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    ICP-MS同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地制草烏藥材中6種重金屬的含量及聚類分析

    2020-06-08 02:58:14胡國輝譚麗盈梁文能
    實(shí)用藥物與臨床 2020年2期
    關(guān)鍵詞:草烏項(xiàng)下內(nèi)標(biāo)

    胡國輝,譚麗盈,梁文能

    0 引言

    草烏為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffliReichb.的干燥塊根,通常在秋季莖葉枯萎時(shí)候采挖,除去須根和泥沙,干燥后備用。草烏性辛,苦、熱,有大毒,故臨床使用多為其炮制品,具有除濕祛風(fēng)、溫經(jīng)止痛等作用,主要用于治療由風(fēng)寒濕痹引起的關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛等癥狀[1-3]。草烏在本草十八反中有“半簍貝蘞及攻烏”之說,因此,在使用中應(yīng)注意其配伍禁忌。草烏中的主要成分為雙酯型生物堿,烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿是其止痛麻醉的主要活性成分[4-5],目前已有草烏中揮發(fā)油含量及有機(jī)農(nóng)藥殘留測(cè)定的報(bào)道[6-7],而重金屬中,只有鉛、鎘、砷、汞4種元素測(cè)定的相關(guān)研究[8],未見同時(shí)測(cè)定6種重金屬的報(bào)道。重金屬是指一類對(duì)人類身體有害的金屬元素,會(huì)影響中藥藥效。近年來,由于環(huán)境污染,造成對(duì)土壤的重金屬等污染,從而影響了各種中藥材的生長和質(zhì)量[9-10],而草烏藥材使用的是其干燥塊莖部,其污染更直接。由于重金屬在人體內(nèi)易于累積,難以排除,且在人體易于和酶蛋白結(jié)合,使蛋白質(zhì)失去活性,進(jìn)而損傷人體組織細(xì)胞,同時(shí)會(huì)破壞人體的免疫系統(tǒng)和損傷器官[11],如果服用含有重金屬污染超標(biāo)的藥材,不僅起不到治療藥效,甚至?xí)o身體帶來一定的傷害,因此,有必要對(duì)草烏藥材中有害重金屬進(jìn)行定量。

    目前,對(duì)中藥材的重金屬測(cè)定主要有試管比色法、原子吸收光譜法[12]、原子熒光光譜法[13]、ICP-OES[14]法、ICP-MS[15-16]法等。各種方法均有其各自的特點(diǎn)和使用范圍,《中國藥典》2015年版四部收載的為原子吸收光譜法和ICP-MS法,電感耦合等離子體法因其具有較高靈敏度和檢出限,是目前公認(rèn)的同時(shí)測(cè)定多種痕量元素的常用方法,因此,廣泛用于食品、藥品、環(huán)境等各個(gè)行業(yè)。故本文參考2015年版《中國藥典》四部重金屬指導(dǎo)原則和相關(guān)文獻(xiàn)[17],建立ICP-MS同時(shí)測(cè)定草烏藥材中6種有害重金屬元素的含量,并采用聚類分析對(duì)其結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià),從而為保證其臨床用藥安全提供依據(jù)。

    1 儀器與試藥

    1.1 儀器 Agilent7500A型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司);MARS6微波消解儀(美國培安儀器有限公司);Sartorius BP210S電子分析天平(德國賽多利斯有限公司)。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試藥 Pb、Cd、As、Cu、Cr等多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml),批號(hào):GNM-M251678-2016;內(nèi)標(biāo)溶液 Bi、Ge、Sc、In等元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml),批號(hào):GSB 04-1719-2004,Au單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml),批號(hào):GSB 04-1715-2004,均購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心,Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml),批號(hào):GBW08617,購自中國計(jì)量科學(xué)研究院;KED調(diào)諧液(美國Agilent公司);65%優(yōu)級(jí)硝酸購自美國Merck股份兩合公司,水為超純水(美國Millipore公司),容量瓶和移液管均為聚乙烯塑料瓶(德國布蘭德公司),12批草烏藥材來自6個(gè)產(chǎn)地,均購自廣州清平中藥材市場(chǎng)。所購藥材均經(jīng)梁文能副主任中藥師鑒定,為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffliReichb.的干燥塊根。見表1。

    2 方法與結(jié)果

    2.1 ICP-MS工作條件 ICP-MS儀器參數(shù):RF發(fā)射功率1 300 W,霧化氣流速0.87 L/min;輔助氣體流量1.0 L/min;冷卻氣體流量18.0 L/min;采樣深度7.2 mm,樣品提升速率1.0 L/min,液氬壓力0.6 mPa;脈沖電壓850 V;樣品沖洗時(shí)間40 s;延遲16 s;數(shù)據(jù)采集模式全定量方式;讀數(shù)時(shí)間3 s,每個(gè)樣品測(cè)定3次。測(cè)定時(shí)選取同位素208Pb和202Hg以209Bi做內(nèi)標(biāo)物,114Cd以115In做內(nèi)標(biāo)物質(zhì),52Cr以47Sc做內(nèi)標(biāo)物,63Cu、75As以Ge做內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

    表1 12批不同產(chǎn)地草烏藥材樣品的來源

    2.2 溶液的制備

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備 分別精密吸取“1.2”項(xiàng)下的Pb、Cd、As、Cu、Cr的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml以及Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml置同一100 ml量瓶中,用2%硝酸稀釋至刻度,搖勻,作為對(duì)照品混合溶液(每1 ml分別含Pb、Cd、As、Cu、Hg、Cr 10 μg)。

    2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量,用2%硝酸分別稀釋制成每1 ml中含Pb 5、10、20、30、40 ng,Cd 0.5、1、2、3、4 ng,Cr 5、10、15、20、30 ng,Cu 0.04、0.2、0.4、0.6、0.8 μg,As 2、6、10、16、20 ng,Hg 2、6、10、14、18 ng的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,同時(shí)取2%硝酸作為標(biāo)準(zhǔn)品的空白溶液。

    2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取“1.2”項(xiàng)下的Sc、Bi、Ge和In單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml置100 ml量瓶中,用超純水稀釋至刻度,搖勻作為內(nèi)標(biāo)溶液的儲(chǔ)備溶液,精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液的儲(chǔ)備溶液1 ml置100 ml量瓶中,用超純水稀釋至刻度,作為內(nèi)標(biāo)混合溶液(每1 ml分別含Sc、Bi、Ge、In 0.1 μg)。

    2.2.4 供試品溶液的制備 取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材,粉碎,過二號(hào)篩,粉末備用,精密稱取上述粉末0.5 g,置聚四氟乙烯微波消解罐中,加入硝酸10 ml,混勻,浸泡過夜,然后置于微波消解儀中,按表2中微波消解程序進(jìn)行消解。消解完成后,用趕酸器將消解液揮發(fā)至約1~2 ml時(shí),用水少量多次轉(zhuǎn)移至50 ml聚四氟乙烯容量瓶中,加入Au單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/ml) 200 μl,加水稀釋定容至刻度,搖勻,作為供試品溶液,同時(shí)制備樣品空白溶液。

    表2 微波消解儀工作條件

    2.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按照“2.1”項(xiàng)下的ICP-MS儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,采用“2.2.3”項(xiàng)下0.1 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液作為校正,依次將進(jìn)樣管插入各個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中測(cè)定,內(nèi)標(biāo)管插入內(nèi)標(biāo)溶液中,以各個(gè)元素測(cè)量的信號(hào)值為縱坐標(biāo)Y,相對(duì)應(yīng)的濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)X,進(jìn)行線性回歸。結(jié)果各元素線性方程及相關(guān)系數(shù)等參數(shù)見表3。

    表3 線性方程及相關(guān)參數(shù)

    2.4 精密度試驗(yàn) 在“2.2.2”項(xiàng)下的各元素線性范圍內(nèi),分別取各個(gè)元素的低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液,按“2.1”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)行測(cè)定,每種濃度重復(fù)測(cè)定6次,記錄信號(hào)值,結(jié)果顯示,RSD均在5%之內(nèi),表明該儀器的精密度良好。見表4。

    表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果(%)

    2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.5 g,同時(shí)制備6份樣品,按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液方法制備,按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算6種元素的含量,結(jié)果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As的平均含量為0.240 5、0.028 7、0.289 6、2.825 0、0.041 5、0.135 2 mg/kg,RSD分別為4.02%、4.86%、3.23%、1.22%、1.79%、2.65%,表明樣品的重復(fù)性良好。

    2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.5 g,按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備,按照“2.1”項(xiàng)下的儀器條件分別于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定,記錄各元素的信號(hào)值。結(jié)果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As各元素RSD值分別為4.15%、3.26%、2.78%、1.16%、2.56%、2.68%。結(jié)果表明,該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.25 g,置聚四氟乙烯消解罐內(nèi),同時(shí)制備6份樣,另取“2.2.1”項(xiàng)下的多元素混合標(biāo)準(zhǔn)和Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液,用水稀釋成每1 ml含Pb、Cr、As各0.1 μg/L,Cd、Hg各0.01 μg/L,Cu 1 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,作為加標(biāo)溶液,分別向上述6份樣品中加入加標(biāo)溶液各1 ml,然后按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備,同時(shí)做樣品空白,按“2.1”項(xiàng)下的儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定,分別計(jì)算各元素加樣回收率,測(cè)定結(jié)果見表5。

    2.8 樣品測(cè)定 取上述12個(gè)不同產(chǎn)地的制草烏藥材,按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備,同法制備空白溶液,按“2.1”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)行測(cè)定,測(cè)定結(jié)果見表6。

    2.9 聚類分析實(shí)驗(yàn) 對(duì)上述12個(gè)不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬含量的結(jié)果,采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析,采用組間聯(lián)接方法,平均Euclidean距離,進(jìn)行層次聚類,結(jié)果當(dāng)平均Euclidean距離為5時(shí),12批樣品共分為四大類,見圖1,其中S2號(hào)(吉林長春)、S9號(hào)(安徽合肥)為第1類;S10號(hào)(河南信陽)、S12號(hào)(河北保定)為第2類;S6號(hào)(內(nèi)蒙古赤峰)為第3類;S8號(hào)(山東臨沂)、S11號(hào)(貴州銅仁)、S5號(hào)(湖南婁底)、S7號(hào)(新疆伊犁)、S3號(hào)(陜西漢中)、S4號(hào)(陜西商洛)、S1號(hào)(四川成都)為第4類,聚類結(jié)果顯示同一類之間的重金屬含量結(jié)果相似度較高,不同類之間差異較大,因此,可以初步判斷不同產(chǎn)地制草烏藥材中重金屬含量的差異。

    表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

    表6 不同產(chǎn)地制草烏藥材測(cè)定結(jié)果(mg/kg)

    注:“ND”表示未檢出

    圖1 制草烏藥材中6種重金屬系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

    3 討論

    3.1 消解酸體系的選擇 首先將制草烏藥材進(jìn)行粉碎,過二號(hào)篩備用,分別采用HNO3、HNO3-HCl(9∶1)、HNO3-H2O2(8∶2)、HNO3-HF(9∶1)等體系進(jìn)行消解樣品。結(jié)果顯示,上述4種體系的酸都可以把制草烏藥材消解完全,且消解液均為澄清透明無殘?jiān)?。但是考慮到使用的酸體系越復(fù)雜,對(duì)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定干擾就越大,而且在ICP-MS測(cè)定中酸體系越多,引入的元素就越多,越會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用HNO3-HCl(8∶2)作為消解液時(shí),會(huì)引入Cl,Cl與Ar形成40Ar35Cl而干擾75As的測(cè)定,如果采用HNO3-HF(9∶1)體系,會(huì)引入HF。在趕酸過程中,如果HF趕酸不徹底,會(huì)對(duì)儀器的霧化室、通透鏡、采樣錐和炬管產(chǎn)生一定的腐蝕作用,進(jìn)而影響儀器的使用壽命。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),如果采用HF,需要在趕酸近干時(shí),多次少量加水進(jìn)行趕酸,從而保證HF徹底揮發(fā),最后綜合考慮并參考2015年版《中國藥典》四部重金屬的指導(dǎo)原則,采用HNO3作為制草烏藥材的消解體系。由于所測(cè)重金屬元素為痕量物質(zhì),因此,實(shí)驗(yàn)所用的移液管和容量瓶均為聚乙烯塑料材質(zhì),使用前需用20%硝酸溶液浸泡過夜,減少污染,從而保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

    3.2 供試品的制備 本研究發(fā)現(xiàn),汞元素的回收率較低,基本為50%~60%,通過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在供試品制備的過程中,趕酸溫度影響很大。如果超過140 ℃進(jìn)行趕酸,汞元素會(huì)揮發(fā)掉,影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,如果在80 ℃以下趕酸,回收率基本可以在80%以上。因此,實(shí)驗(yàn)中,趕酸需要溫度較低,從而保證汞元素的測(cè)定。汞具有強(qiáng)的吸附性,極易附著在儀器的采樣錐、樣品管和矩管上,影響其他元素的測(cè)定,因此,在樣品中要加入一定的Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液。由于汞可以與金形成金汞齊,使其溶解,減少儀器污染,從而保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

    3.3 ICP-MS的優(yōu)點(diǎn) ICP-MS在測(cè)定重金屬時(shí)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性,在測(cè)定中為了使儀器的靈敏度最高,減少相互之間的干擾,補(bǔ)償基體效應(yīng),依據(jù)質(zhì)量數(shù)相近,電離電位相近的原則選擇47Sc作為Cr、209Bi作為202Hg和208Pb、72Ge作為64Cu和75As、115In作為114Cd元素的內(nèi)標(biāo)溶液,結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以減少元素直接的干擾,保證結(jié)果的準(zhǔn)確性,同時(shí)采用ICP-MS同時(shí)測(cè)定多種元素,具有分析速度快、靈敏度高、一次進(jìn)樣測(cè)定多個(gè)元素的優(yōu)勢(shì),從而縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,提高實(shí)驗(yàn)效率,因此,本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法同時(shí)測(cè)定12批不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬元素,解決了原子吸收、原子熒光光譜等儀器對(duì)重金屬元素逐個(gè)分析的現(xiàn)狀,大大提高了工作效率。

    3.4 結(jié)果的判定 目前2015年版《中國藥典》僅對(duì)西洋參、黃芪、枸杞子等部分藥材的重金屬做了限度要求,其余大部分藥材中重金屬尚未制定標(biāo)準(zhǔn),參考《中國藥典》部分藥材的規(guī)定以及《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)重金屬的規(guī)定為鉛≤5 mg/kg,鎘≤0.3 mg/kg,鉻≤2 mg/kg,銅≤20 mg/kg,汞≤0.2 mg/kg,砷≤2 mg/kg。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同產(chǎn)地的12批制草烏藥材中6種重金屬的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)12批不同產(chǎn)地的制草烏藥材中,鉛、鉻和銅的合格率為100%,沒有超標(biāo)現(xiàn)象。河南信陽產(chǎn)地草烏藥材中鎘、汞和砷均有超標(biāo)現(xiàn)象。河北保定僅有砷元素超標(biāo),總體質(zhì)量比較良好,超標(biāo)的原因可能是由于當(dāng)?shù)亻L期施用工業(yè)磷肥中的鎘和砷造成的,以及與當(dāng)?shù)氐闹参锷L的土壤環(huán)境有關(guān),應(yīng)引起當(dāng)?shù)乇O(jiān)管部門的注意。為了防止重金屬污染,必須從源頭做起,如在具有優(yōu)良GAP的產(chǎn)地進(jìn)行種植和栽培,嚴(yán)格控制藥材生長的環(huán)境、化肥等,從而保證藥材的安全性和有效性。建議制草烏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加重金屬的檢查項(xiàng)目。

    4 小結(jié)

    從本文所建立的方法來看,制草烏中仍然有可能出現(xiàn)重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象,而且不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬含量差異較大,有的產(chǎn)地會(huì)有多種元素同時(shí)超標(biāo)的現(xiàn)象,因此,需要提高藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來保證臨床用藥的安全性和有效性。本文建立的方法操作簡(jiǎn)單,快速,準(zhǔn)確,可以為完善制草烏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。

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