ICP-MS同時(shí)測(cè)定不同產(chǎn)地制草烏藥材中6種重金屬的含量及聚類分析

胡國輝，譚麗盈，梁文能

0 引言

草烏為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffliReichb.的干燥塊根，通常在秋季莖葉枯萎時(shí)候采挖，除去須根和泥沙，干燥后備用。草烏性辛，苦、熱，有大毒，故臨床使用多為其炮制品，具有除濕祛風(fēng)、溫經(jīng)止痛等作用，主要用于治療由風(fēng)寒濕痹引起的關(guān)節(jié)疼痛、心腹冷痛等癥狀[1-3]。草烏在本草十八反中有“半簍貝蘞及攻烏”之說，因此，在使用中應(yīng)注意其配伍禁忌。草烏中的主要成分為雙酯型生物堿，烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿是其止痛麻醉的主要活性成分[4-5]，目前已有草烏中揮發(fā)油含量及有機(jī)農(nóng)藥殘留測(cè)定的報(bào)道[6-7]，而重金屬中，只有鉛、鎘、砷、汞4種元素測(cè)定的相關(guān)研究[8]，未見同時(shí)測(cè)定6種重金屬的報(bào)道。重金屬是指一類對(duì)人類身體有害的金屬元素，會(huì)影響中藥藥效。近年來，由于環(huán)境污染，造成對(duì)土壤的重金屬等污染，從而影響了各種中藥材的生長和質(zhì)量[9-10]，而草烏藥材使用的是其干燥塊莖部，其污染更直接。由于重金屬在人體內(nèi)易于累積，難以排除，且在人體易于和酶蛋白結(jié)合，使蛋白質(zhì)失去活性，進(jìn)而損傷人體組織細(xì)胞，同時(shí)會(huì)破壞人體的免疫系統(tǒng)和損傷器官[11]，如果服用含有重金屬污染超標(biāo)的藥材，不僅起不到治療藥效，甚至?xí)o身體帶來一定的傷害，因此，有必要對(duì)草烏藥材中有害重金屬進(jìn)行定量。

目前，對(duì)中藥材的重金屬測(cè)定主要有試管比色法、原子吸收光譜法[12]、原子熒光光譜法[13]、ICP-OES[14]法、ICP-MS[15-16]法等。各種方法均有其各自的特點(diǎn)和使用范圍，《中國藥典》2015年版四部收載的為原子吸收光譜法和ICP-MS法，電感耦合等離子體法因其具有較高靈敏度和檢出限，是目前公認(rèn)的同時(shí)測(cè)定多種痕量元素的常用方法，因此，廣泛用于食品、藥品、環(huán)境等各個(gè)行業(yè)。故本文參考2015年版《中國藥典》四部重金屬指導(dǎo)原則和相關(guān)文獻(xiàn)[17]，建立ICP-MS同時(shí)測(cè)定草烏藥材中6種有害重金屬元素的含量，并采用聚類分析對(duì)其結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，從而為保證其臨床用藥安全提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent7500A型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國安捷倫公司)；MARS6微波消解儀(美國培安儀器有限公司)；Sartorius BP210S電子分析天平(德國賽多利斯有限公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與試藥 Pb、Cd、As、Cu、Cr等多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml)，批號(hào)：GNM-M251678-2016；內(nèi)標(biāo)溶液 Bi、Ge、Sc、In等元素的標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml)，批號(hào)：GSB 04-1719-2004，Au單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml)，批號(hào)：GSB 04-1715-2004，均購自國家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 μg/ml)，批號(hào)：GBW08617，購自中國計(jì)量科學(xué)研究院；KED調(diào)諧液(美國Agilent公司)；65%優(yōu)級(jí)硝酸購自美國Merck股份兩合公司，水為超純水(美國Millipore公司)，容量瓶和移液管均為聚乙烯塑料瓶(德國布蘭德公司)，12批草烏藥材來自6個(gè)產(chǎn)地，均購自廣州清平中藥材市場(chǎng)。所購藥材均經(jīng)梁文能副主任中藥師鑒定，為毛茛科植物北烏頭AconitumkusnezoffliReichb.的干燥塊根。見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS工作條件 ICP-MS儀器參數(shù)：RF發(fā)射功率1 300 W，霧化氣流速0.87 L/min；輔助氣體流量1.0 L/min；冷卻氣體流量18.0 L/min；采樣深度7.2 mm，樣品提升速率1.0 L/min，液氬壓力0.6 mPa；脈沖電壓850 V；樣品沖洗時(shí)間40 s；延遲16 s；數(shù)據(jù)采集模式全定量方式；讀數(shù)時(shí)間3 s，每個(gè)樣品測(cè)定3次。測(cè)定時(shí)選取同位素208Pb和202Hg以209Bi做內(nèi)標(biāo)物，114Cd以115In做內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，52Cr以47Sc做內(nèi)標(biāo)物，63Cu、75As以Ge做內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。

表1 12批不同產(chǎn)地草烏藥材樣品的來源

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液的制備 分別精密吸取“1.2”項(xiàng)下的Pb、Cd、As、Cu、Cr的多元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml以及Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml置同一100 ml量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品混合溶液(每1 ml分別含Pb、Cd、As、Cu、Hg、Cr 10 μg)。

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密量取“2.2.1”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，用2%硝酸分別稀釋制成每1 ml中含Pb 5、10、20、30、40 ng，Cd 0.5、1、2、3、4 ng，Cr 5、10、15、20、30 ng，Cu 0.04、0.2、0.4、0.6、0.8 μg，As 2、6、10、16、20 ng，Hg 2、6、10、14、18 ng的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，同時(shí)取2%硝酸作為標(biāo)準(zhǔn)品的空白溶液。

2.2.3 內(nèi)標(biāo)溶液的制備 精密量取“1.2”項(xiàng)下的Sc、Bi、Ge和In單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 ml置100 ml量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻作為內(nèi)標(biāo)溶液的儲(chǔ)備溶液，精密吸取上述內(nèi)標(biāo)溶液的儲(chǔ)備溶液1 ml置100 ml量瓶中，用超純水稀釋至刻度，作為內(nèi)標(biāo)混合溶液(每1 ml分別含Sc、Bi、Ge、In 0.1 μg)。

2.2.4 供試品溶液的制備 取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材，粉碎，過二號(hào)篩，粉末備用，精密稱取上述粉末0.5 g，置聚四氟乙烯微波消解罐中，加入硝酸10 ml，混勻，浸泡過夜，然后置于微波消解儀中，按表2中微波消解程序進(jìn)行消解。消解完成后，用趕酸器將消解液揮發(fā)至約1～2 ml時(shí)，用水少量多次轉(zhuǎn)移至50 ml聚四氟乙烯容量瓶中，加入Au單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 μg/ml) 200 μl，加水稀釋定容至刻度，搖勻，作為供試品溶液，同時(shí)制備樣品空白溶液。

表2 微波消解儀工作條件

2.3 線性關(guān)系考察 取“2.2.2”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的ICP-MS儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，采用“2.2.3”項(xiàng)下0.1 μg/ml的內(nèi)標(biāo)溶液作為校正，依次將進(jìn)樣管插入各個(gè)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中測(cè)定，內(nèi)標(biāo)管插入內(nèi)標(biāo)溶液中，以各個(gè)元素測(cè)量的信號(hào)值為縱坐標(biāo)Y，相對(duì)應(yīng)的濃度(ng/ml)為橫坐標(biāo)X，進(jìn)行線性回歸。結(jié)果各元素線性方程及相關(guān)系數(shù)等參數(shù)見表3。

表3 線性方程及相關(guān)參數(shù)

2.4 精密度試驗(yàn) 在“2.2.2”項(xiàng)下的各元素線性范圍內(nèi)，分別取各個(gè)元素的低、中、高3種不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按“2.1”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)行測(cè)定，每種濃度重復(fù)測(cè)定6次，記錄信號(hào)值，結(jié)果顯示，RSD均在5%之內(nèi)，表明該儀器的精密度良好。見表4。

表4 精密度試驗(yàn)結(jié)果(%)

2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.5 g，同時(shí)制備6份樣品，按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算6種元素的含量，結(jié)果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As的平均含量為0.240 5、0.028 7、0.289 6、2.825 0、0.041 5、0.135 2 mg/kg，RSD分別為4.02%、4.86%、3.23%、1.22%、1.79%、2.65%，表明樣品的重復(fù)性良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.5 g，按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備，按照“2.1”項(xiàng)下的儀器條件分別于0、1、2、4、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，記錄各元素的信號(hào)值。結(jié)果Pb、Cd、Cr、Cu、Hg、As各元素RSD值分別為4.15%、3.26%、2.78%、1.16%、2.56%、2.68%。結(jié)果表明，該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量四川成都產(chǎn)的制草烏藥材粉末0.25 g，置聚四氟乙烯消解罐內(nèi)，同時(shí)制備6份樣，另取“2.2.1”項(xiàng)下的多元素混合標(biāo)準(zhǔn)和Hg單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液，用水稀釋成每1 ml含Pb、Cr、As各0.1 μg/L，Cd、Hg各0.01 μg/L，Cu 1 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，作為加標(biāo)溶液，分別向上述6份樣品中加入加標(biāo)溶液各1 ml，然后按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備，同時(shí)做樣品空白，按“2.1”項(xiàng)下的儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，分別計(jì)算各元素加樣回收率，測(cè)定結(jié)果見表5。

2.8 樣品測(cè)定 取上述12個(gè)不同產(chǎn)地的制草烏藥材，按“2.2.4”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法制備，同法制備空白溶液，按“2.1”項(xiàng)下的儀器條件進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見表6。

2.9 聚類分析實(shí)驗(yàn) 對(duì)上述12個(gè)不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬含量的結(jié)果，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)其進(jìn)行聚類分析，采用組間聯(lián)接方法，平均Euclidean距離，進(jìn)行層次聚類，結(jié)果當(dāng)平均Euclidean距離為5時(shí)，12批樣品共分為四大類，見圖1，其中S2號(hào)(吉林長春)、S9號(hào)(安徽合肥)為第1類；S10號(hào)(河南信陽)、S12號(hào)(河北保定)為第2類；S6號(hào)(內(nèi)蒙古赤峰)為第3類；S8號(hào)(山東臨沂)、S11號(hào)(貴州銅仁)、S5號(hào)(湖南婁底)、S7號(hào)(新疆伊犁)、S3號(hào)(陜西漢中)、S4號(hào)(陜西商洛)、S1號(hào)(四川成都)為第4類，聚類結(jié)果顯示同一類之間的重金屬含量結(jié)果相似度較高，不同類之間差異較大，因此，可以初步判斷不同產(chǎn)地制草烏藥材中重金屬含量的差異。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表6 不同產(chǎn)地制草烏藥材測(cè)定結(jié)果(mg/kg)

注：“ND”表示未檢出

圖1 制草烏藥材中6種重金屬系統(tǒng)聚類分析結(jié)果

3 討論

3.1 消解酸體系的選擇 首先將制草烏藥材進(jìn)行粉碎，過二號(hào)篩備用，分別采用HNO3、HNO3-HCl(9∶1)、HNO3-H2O2(8∶2)、HNO3-HF(9∶1)等體系進(jìn)行消解樣品。結(jié)果顯示，上述4種體系的酸都可以把制草烏藥材消解完全，且消解液均為澄清透明無殘?jiān)?。但是考慮到使用的酸體系越復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)的測(cè)定干擾就越大，而且在ICP-MS測(cè)定中酸體系越多，引入的元素就越多，越會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用HNO3-HCl(8∶2)作為消解液時(shí)，會(huì)引入Cl，Cl與Ar形成40Ar35Cl而干擾75As的測(cè)定，如果采用HNO3-HF(9∶1)體系，會(huì)引入HF。在趕酸過程中，如果HF趕酸不徹底，會(huì)對(duì)儀器的霧化室、通透鏡、采樣錐和炬管產(chǎn)生一定的腐蝕作用，進(jìn)而影響儀器的使用壽命。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，如果采用HF，需要在趕酸近干時(shí)，多次少量加水進(jìn)行趕酸，從而保證HF徹底揮發(fā)，最后綜合考慮并參考2015年版《中國藥典》四部重金屬的指導(dǎo)原則，采用HNO3作為制草烏藥材的消解體系。由于所測(cè)重金屬元素為痕量物質(zhì)，因此，實(shí)驗(yàn)所用的移液管和容量瓶均為聚乙烯塑料材質(zhì)，使用前需用20%硝酸溶液浸泡過夜，減少污染，從而保證數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

3.2 供試品的制備 本研究發(fā)現(xiàn)，汞元素的回收率較低，基本為50%～60%，通過多次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在供試品制備的過程中，趕酸溫度影響很大。如果超過140 ℃進(jìn)行趕酸，汞元素會(huì)揮發(fā)掉，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，如果在80 ℃以下趕酸，回收率基本可以在80%以上。因此，實(shí)驗(yàn)中，趕酸需要溫度較低，從而保證汞元素的測(cè)定。汞具有強(qiáng)的吸附性，極易附著在儀器的采樣錐、樣品管和矩管上，影響其他元素的測(cè)定，因此，在樣品中要加入一定的Au元素標(biāo)準(zhǔn)溶液。由于汞可以與金形成金汞齊，使其溶解，減少儀器污染，從而保證測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

3.3 ICP-MS的優(yōu)點(diǎn) ICP-MS在測(cè)定重金屬時(shí)具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，在測(cè)定中為了使儀器的靈敏度最高，減少相互之間的干擾，補(bǔ)償基體效應(yīng)，依據(jù)質(zhì)量數(shù)相近，電離電位相近的原則選擇47Sc作為Cr、209Bi作為202Hg和208Pb、72Ge作為64Cu和75As、115In作為114Cd元素的內(nèi)標(biāo)溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可以減少元素直接的干擾，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，同時(shí)采用ICP-MS同時(shí)測(cè)定多種元素，具有分析速度快、靈敏度高、一次進(jìn)樣測(cè)定多個(gè)元素的優(yōu)勢(shì)，從而縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，因此，本實(shí)驗(yàn)采用ICP-MS法同時(shí)測(cè)定12批不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬元素，解決了原子吸收、原子熒光光譜等儀器對(duì)重金屬元素逐個(gè)分析的現(xiàn)狀，大大提高了工作效率。

3.4 結(jié)果的判定 目前2015年版《中國藥典》僅對(duì)西洋參、黃芪、枸杞子等部分藥材的重金屬做了限度要求，其余大部分藥材中重金屬尚未制定標(biāo)準(zhǔn)，參考《中國藥典》部分藥材的規(guī)定以及《藥用植物及制劑進(jìn)出口綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》對(duì)重金屬的規(guī)定為鉛≤5 mg/kg，鎘≤0.3 mg/kg，鉻≤2 mg/kg，銅≤20 mg/kg，汞≤0.2 mg/kg，砷≤2 mg/kg。實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同產(chǎn)地的12批制草烏藥材中6種重金屬的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)12批不同產(chǎn)地的制草烏藥材中，鉛、鉻和銅的合格率為100%，沒有超標(biāo)現(xiàn)象。河南信陽產(chǎn)地草烏藥材中鎘、汞和砷均有超標(biāo)現(xiàn)象。河北保定僅有砷元素超標(biāo)，總體質(zhì)量比較良好，超標(biāo)的原因可能是由于當(dāng)?shù)亻L期施用工業(yè)磷肥中的鎘和砷造成的，以及與當(dāng)?shù)氐闹参锷L的土壤環(huán)境有關(guān)，應(yīng)引起當(dāng)?shù)乇O(jiān)管部門的注意。為了防止重金屬污染，必須從源頭做起，如在具有優(yōu)良GAP的產(chǎn)地進(jìn)行種植和栽培，嚴(yán)格控制藥材生長的環(huán)境、化肥等，從而保證藥材的安全性和有效性。建議制草烏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中增加重金屬的檢查項(xiàng)目。

4 小結(jié)

從本文所建立的方法來看，制草烏中仍然有可能出現(xiàn)重金屬超標(biāo)的現(xiàn)象，而且不同產(chǎn)地的制草烏藥材中6種重金屬含量差異較大，有的產(chǎn)地會(huì)有多種元素同時(shí)超標(biāo)的現(xiàn)象，因此，需要提高藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)來保證臨床用藥的安全性和有效性。本文建立的方法操作簡(jiǎn)單，快速，準(zhǔn)確，可以為完善制草烏藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的依據(jù)。