(yī)院內(nèi)獲得性肺炎的重要致病菌[1],軍團(tuán)菌感染后引發(fā)的疾病稱軍團(tuán)菌病(Legionnaires′ disease,LD)，臨床癥狀可輕可重，其中最多見(jiàn)且最嚴(yán)重的臨床類型為軍團(tuán)菌肺炎，并且常伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、肝臟、胃腸道和腎臟等肺外并發(fā)癥的存在[2-4]。該病病情進(jìn)展快，且病死率高[5-6]，其中嗜肺軍團(tuán)菌(Legionellapneumophila,LP)的1型為主要致病菌，但其他菌型也可致病[7-8]。軍團(tuán)菌在自然水環(huán)境中普遍存在，并且經(jīng)常污染人工水系統(tǒng)[9-11]，目前，對(duì)環(huán)境分離的軍團(tuán)菌菌株和臨床分離的軍團(tuán)菌菌株藥物敏感性的比較鮮有報(bào)道。軍團(tuán)菌治療可選擇的藥物有限，有些病例雖然應(yīng)用了抗軍團(tuán)菌的治療，仍然不能逆轉(zhuǎn)其病程。研發(fā)新型抗軍團(tuán)菌藥物并對(duì)其進(jìn)行深入研究將對(duì)提高軍團(tuán)菌的治愈率起到有益的作用。奈諾沙星是一種新型無(wú)氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，其對(duì)軍團(tuán)菌的藥物敏感性尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討了奈諾沙星對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的體外抗菌活性，為臨床治療軍團(tuán)菌的藥物選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 沈陽(yáng)2012-2017年環(huán)境水中分離出的嗜肺軍團(tuán)菌菌株36株，從中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院、中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、沈陽(yáng)市第四人民醫(yī)院患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)的嗜肺軍團(tuán)菌菌株4株，共40株嗜肺軍團(tuán)菌菌株。其中經(jīng)鑒定LP 1型 27株，LP 2型4株，LP 3型4株，LP 7型2株，LP 4型、6型、10型各1株。

1.2 儀器與試劑 奈諾沙星(批號(hào)：205MP161101，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；阿奇霉素(批號(hào)：130352-201007，中國(guó)藥品生物制品檢定所)；左氧氟沙星(批號(hào)：130455-201106 中國(guó)藥品生物制品檢定所)；軍團(tuán)菌瓊脂基礎(chǔ)干粉(英國(guó)OXOID公司)；BCYE添加劑(英國(guó)OXOID公司)；無(wú)菌緩沖酵母提取物肉湯(Buffered yeast extract broth,BYEB)；緩沖活性炭酵母浸液瓊脂(Buffered charcoal yeast extract,BCYE)；比濁儀(Micro Scan Turbidity Meter，SIEMENS)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo Scientific)。

1.3 方法 細(xì)胞外藥敏試驗(yàn)采用的是微量肉湯稀釋法[12]，藥敏試驗(yàn)參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)制定的標(biāo)準(zhǔn)，將嗜肺軍團(tuán)菌菌株恢復(fù)室溫后，在BCYE培養(yǎng)基培養(yǎng)并傳代2次，制備肉湯后用肉湯增菌2代，調(diào)整菌懸液濃度至濁度為0.5麥?zhǔn)蠞舛?，之后稀釋?～8×105CFU/ml備用。實(shí)驗(yàn)藥物溶解后配制成終濃度為512 mg/L，二倍稀釋至0.002 mg/L。用96孔U型板，每孔加入50 μl藥物，再加入50 μl菌懸液，留有空白對(duì)照孔。將96孔U型板置37 ℃、2.5%CO2的濕潤(rùn)恒溫箱中孵育72小時(shí)觀察結(jié)果，記錄最低抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)和最低殺菌濃度(Minimum bactericidal concentration,MBC)。統(tǒng)計(jì)MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值。質(zhì)控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度MIC 3種藥物對(duì)40株嗜肺軍團(tuán)菌的MIC結(jié)果見(jiàn)表1。奈諾沙星的MIC90值最小，其次為左氧氟沙星；阿奇霉素的MIC50和MIC90值均為最大。由結(jié)果可見(jiàn)3種藥物對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌均有較好的抗菌活性，喹諾酮類藥物敏感性強(qiáng)于大環(huán)內(nèi)酯類藥物。

2.2 最低殺菌濃度MBC 3種藥物對(duì)40株嗜肺軍團(tuán)菌的MBC結(jié)果見(jiàn)表2。奈諾沙星的MBC90值最小，左氧氟沙星MBC90值稍大，阿奇霉素MBC50和MBC90值均最大。結(jié)果提示，喹諾酮類藥物對(duì)軍團(tuán)菌具有良好的殺菌作用，阿奇霉素殺菌作用較弱，MBC分布范圍較大。

表1 3種藥物對(duì)40株嗜肺軍團(tuán)菌的MIC(mg/L)

表2 3種藥物對(duì)40株嗜肺軍團(tuán)菌的MBC(mg/L)

2.3 按菌株來(lái)源分類的MIC值比較 不同來(lái)源菌株的MIC值見(jiàn)表3。由結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)于環(huán)境分離株而言，奈諾沙星抗菌作用最強(qiáng)，而對(duì)于臨床株而言，左氧氟沙星抗菌作用最強(qiáng)。奈諾沙星對(duì)2種不同來(lái)源的菌株MIC值沒(méi)有差異，都有較好的抗菌活性，而左氧氟沙星MIC90值在環(huán)境分離菌株組稍高。阿奇霉素對(duì)2種不同來(lái)源的菌株MIC50和MIC90值均高于其他2種藥物，對(duì)環(huán)境分離株的抗菌活性最差。

表3 不同來(lái)源菌株的MIC值比較(mg/L)

2.4 按菌株來(lái)源分類的MBC值比較 奈諾沙星和左氧氟沙星對(duì)于不同來(lái)源的菌株均有較好的殺菌作用，兩者均強(qiáng)于阿奇霉素。對(duì)于環(huán)境分離菌株而言，奈諾沙星殺菌作用最強(qiáng)；對(duì)于臨床株而言，左氧氟沙星殺菌作用最強(qiáng)。左氧氟沙星和阿奇霉素兩種藥物對(duì)臨床菌株殺菌效果強(qiáng)于環(huán)境分離菌株。見(jiàn)表4。

表4 不同來(lái)源菌株的MBC值比較

2.5 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MIC(mg/L)值的比較 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MIC值見(jiàn)表5。結(jié)果顯示，奈諾沙星和左氧氟沙星對(duì)LP1型和非LP1型軍團(tuán)菌的藥物敏感性基本一致，而阿奇霉素對(duì)兩組的敏感性稍有不同，就MIC50而言，阿奇霉素對(duì)LP1型的抗菌活性弱于非LP1型。

表5 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MIC值比較

2.6 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MBC(mg/L)值比較 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MBC值見(jiàn)表6，結(jié)果顯示，奈諾沙星和阿奇霉素對(duì)LP1型的殺菌作用弱于非LP1型，以阿奇霉素尤為明顯，而左氧氟沙星的MBC90在LP1型稍低于非LP1型，提示對(duì)非LP1型殺菌活性較LP1型稍強(qiáng)，且其MBC范圍的數(shù)值較小。

表6 LP1型和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌的MBC值比較

3 討論

自1977年美國(guó)疾病控制中心(CDC)首次描述軍團(tuán)病以來(lái)[13]，其發(fā)病率逐年增高，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者們的普遍關(guān)注。軍團(tuán)菌屬于革蘭陰性菌，包括59個(gè)種和3個(gè)亞種，嗜肺軍團(tuán)菌是最常見(jiàn)的種[14]。迄今已知約30種軍團(tuán)菌可引起人類感染，其中已確認(rèn)嗜肺軍團(tuán)菌種的16個(gè)血清型均可引起感染[15]，多為下呼吸道感染。軍團(tuán)菌可以在阿米巴原蟲(chóng)、人巨噬細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)寄生及繁殖?？咕幬镄枰┩讣?xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)才能更有效地殺滅軍團(tuán)菌。目前，細(xì)胞穿透性強(qiáng)的脂溶性藥物(如喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)脂類藥物)是抗軍團(tuán)菌的主要選擇用藥，然而，有研究發(fā)現(xiàn)軍團(tuán)菌已出現(xiàn)了對(duì)2類藥物耐藥。有學(xué)者對(duì)149株LP1型嗜肺軍團(tuán)菌藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紅霉素、左氧氟沙星、莫西沙星、利福平對(duì)軍團(tuán)菌均敏感，其中25株對(duì)阿奇霉素耐藥，并且提示阿奇霉素敏感性的降低與其LpeAB基因的表達(dá)有關(guān)[16]。在2019年的研究中發(fā)現(xiàn)，122株嗜肺軍團(tuán)菌菌株中發(fā)現(xiàn)1例臨床LP1型對(duì)阿奇霉素(MIC 0.5～1 mg/L)敏感性降低，并含有外排泵成分LpeAB[17]。本研究對(duì)40株軍團(tuán)菌的藥敏實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MIC>1 mg/L的菌株有10株，均來(lái)自環(huán)境，其中LP 1型7株，LP 2型、LP 3型、LP 4型各1株，同樣提示阿奇霉素的敏感性下降，具體耐藥機(jī)制有待于深入研究。

關(guān)于軍團(tuán)菌對(duì)氟喹諾酮類藥物的耐藥，2012年曾有1篇個(gè)案報(bào)道。1名重癥肺炎患者入院后應(yīng)用頭孢唑林和慶大霉素抗感染治療，在查出軍團(tuán)菌尿抗原陽(yáng)性后改用環(huán)丙沙星400 mg，每天2次，在環(huán)丙沙星抗感染治療4 d后支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)出LP1型軍團(tuán)菌。藥敏試驗(yàn)顯示，環(huán)丙沙星對(duì)該菌株的MIC值為2 mg/L，超出了抗菌藥物的流行病學(xué)界值(ECOFF)1 mg/L[18]。后續(xù)基因檢測(cè)顯示，菌株DNA旋轉(zhuǎn)酶的gyrA基因QRDR產(chǎn)生了點(diǎn)突變，導(dǎo)致了83位氨基酸的異位[19]。gyrA是氟喹諾酮類藥物對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的作用靶點(diǎn)，其突變會(huì)降低DNA旋轉(zhuǎn)酶對(duì)氟喹諾酮類藥物的敏感性[20]，進(jìn)而產(chǎn)生耐藥。另一項(xiàng)研究同樣發(fā)現(xiàn)在82名軍團(tuán)菌肺炎患者分離的軍團(tuán)菌菌株中檢測(cè)到2株gyrA83突變[21]，QRDR信號(hào)中的gyrA83突變與氟喹諾酮類藥物對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的MIC值增加有關(guān)。本研究的40株軍團(tuán)菌中，奈諾沙星和左氧氟沙星的MIC最大值均為0.5 mg/L，提示尚未出現(xiàn)菌株的耐藥基因突變。

以上研究說(shuō)明雖然氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)軍團(tuán)菌有很高的活性，但已出現(xiàn)了耐氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)酯類藥物的軍團(tuán)菌菌株。因此，在臨床應(yīng)用氟喹諾酮及大環(huán)內(nèi)酯類藥物進(jìn)行抗軍團(tuán)菌治療時(shí)，若臨床療效欠佳，應(yīng)考慮其可能的耐藥性，并且不斷探索新藥對(duì)軍團(tuán)菌的作用，以增加抗軍團(tuán)菌的藥物選擇。

奈諾沙星是TaiGen生物公司開(kāi)發(fā)的一種新型的非氟喹諾酮類抗菌藥物，化學(xué)式是C20H25N3O4·C4H6O5·1/2 H2O，現(xiàn)應(yīng)用于臨床的藥物為蘋果酸奈諾沙星。奈諾沙星與其他氟喹諾酮類藥物不同之處在于其C-6位缺少氟原子，這一改變使DNA旋轉(zhuǎn)酶抑制作用增強(qiáng)了10倍以上，對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等30種細(xì)菌的MIC降低至原來(lái)的1/100[22]。其生物利用度約為95%，與左氧氟沙星和莫西沙星相似[23-24]。國(guó)內(nèi)完成的奈諾沙星的Ⅰ～Ⅲ期臨床試驗(yàn)表明，該藥物口服后在健康受試者體內(nèi)吸收迅速，半衰期長(zhǎng)，約為11 h。大約70%的給藥藥物是由腎臟排泄的，耐受性良好[25]。第Ⅱ期及第Ⅲ期臨床研究也顯示，口服奈諾沙星(500 mg/d，連用7～10 d)與口服左氧氟沙星(500 mg/d)治療輕至中度CAP的臨床及微生物學(xué)療效相同[26-27]。奈諾沙星對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌和革蘭陰性桿菌都具有較強(qiáng)的廣譜抗菌活性，與同類的氟喹諾酮類抗菌藥物相比，奈諾沙星對(duì)于革蘭陽(yáng)性球菌具有更高的抗菌活性[27]。對(duì)于非典型病原體，研究發(fā)現(xiàn)奈諾沙星對(duì)147株支原體臨床分離株的活性均與左氧氟沙星、環(huán)丙沙星相似[28]。軍團(tuán)菌與支原體、衣原體同為非典型病原體，目前臨床研究發(fā)現(xiàn)，奈諾沙星對(duì)軍團(tuán)菌具有很好的臨床療效，但奈諾沙星對(duì)軍團(tuán)菌的藥敏情況及抗菌活性尚未見(jiàn)報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)研究了新型無(wú)氟喹諾酮類藥物奈諾沙星對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌的體外藥物敏感性，并與新大環(huán)內(nèi)酯類藥物阿奇霉素及氟喹諾酮類藥物左氧氟沙星進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)奈諾沙星對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌具有良好的體外抗菌活性，喹諾酮類藥物敏感性強(qiáng)于大環(huán)內(nèi)酯類藥物。在日本學(xué)者的1項(xiàng)58株臨床軍團(tuán)菌菌株的體外藥敏結(jié)果可見(jiàn)，左氧氟沙星的MIC值范圍為0.004～0.03 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，阿奇霉素的MIC值范圍為0.001～0.12 mg/L，MIC90值為0.06 mg/L[29]，提示喹諾酮類藥物對(duì)于軍團(tuán)菌的敏感性強(qiáng)于大環(huán)內(nèi)酯類。此外，意大利學(xué)者做了1項(xiàng)100株環(huán)境中軍團(tuán)菌菌株的藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，左氧氟沙星的MIC90為0.094 mg/L，阿奇霉素的MIC90為0.25 mg/L，由此可見(jiàn)，左氧氟沙星對(duì)意大利環(huán)境中提取的軍團(tuán)菌的抗菌作用優(yōu)于阿奇霉素[30]。廣州的1項(xiàng)60株環(huán)境提取的軍團(tuán)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，左氧氟沙星MIC90為0.031 mg/L，阿奇霉素MIC90為0.5 mg/L，同樣說(shuō)明左氧氟沙星對(duì)環(huán)境軍團(tuán)菌的效果優(yōu)于阿奇霉素[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示奈諾沙星、左氧氟沙星、阿奇霉素分別為0.031～0.5、0.004～0.5、0.062～4 mg/L，MIC50分別為0.062、0.031、1 mg/L；MIC90分別為0.125、0.5、4 mg/L，MBC分別為0.062～1、0.008～2、0.125～8 mg/L，MBC50分別為0.125、0.125、2 mg/L，MBC90分別為0.5、1、8 mg/L，提示奈諾沙星和左氧氟沙星對(duì)軍團(tuán)菌的敏感性均明顯強(qiáng)于阿奇霉素，在細(xì)胞外具有良好的抑菌和殺菌作用，且奈諾沙星的作用優(yōu)于左氧氟沙星。將本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其他幾項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比發(fā)現(xiàn)，本地區(qū)嗜肺軍團(tuán)菌的敏感性較其他地區(qū)差，尤其阿奇霉素耐藥性增高，提示可能出現(xiàn)耐藥基因突變，同時(shí)提示不同區(qū)域軍團(tuán)菌菌株存在敏感性的差異，不同區(qū)域菌株敏感性的數(shù)據(jù)對(duì)指導(dǎo)當(dāng)?shù)嘏R床治療更有實(shí)際意義，在臨床用藥過(guò)程中應(yīng)予以重視。

對(duì)于不同來(lái)源的嗜肺軍團(tuán)菌菌株藥物敏感性的對(duì)比研究，在國(guó)內(nèi)外尚未查到相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩組略有差別。本研究通過(guò)對(duì)比環(huán)境及臨床軍團(tuán)菌菌株的MIC50、MIC90、MBC50、MBC90值，結(jié)果顯示，奈諾沙星在兩組敏感性方面基本一致，而左氧氟沙星和阿奇霉素對(duì)于臨床軍團(tuán)菌菌株更敏感，而對(duì)環(huán)境分離軍團(tuán)菌菌株的抑菌和殺菌效果較弱，提示環(huán)境中的多種因素均可能誘發(fā)細(xì)菌耐藥性增強(qiáng)。奈諾沙星對(duì)環(huán)境及臨床菌株均敏感，其原因可能是奈諾沙星為一種新藥，人體內(nèi)尚未產(chǎn)生耐藥，而且對(duì)環(huán)境菌株藥物誘導(dǎo)耐藥壓力較小。由于本實(shí)驗(yàn)臨床菌株數(shù)量較少，該結(jié)果也可能與樣本量小有關(guān)，需要大樣本實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。

關(guān)于LP1和非LP1型嗜肺軍團(tuán)菌菌株的對(duì)比，波蘭的1項(xiàng)28株的環(huán)境軍團(tuán)菌藥敏提示，阿奇霉素對(duì)LP1型軍團(tuán)菌(n=16)的MIC90值為0.25 mg/L，對(duì)非LP1型軍團(tuán)菌(n=12)的MIC90值為0.47 mg/L[32]，由此看出，阿奇霉素對(duì)不同分型的軍團(tuán)菌的藥物敏感性是不同的，對(duì)非LP1型菌株敏感性稍差。日本的軍團(tuán)菌藥敏實(shí)驗(yàn)中，左氧氟沙星對(duì)LP1型軍團(tuán)菌(n=46)的MIC范圍為0.004～0.03 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，對(duì)非LP1型軍團(tuán)菌(n=12)的MIC范圍為0.000 8～0.015 mg/L，MIC90值為0.015 mg/L，阿奇霉素對(duì)LP1型軍團(tuán)菌的MIC范圍為0.001～0.012 mg/L，MIC90值為0.006 mg/L，對(duì)非LP1型軍團(tuán)菌的MIC范圍為0.015～0.06 mg/L，MIC90值為0.003 mg/L[29]，可看出對(duì)比不同分類的軍團(tuán)菌，藥物的作用效果不同，提示左氧氟沙星對(duì)兩組敏感性無(wú)差異，而阿奇霉素對(duì)LP1型的軍團(tuán)菌MIC值范圍總體更小，敏感度略高于非LP1型的軍團(tuán)菌。本研究中，奈諾沙星對(duì)于LP1型軍團(tuán)菌和非LP1型軍團(tuán)菌的藥物敏感性基本一致，而左氧氟沙星對(duì)LP1作用稍強(qiáng)，而阿奇霉素對(duì)非LP1型軍團(tuán)菌抗菌活性稍強(qiáng)，與國(guó)外研究結(jié)果有所不同，此差異可能與不同區(qū)域菌株分布不同有關(guān)，另需大樣本菌株進(jìn)行深入研究。

綜上所述，奈諾沙星作為無(wú)氟喹諾酮類新藥，對(duì)嗜肺軍團(tuán)菌顯示了良好的體外抗菌活性，明顯優(yōu)于阿奇霉素，略優(yōu)于左氧氟沙星。該研究為奈諾沙星抗軍團(tuán)菌感染提供了藥物敏感性的理論基礎(chǔ)，對(duì)臨床軍團(tuán)菌治療的藥物選擇具有指導(dǎo)意義。