響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)選山楂最佳蜜制工藝

敖楠楠，才 謙，曲 揚(yáng)，葉斌斌，姜明月，鄭 彧

0 引言

山楂為薔薇科植物山里紅(CrataeguspinnatifidaBge.Var.majorN.E.Br.)或山楂(CrataeguspinnatifidaBge.)的干燥成熟果實(shí),具消食健胃、行氣散瘀、化濁降脂之功效，用于肉食積滯、胃脘脹滿、瀉痢腹痛、淤血經(jīng)閉、產(chǎn)后瘀阻、心腹刺痛、胸痹心痛、疝氣疼痛及高脂血癥[1]。近年來(lái)，有研究表明，山楂對(duì)于心腦血管系統(tǒng)疾病有很好的治療作用[2-4]，已應(yīng)用于冠心病、高血脂的臨床治療[5-7]。中國(guó)藥典收載的飲片有生山楂、炒山楂、焦山楂。由于傳統(tǒng)炮制過(guò)程中的高溫會(huì)使黃酮類(lèi)成分有不同程度的下降，而黃酮類(lèi)成分是降血脂以及治療心血管疾病的主要藥效物質(zhì)，所以導(dǎo)致炮制品在降血脂以及治療心血管系統(tǒng)疾病方面的作用低于生品[8]。臨床上，山楂與蜂蜜聯(lián)用已用于冠心病的預(yù)防和治療[9-10]，可能是由于蜂蜜具有補(bǔ)中益氣、緩急止痛的功效[11-12]。有報(bào)道，有些中藥蜜制后會(huì)使部分黃酮苷、多糖等有效成分的含量升高[13-16]，因此，以蜂蜜作為山楂炮制輔料具有一定的研究意義。根據(jù)中藥炮制學(xué)辭典及地方志中記載，山楂還有蜜制、蜜制楂炭等炮制方法[17-18]，但未對(duì)蜜制工藝進(jìn)行規(guī)范。本實(shí)驗(yàn)就山楂蜜制工藝展開(kāi)試驗(yàn)，篩選山楂蜜制品的最佳炮制工藝，為山楂炮制品的藥效研究提供新的理論依據(jù)，為山楂更合理的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器與設(shè)備 高效液相色譜儀(CBM-10A VP Plus)；SPD-10AVP紫外檢測(cè)器(日本島津公司)；AE240十萬(wàn)分之一分析天平(瑞士MettLer公司)；電子天平(日本島津AY220)50 g手提式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)；手動(dòng)可調(diào)式移液器(百靈威科技有限公司)；KQ-250DB數(shù)控超聲波清洗器(功率：300 W，頻率：50 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)；石英比色皿(宜興市亮光高科分析儀器廠)；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，phq-9246A)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海榮亞生活儀器廠，型號(hào)：RE3000C)，SHZ循環(huán)水式多用真空泵[河南省予華儀器有限公司，型號(hào)：SHZ-D(Ⅲ)]。

1.2 材料與試劑 山楂飲片(購(gòu)于陽(yáng)光大藥房，批號(hào)：180301，產(chǎn)地：山東)，異槲皮苷對(duì)照品(批號(hào):wkq18022308)、兒茶素對(duì)照品(批號(hào):wkq18013103)、表兒茶素對(duì)照品(批號(hào):wkq1801603)、金絲桃苷(批號(hào):wkq18111901)及原花青素B2(批號(hào):wkq18042608)均來(lái)自四川維克奇生物科技有限公司，純度均為：HPLC≥98%，蜂蜜(江西意蜂實(shí)業(yè)有限公司，批號(hào)：20180505，產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)號(hào)：GB14963)，葡萄糖(江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：110833-201409，純度>98.0%)，苯酚(分析純)，濃鹽酸(分析純)，甲醇(色譜純)，乙腈(色譜純)，娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC法測(cè)定兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、金絲桃苷、異槲皮苷含量

2.1.1 色譜條件 Welchrom C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.1%冰醋酸水溶液(A)，甲醇-乙腈(B)(1∶2)，梯度洗脫(0～25 min，8%～25% B；25～30 min，25%～28% B；30～40 min，28%～32% B；40～45 min，32%～35% B)，體積流量：1 ml/min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm、360 nm。進(jìn)樣量：20 μl。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取原花青素B2、表兒茶素、兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷0.005 g，原花青素B2、表兒茶素、兒茶素用蒸餾水定容至5 ml容量瓶中得到混合對(duì)照品A；金絲桃苷、異槲皮苷用甲醇定容至5 ml容量瓶中，得到混合對(duì)照品B。最后稀釋得到各混合對(duì)照品溶液中原花青素B2、表兒茶素、兒茶素、金絲桃苷和異槲皮苷濃度為0.358 67、0.337 33、0.351 33、0.057 4、0.056 6 mg/ml。

2.2 紫外分光光度法測(cè)定多糖含量[19]

2.2.1 測(cè)定方法 精密吸取多糖溶液于干凈具塞試管中，加蒸餾水補(bǔ)充至2 ml，按照順序依次加入1 ml 5%苯酚溶液，搖勻，再加入濃硫酸5 ml，振蕩搖勻，靜置10 min，20 ℃水浴20 min，在490 nm下測(cè)定吸光度值。

2.2.2 對(duì)照品溶液配制 精密稱取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品0.1 g，蒸餾水定容至1 L容量瓶中，得到0.1 mg/ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.3 山楂蜜制品的制備 將蜂蜜倒入鍋內(nèi)，加熱至徐徐沸騰，改用文火保持微沸，除去上浮泡沫和蠟質(zhì)，再煉制沸騰起魚(yú)眼泡，煉制滴水成珠[12]。精密稱取煉蜜一定質(zhì)量，1∶1加入蒸餾水混勻后，加入山楂飲片攪拌，悶潤(rùn)6 h，放入烘箱中烘制，以不沾手為度，取出，放涼，得到山楂蜜制品，備用。

2.4 供試品溶液制備 將山楂飲片40 ℃烘干至恒重，精密稱取樣品粉末(過(guò)2號(hào)篩)2 g，炮制品按比例折合稱取樣品，置于50 ml錐形瓶中，加入1∶10的水，超聲提取40 min后離心，離心后吸取上清液定容至50 ml，1∶3比例加入無(wú)水乙醇，水提醇沉，靜置12 h，抽濾，濾渣用無(wú)水乙醇洗2～3次，得到的上層沉淀轉(zhuǎn)移至25 ml容量瓶中用蒸餾水定容，用于測(cè)定多糖的測(cè)定；下層濾液減壓濃縮用蒸餾水定容至5 ml，用于HPLC分析。HPLC色譜圖結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察 ①取“2.1.2”項(xiàng)下2種混合對(duì)照品溶液，混合對(duì)照品A稀釋0、2、5、10、15倍，混合對(duì)照品B稀釋0、2、4、6、8倍。在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進(jìn)行線性回歸分析。②取“2.2.3”項(xiàng)下葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液于干凈的具塞試管中，按照“2.1.2”項(xiàng)的多糖測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，以溶液濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度值為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在測(cè)定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系

2.5.2 精密度試驗(yàn) 取相同的供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定6次，測(cè)定各峰面積RSD值為1.97%～2.67%，測(cè)得多糖的吸光度值為2.15%～3.01%。

圖1 各成分測(cè)定色譜圖

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取相同供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣和測(cè)定吸光度值，測(cè)得各成分峰面積RSD值為2.02%～2.55%；取相同供試品溶液，在“2.1.2”項(xiàng)色譜條件下于0、2、4、6、8、10、12 h后測(cè)定多糖的吸光度值為1.98%～2.38%之間。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取相同藥材粉末6份，按照“2.4”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD值為2.14%～2.97%，多糖的吸光度值為2.75%～3.11%。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取蜜制山楂粉2 g，共6份，每份中加入兒茶素對(duì)照品0.82 mg、原花青素對(duì)照品1.38 mg、表兒茶素對(duì)照品1.93 mg、金絲桃苷對(duì)照品0.31 mg、異槲皮苷對(duì)照品0.28 mg，按照“2.4”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得兒茶素、原花青素B2、表兒茶素、金絲桃苷、異槲皮苷的平均加樣回收率分別為97.18%±2.87%、96.52%±1.96%、95.98%±1.72%、101.16%±1.85%、97.17%±2.60%。

精密吸取山楂多糖供試品溶液25 ml，共6份，加入適量葡萄糖，按照“2.2.1”項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得多糖平均加樣回收率為100.17%±1.99%。

2.6 蜜制工藝優(yōu)化 在單因素考察實(shí)驗(yàn)中，考察了烘制時(shí)間、烘制溫度、煉蜜與水的比例、悶潤(rùn)時(shí)間及加蜜量。煉蜜與水的比例中，若加水量過(guò)多，則在炮制過(guò)程中不能烘干完全；若水的比例過(guò)少，則在炮制過(guò)程煉蜜有損失。單因素考察顯示，加入1∶1的水量時(shí)，比例適中。觀察悶潤(rùn)時(shí)間2、4、6、8、10、12 h，發(fā)現(xiàn)在悶潤(rùn)6 h后各指標(biāo)含量無(wú)明顯增加，因此，選擇煉蜜與水的比例為1∶1，悶潤(rùn)時(shí)間為6 h為定因素。選擇烘制時(shí)間(A)、烘制溫度(B)、加蜜量(C)為影響因素，采用加權(quán)評(píng)分的方法優(yōu)化山楂蜜制工藝(設(shè)定滿分為100，權(quán)重系數(shù)分布為多糖、表兒茶素、兒茶素、原花青素B2均為0.2，金絲桃苷、異槲皮苷為0.1，Y=0.2W1/W1max+0.2W2/W2max+0.2W3/W3max+0.2W4/W4max+0.1W5/W5max+0.1W6/W6max)，見(jiàn)表2、表3。

表2 因素水平表

通過(guò)Design Expert 8.0.6.1軟件進(jìn)行多元回歸分析，得到方程為Y=96.02-3.93A-5.10B+0.91C+0.67AB-0.78AC+0.79BC-15.51A2-19.63B2-6.30C2(R2=0.975 6),方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。根據(jù)方差分析結(jié)果分析，該模型P<0.05，可用于預(yù)測(cè)。因素A、B對(duì)于綜合評(píng)分的影響極顯著，因素C對(duì)于綜合評(píng)分的影響有顯著性。AB、AC、BC交互項(xiàng)影響不顯著、失擬項(xiàng)影響不顯著，提示方程擬合度好。響應(yīng)面分析見(jiàn)圖2。

表4 方差分析結(jié)果

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)回歸方程，得到最佳蜜制工藝為每100 g山楂中加入15.37 g煉蜜，悶潤(rùn)6 h后98.69 ℃下烘制86.05 min。但為了試驗(yàn)的可操作性考慮，將其修正為100 g山楂加入15 g煉蜜，100 ℃下烘制90 min。取3份山楂藥材在上述條件下進(jìn)行驗(yàn)證，測(cè)得多糖含量為40.2 mg/g，兒茶素含量為0.65 mg/g，表兒茶素含量為1.1 mg/g，原花青素B2含量為1.0 mg/g，金絲桃苷含量為0.57 mg/g，異槲皮苷含量為0.54 mg/g，綜合評(píng)分為96.08，與預(yù)測(cè)值96.64接近，表明工藝穩(wěn)定可行。

圖2 各因素響應(yīng)面圖

3 討論

山楂現(xiàn)代炒制工藝中考察指標(biāo)多為有機(jī)酸及總黃酮[20-22]，但山楂中含有大量多糖類(lèi)及兒茶素類(lèi)等成分，后者均為山楂的有效物質(zhì)[23-25]。因此，本試驗(yàn)以兒茶素、表兒茶素、原花青素B2、金絲桃苷、異槲皮苷、多糖等多種有效成分為指標(biāo)，多方對(duì)炮制工藝進(jìn)行監(jiān)控，避免了單一指標(biāo)的片面性。同時(shí)，本試驗(yàn)采用了Box-Behnken設(shè)計(jì)優(yōu)化蜜制工藝，該方法選擇實(shí)驗(yàn)體系的目標(biāo)響應(yīng)值作為單個(gè)或多個(gè)實(shí)驗(yàn)因素的函數(shù)，與正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)比較更接近客觀實(shí)際，且兼顧了多個(gè)影響因素及因素之間的相互作用，使試驗(yàn)次數(shù)較少的同時(shí)獲得更精確的參數(shù)[23]。

山楂生品各成分含量測(cè)定結(jié)果如下:多糖(20.64 mg/g)，兒茶素(0.82 mg/g)，表兒茶素(1.38 mg/g)，原花青素B2(1.93 mg/g)，金絲桃苷(0.31 mg/g)，異槲皮苷(0.28 mg/g)。山楂蜜制品與山楂生品相比，多糖類(lèi)成分增加明顯。為避免蜂蜜對(duì)于多糖含量測(cè)定產(chǎn)生干擾，將煉蜜與炮制品在相同條件下進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)煉蜜經(jīng)醇沉后無(wú)多糖析出，其中單糖等低聚糖含量達(dá)92%，據(jù)此可排除蜂蜜的干擾。除山楂外，百合、甘草等中藥在蜜制后多糖含量升高[13-14]，但多糖含量升高的具體機(jī)制尚無(wú)明確結(jié)論，有待進(jìn)一步研究。兒茶素類(lèi)物質(zhì)經(jīng)炮制后含量略有降低，這可能是由于兒茶素類(lèi)成分在加熱條件下，逐漸發(fā)生分解。黃酮苷類(lèi)成分較生品含量升高，但當(dāng)炮制溫度超過(guò)110 ℃時(shí)含量又會(huì)逐步下降。這一變化可能是當(dāng)炮制溫度適宜后起到“殺酶保苷的作用”[15]，黃芪等中藥在蜜制后黃酮苷類(lèi)物質(zhì)確有升高[16]。

本試驗(yàn)對(duì)多糖、兒茶素類(lèi)及黃酮苷類(lèi)藥效成分炮制前后的變化進(jìn)行了初步研究。在工藝優(yōu)化基礎(chǔ)上，根據(jù)工藝優(yōu)化結(jié)果對(duì)生山楂及山楂蜜制品的抗心肌缺血的藥效進(jìn)行了試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山楂經(jīng)蜜制后抗心肌缺血作用強(qiáng)于生山楂，但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。本課題組認(rèn)為，從藥效及有效成分的研究結(jié)果分析，山楂蜜制具有一定的研究意義。后續(xù)將考察蜜制品與生品其他化學(xué)成分的變化，研究蜜制品與生品藥效學(xué)產(chǎn)生差異的機(jī)制，為山楂蜜制品的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。