基于小孢子培養(yǎng)的芥藍(lán)單倍體育種技術(shù)研究

羅文龍，郭巨先，符 梅，李桂花，徐小萬，劉洪標(biāo)，田永紅

（廣東省蔬菜新技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東 廣州 510640）

【研究意義】芥藍(lán)（Brassica oleraceavar.alboglabra）為十字花科蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種，以花薹為主要食用部分，風(fēng)味獨(dú)特，是華南地區(qū)的特色蔬菜品種[1]。芥藍(lán)純系（即自交系）的創(chuàng)制，是進(jìn)一步選育芥藍(lán)常規(guī)種、雜交種的基礎(chǔ)和前提。傳統(tǒng)的純系生產(chǎn)方法，主要依賴于雜交后的連續(xù)自交純化，一般需自交6～8個(gè)世代。然而，芥藍(lán)是喜涼蔬菜作物，在華南地區(qū)只有冬春季能正常開花結(jié)實(shí)，使其自交系的選育周期漫長、育種效率低下。因此，芥藍(lán)育種發(fā)展較慢，品種數(shù)量較少、類型較單一[2]，已經(jīng)越來越難以滿足生產(chǎn)需求。利用組織培養(yǎng)或誘導(dǎo)系誘發(fā)單倍體，再通過染色體加倍產(chǎn)生純合度為100%的雙單倍體（Doubled Haploid, DH），是一種快速創(chuàng)制純系（即DH系）的途徑。在此基礎(chǔ)上發(fā)展形成的單倍體育種技術(shù)，只需2～3個(gè)世代即可創(chuàng)制自交系，能大幅縮短育種周期、提高育種效率[3-4]。更為重要的是，單倍體育種技術(shù)的成熟發(fā)展，為作物基因組選擇育種提供了重要支撐[5]。【前人研究進(jìn)展】目前，單倍體育種已在跨國種子企業(yè)玉米、小麥和油菜等大田作物的育種中得到大規(guī)模應(yīng)用[6-7]。在甘藍(lán)、花椰菜、大白菜、蘿卜等蔬菜作物，基于小孢子培養(yǎng)的單倍體育種技術(shù)也得到較多應(yīng)用[8-11]。隨著單倍體育種理論和應(yīng)用基礎(chǔ)研究的發(fā)展，可以預(yù)見，單倍體育種將成為未來最重要的育種關(guān)鍵技術(shù)之一。單倍體育種的技術(shù)流程，主要包括誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體、染色體加倍以及加倍植株的自交成系。單倍體育種流程相對(duì)較復(fù)雜，需要對(duì)各技術(shù)環(huán)節(jié)不斷優(yōu)化，加以改進(jìn)。單倍體育種流程的建立和優(yōu)化，對(duì)于縮短芥藍(lán)育種周期、提高育種效率有重要意義?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】我們前期已對(duì)芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)技術(shù)開展了初步研究[12]，發(fā)現(xiàn)胚狀體的誘導(dǎo)率與材料基因型密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上對(duì)芥藍(lán)單倍體育種的技術(shù)流程進(jìn)行整合和優(yōu)化?！緮M解決的關(guān)鍵問題】建立一套較完整有效的芥藍(lán)單倍體育種技術(shù)流程，探討芥藍(lán)DH系的規(guī)?；a(chǎn)和育種應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

利用Lb07M、612M、孤老種等14份不同類型的芥藍(lán)材料（表1）開展小孢子培養(yǎng)。上述材料于2017年秋季播種于廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所白云基地，按常規(guī)方法管理，至2017年12月中旬（盛花期）采集花蕾進(jìn)行試驗(yàn)。

游離小孢子的采集和培養(yǎng)，使用B5液體培養(yǎng)基和NLN液體培養(yǎng)基；胚狀體和小苗的培養(yǎng)，使用培養(yǎng)基B5固體培養(yǎng)基、MS和1/2 MS固體培養(yǎng)基。上述培養(yǎng)基均為公開配方，為方便使用，直接購買商業(yè)的預(yù)配培養(yǎng)基粉末，按廠家推薦方法進(jìn)行配制和滅菌處理。其中，B5液體培養(yǎng)基和NLN液體培養(yǎng)基添加13%蔗糖，B5固體培養(yǎng)基、MS和1/2 MS固體培養(yǎng)基添加3%的蔗糖，pH均調(diào)整至 5.8～5.9。

用于染色體加倍處理的秋水仙素溶液，質(zhì)量體積濃度為0.1%，溶劑為磷酸鹽緩存溶液（pH7.0），同時(shí)含2%二甲基亞砜（DMSO）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 研缽研磨提取芥藍(lán)小孢子 選擇處于盛花期的供體植株，于晴天上午采集花蕾。挑取適期（單核靠邊期）花蕾40個(gè)，置于研缽，用75%乙醇消毒30 s，再用8%次氯酸鈉滅菌15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3次。于研缽中加入5 mL的B5液體培養(yǎng)基，用研棒輕輕擠壓花蕾使小孢子從花藥中游離，然后將含游離小孢子的液體培養(yǎng)基倒入過濾器（網(wǎng)格大小為40 μm）過濾，濾液盛入50 mL離心管；重復(fù)2次，以盡可能多獲得游離小孢子。

表1 供試14份芥藍(lán)材料Table 1 Fourteen Chinese kale accessions used for the trial

裝有游離小孢子的離心管以1 000 r/min離心3 min，棄上清；再加入10 mLNLN液體培養(yǎng)基離心洗滌2次（1 000 r/min，3 min），棄上清。向離心管加入NLN液體培養(yǎng)基溶解小孢子，調(diào)節(jié)濃度，分裝于直徑60 mm培養(yǎng)皿（每皿約5 mL），用封口膜密封，做好標(biāo)記。

1.2.2 離心管機(jī)械破碎提取芥藍(lán)小孢子 在挑取用于手工研磨芥藍(lán)花蕾的同時(shí)，從相同材料中挑取適期花蕾，用于機(jī)械破碎提取小孢子。將40個(gè)花蕾放入2 mL離心管，用75%乙醇消毒30 s，再用8%次氯酸鈉滅菌15 min，最后用無菌蒸餾水沖洗3次。消毒和沖洗后的液體均用移液器盡可能地吸去。離心管內(nèi)放入直徑4 mm的滅菌鋼珠，加入1 mL B5液體培養(yǎng)基；離心管蓋好，放入FastPrep-24快速核酸提取儀（MP，美國），以4.0 m/s的振蕩速度振蕩20 s；將含游離小孢子的液體培養(yǎng)基倒入過濾器過濾，濾液盛入50 mL離心管，取適量B5液體培養(yǎng)基沖洗離心管2次，倒入過濾器。

裝有游離小孢子的離心管以1 000 r/min離心3 min，棄上清；再加入10 mL NLN液體培養(yǎng)基離心洗滌2次（1 000 r/min，3 min），棄上清。獲得的游離小孢子，加入NLN液體培養(yǎng)基調(diào)節(jié)濃度，分裝于直徑60 mm培養(yǎng)皿中（每皿約5 mL），用封口膜密封，做好標(biāo)記。一般40個(gè)芥藍(lán)花蕾提取的游離小孢子，調(diào)節(jié)濃度后可分裝5個(gè)培養(yǎng)皿。

1.2.3 芥藍(lán)游離小孢子的培養(yǎng) 將封口的培養(yǎng)皿先于32.5℃暗培養(yǎng)24 h，再轉(zhuǎn)至25℃繼續(xù)暗培養(yǎng)，一般2～3周出現(xiàn)胚狀體；將胚狀體移入B5固體培養(yǎng)基光照培養(yǎng)（20℃，14 h光/10 h暗，光強(qiáng)2 000 lx），15 d更換一次培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；待形成子葉型、魚雷型胚后，轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基培養(yǎng)（20℃，14 h光/10 h暗，光強(qiáng)2 000 lx），誘導(dǎo)成苗，15 d更換一次培養(yǎng)基進(jìn)行繼代培養(yǎng)；經(jīng)3～4次繼代培養(yǎng)后，每個(gè)株系將不少于5個(gè)再生苗轉(zhuǎn)移至1/2 MS固體培養(yǎng)基上進(jìn)行生根培養(yǎng)，約2周后獲得生長健壯的再生植株。

1.2.4 芥藍(lán)單倍體的染色體加倍 將再生植株移至壯苗環(huán)境下（24℃，16 h光/8 h暗，光強(qiáng)2 000 lx）生長3～4 d后，用0.1%秋水仙素溶液浸根10 h進(jìn)行加倍處理，再用自來水沖洗3～4 h，然后移栽至壯苗生長環(huán)境下緩苗2～3周。緩苗處理后，與其他未經(jīng)秋水仙素處理的幼苗同時(shí)移栽至人工氣候室，控制光照和溫度，使其緩慢生長；待天氣轉(zhuǎn)涼（2018年9月）移栽至田間，在蕾期進(jìn)行單株自交留種。

1.2.5 芥藍(lán)再生苗染色體的細(xì)胞倍性鑒定 通過分析DNA含量，對(duì)芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)的再生苗進(jìn)行染色體倍性鑒定。DNA含量測(cè)定利用流式細(xì)胞儀（Partec CyFlow PA，美國）完成，具體方法如下：取大小為0.5 cm×0.5 cm的鮮嫩葉片置于6 cm玻璃培養(yǎng)皿中，滴加400 μL核裂解液（Cystain UV precise P，Sysmex）浸沒樣品；用鋒利刀片切割葉片，盡量使每刀都徹底切斷，直至成為較小的葉片（注意不要成糊狀）；滴加1 600 μL核染色液（Cystain UV precise P，Sysmex）染色，然后在30 μm濾網(wǎng)過濾，上機(jī)測(cè)定染色體含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取芥藍(lán)小孢子誘導(dǎo)胚胎形成效果

前期研究中，發(fā)現(xiàn)芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)誘導(dǎo)胚胎形成的頻率與基因型密切相關(guān)，通過篩選后只有部分材料能夠有效誘導(dǎo)出胚狀體。本研究利用經(jīng)篩選過的5個(gè)純系及其配制的雜交一代，以及2個(gè)已通過品種審定的雜交一代（冬盛芥藍(lán)、冬綠芥藍(lán)）共14份材料（表1），開展小孢子培養(yǎng)研究，并就不同方法提取小孢子誘導(dǎo)形成胚胎效果進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果（表2）表明，離心管機(jī)械破碎提取的芥藍(lán)小孢子，平均胚狀體誘導(dǎo)率為11.96%，略高于手工研磨的10.80%，但差異不顯著。通過機(jī)械研磨，污染率低于研缽研磨，可能是導(dǎo)致其胚狀體誘導(dǎo)率稍高于研缽研磨的主要原因?？梢?，機(jī)械破碎能夠替代手工研磨來批量地處理樣品，從而提高芥藍(lán)小孢子的提取效率。

2.2 芥藍(lán)再生苗的產(chǎn)生及倍性分析

芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)產(chǎn)生的胚狀體，經(jīng)繼代培養(yǎng)后誘導(dǎo)形成再生苗（擬單倍體），再生苗又經(jīng)歷多次繼代培養(yǎng)（圖1A），最后經(jīng)過生根培養(yǎng)（圖1B），至第2年6月共得到112個(gè)芥藍(lán)再生株系（每個(gè)株系不少于5株）。從誘導(dǎo)產(chǎn)生芥藍(lán)胚狀體，到最終形成完整再生植株，整個(gè)過程都可能發(fā)生染色體的加倍。在獲得的芥藍(lán)再生苗株系中，隨機(jī)選50個(gè)單株，取其葉片進(jìn)行染色體DNA含量測(cè)定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)為單倍體（圖1C），僅有6個(gè)為二倍體（圖1D）。推測(cè)通過小孢子培養(yǎng)得到的芥藍(lán)再生苗大多數(shù)為單倍體。

2.3 芥藍(lán)再生植株的田間表現(xiàn)

芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得的再生植株（擬單倍體），需經(jīng)過染色體加倍，才有可能產(chǎn)生正常的花器官和配子，進(jìn)而自交產(chǎn)生種子，形成DH系。從獲得的112個(gè)芥藍(lán)再生苗株系，取62個(gè)株系進(jìn)行秋水仙素處理，再與其他未經(jīng)處理的株系，一起移植至小盆，置于人工氣候室下使其緩慢生長，至9月初移栽到田間。移栽后，持續(xù)觀察芥藍(lán)植株長勢(shì)；在開花期，對(duì)花器官進(jìn)行觀察，對(duì)有花粉的植株進(jìn)行人工自交。不同芥藍(lán)材料產(chǎn)生的再生株系，秋水仙素處理或清水處理數(shù)量，及其獲得DH系的數(shù)量如表3所示。

表2 不同方法采集芥藍(lán)小孢子的培養(yǎng)效果Table 2 Culture results of Chinese kale microspores isolated with different methods

圖1 芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)再生苗及其染色體DNA含量Fig.1 Regenerated plantlets of microspore culture-based Chinese kale and determination of DNA content of chromosome

田間觀察發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)秋水仙素處理的芥藍(lán)再生植株，移栽后絕大多數(shù)生長緩慢而瘦小，部分提早衰亡，約一半植株能存活并開花，但植株普遍較細(xì)小，只有少數(shù)株系能產(chǎn)生花蕾（圖2A）。反觀經(jīng)過秋水仙素處理的芥藍(lán)植株，移栽后長勢(shì)更好，大多數(shù)單株存活至開花，而且在多數(shù)株系中出現(xiàn)明顯變大的植株（圖2 B、C）。對(duì)芥藍(lán)再生植株的花器官進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)存在多種不同類型的花（圖2D）。其中，未經(jīng)秋水仙素處理的株系，花普遍很小且花藥發(fā)育異常，表現(xiàn)為典型的單倍體（圖2D第1朵花）；經(jīng)秋水仙素處理的株系，從花的大小、花瓣和花藥數(shù)量等來看，其種類多樣，但單倍體花的比例明顯更少，與二倍體對(duì)照類似的花（圖2D第3朵花）明顯增多。此外，秋水仙素處理的芥藍(lán)再生植株，相對(duì)更容易發(fā)現(xiàn)嵌合體，即不同部位葉片和花大小明顯不同植株。上述結(jié)果說明，秋水仙素處理提高了芥藍(lán)再生植株的存活率和形成嵌合體的頻率。

2.4 芥藍(lán)再生植株的自交成系和DH系表型觀察

種植的芥藍(lán)再生植株，在蕾期進(jìn)行人工授粉自交，果莢黃熟時(shí)收獲種子。由于芥藍(lán)單倍體或多倍體花蕾一般不育或育性很差，很難自交產(chǎn)生種子，因而自交產(chǎn)生的種子幾乎都是DH。最終，112個(gè)芥藍(lán)再生株系中，共有41個(gè)株系獲得不低于10粒的自交種子，即形成41個(gè)芥藍(lán)DH系，其來源如表3所示。以芥藍(lán)DH系與再生株系數(shù)量之比計(jì)算DH成系率，總的DH成系率為36.61%。其中，經(jīng)秋水仙素處理的62個(gè)株系，共獲得35個(gè)DH系，DH成系率為56.45%；而未經(jīng)秋水仙素處理的50個(gè)株系僅獲得6個(gè)DH系，DH成系率為12.00%?？梢姡锼伤靥幚碇晗档腄H成系率是未經(jīng)處理株系的4.70倍。由DH成系率可知，秋水仙素處理使芥藍(lán)單倍體植株的染色體加倍頻率得到大幅增加。

獲得的41個(gè)芥藍(lán)DH系，在第2年秋季按株系種植，部分株系的植株表現(xiàn)如圖3所示。大田觀察發(fā)現(xiàn)，這些芥藍(lán)株系內(nèi)單株之間的表現(xiàn)高度一致，不存在表型分離，說明全部均為DH系。由芥藍(lán)純系材料小孢子培養(yǎng)獲得的DH系，植株表型與小孢子供體親本完全相同；而芥藍(lán)雜交一代產(chǎn)生的DH系，植株表型出現(xiàn)分離，大多介于雙親之間。這些芥藍(lán)DH系部分為自交不親和，后續(xù)將從中選擇表現(xiàn)較好的DH系，相互雜交或與其他自交不親和系雜交配制雜交一代，以選育芥藍(lán)雜交新品種。

表3 不同芥藍(lán)再生株系處理及獲得的DH數(shù)量Table 3 Treatment of regeneration lines derived from different Chinese kale and DH lines obtained

圖2 芥藍(lán)再生植株的田間表現(xiàn)和花器官比較Fig.2 Comparison of field performance of Chinese kale regenerated plants and their flowers

圖3 部分芥藍(lán)DH系植株的田間表現(xiàn)Fig.3 Field performance of partial Chinese kale DH lines

3 討論

利用組織培養(yǎng)或誘導(dǎo)系誘發(fā)單倍體進(jìn)而快速創(chuàng)制純系，是跨國種子企業(yè)的主流育種技術(shù)之一[7]。利用單倍體育種，只需2～3個(gè)世代即可創(chuàng)制純系，能夠大幅縮短育種周期，提高育種效率[13]。本研究利用14個(gè)不同類型的芥藍(lán)供體材料，開展小孢子培養(yǎng)、染色體加倍和自交收獲，最終產(chǎn)生了41個(gè)DH系。從供體材料種植到最終獲得DH系，共經(jīng)歷3年3個(gè)世代（2017—2019年），較以往的自交系選育周期（8～10個(gè)世代）大幅縮短，且單株完全一致性、純度更高。

相對(duì)傳統(tǒng)自交系選育，單倍體育種的流程較為復(fù)雜，流程的不斷優(yōu)化，對(duì)提高DH系選育效率有重要意義。前期研究中，不同研究者對(duì)芥藍(lán)小孢子培養(yǎng)開展研究，主要集中在基因型、培養(yǎng)基和花蕾預(yù)處理對(duì)小孢子胚發(fā)生的影響，而對(duì)于如何優(yōu)化流程、提高獲得DH系的效率鮮有提及[12,14-16]。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)芥藍(lán)單倍體育種體系的流程進(jìn)行梳理、整合和優(yōu)化。通過比較機(jī)械破碎和手工研磨提取小孢子，我們發(fā)現(xiàn)兩種提取方式獲得的胚狀體誘導(dǎo)率無顯著差異，與前人報(bào)道結(jié)果一致[17]。此外，機(jī)械破碎的胚狀體誘導(dǎo)率為11.96%，比手工研磨的（10.80%）稍微更高，推測(cè)其原因可能是機(jī)械破碎提取小孢子的過程中，與空氣接觸機(jī)會(huì)更少，因而被污染的機(jī)會(huì)相對(duì)比手工研磨要少?？梢?，通過離心管機(jī)械破碎提取小孢子，較易于實(shí)現(xiàn)批量操作，更適合于大規(guī)模開展小孢子培養(yǎng)的需要。

理論上，除了在小孢子培養(yǎng)早期的單細(xì)胞階段，從胚狀體到再生植株的多細(xì)胞階段，可能只有部分細(xì)胞發(fā)生染色體加倍，從而產(chǎn)生嵌合體。因而可以推測(cè)，再生植株尤其是經(jīng)過秋水仙素加倍處理后的再生植株，有很大一部分是嵌合體。在十字花科蔬菜上，一些研究者通過觀察表型分析二倍體和多倍體植株的頻率，證實(shí)秋水仙素處理能有效提高小孢子培養(yǎng)再生植株的染色體加倍頻率[10,18-20]。本研究中，相對(duì)未加倍的（擬）單倍體植株，加倍后的植株往往更高大；但二倍體和多倍體植株往往不易區(qū)分，更多表現(xiàn)為嵌合體。因此，我們通過對(duì)自交后的種子，即DH成系率來進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)秋水仙素處理后DH成系率是未處理的4.07倍。由此說明，秋水仙素處理的確能夠有效提高芥藍(lán)擬單倍體的染色體加倍頻率。另一方面，我們通過DH成系率來衡量染色體的加倍情況，更符合育種實(shí)踐，也相對(duì)更具有操作性。

在實(shí)踐中，DH成系并能成功繁殖，需要有一定數(shù)量的DH種子（如10粒以上）；而要獲得足夠的DH種子，就必須有較多的再生植株為基礎(chǔ)（如5株以上）。本研究中，小孢子培養(yǎng)獲得胚狀體255個(gè)，經(jīng)過多次繼代培養(yǎng)和生根等組織培養(yǎng)操作環(huán)節(jié)，最終形成112個(gè)再生苗株系（每株系不少于5株）。可見，只有43.92%的胚狀體能產(chǎn)生再生苗株系；結(jié)合秋水仙素處理后DH成系率（56.45%），從產(chǎn)生胚狀到DH成系的頻率為24.79%，即約1/4的胚狀體能形成DH系。按當(dāng)前的流程綜合分析，我們認(rèn)為在開展芥藍(lán)單倍體育種實(shí)踐中，要獲得一個(gè)DH系，需要獲得4個(gè)以上的胚狀體，按10%的胚狀體誘導(dǎo)率大致計(jì)算，需要提取40朵花蕾的小孢子進(jìn)行培養(yǎng)。此外，由于擬單倍體發(fā)育不良，獲得胚狀體之后的多次組織培養(yǎng)操作，有不少再生苗會(huì)死亡，有必要開展進(jìn)一步研究，將秋水仙素處理提早至胚狀體時(shí)期或再生苗早期階段。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，機(jī)械破碎提取的芥藍(lán)小孢子，胚狀體誘導(dǎo)率與研缽研磨提取的無明顯差異，可用于批量處理樣品、提高小孢子提取效率；秋水仙素處理提高了芥藍(lán)再生植株在田間的存活率和染色體加倍頻率；獲得了41個(gè)芥藍(lán)DH系，其中秋水仙素處理再生株系的DH成系率為56.45%，是未處理的4.07倍。通過對(duì)小孢子提取方法、再生植株處理及其他環(huán)節(jié)進(jìn)行優(yōu)化，本研究建立了一套較為有效的芥藍(lán)單倍體育種技術(shù)體系，可在芥藍(lán)育種實(shí)踐中有推廣應(yīng)用，提高芥藍(lán)育種效率。