NK細胞抑制性受體與腫瘤免疫治療綜述

聶 優(yōu)，李亞卓，程 霞，王宏偉

解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學中心 病理科，北京 100037

自然殺傷(natural killer，NK)細胞具有直接靶向快速殺傷靶細胞的功能，使其成為抗腫瘤的重要免疫細胞。NK細胞的活化依賴于激活和抑制性受體信號的平衡結(jié)果，憑借“自我缺失”式識別模式，辨認異常表達主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅰ類分子的惡性細胞，并保持對正常細胞的耐受性。此外，NK細胞也可通過表面受體直接識別靶細胞表面配體，從而調(diào)節(jié)自身殺傷活性。腫瘤細胞具有逃避NK細胞介導的腫瘤監(jiān)視能力，這與NK細胞抑制性受體的功能狀態(tài)密切相關。NK細胞抑制受體也被稱為檢查點受體，是腫瘤免疫療法中最具前景的治療靶標。目前使用針對殺傷細胞免疫球蛋白樣受體(killer-cell immunoglobulin-like receptors，KIR)、NKG2A、程序性死亡受體1(programmed cell death protein1，PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA-4)、T細胞免疫球蛋白和粘蛋白結(jié)構(gòu)域的分子3(T cell immunoglobulin and mucin domain-containing protein 3，TIM-3)、淋巴細胞活化基因3(lymphocyte activation gene 3，LAG-3)和T細胞免疫球蛋白和免疫受體酪氨酸抑制基序(T cell immunoglobulin and immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif domain，TIGIT)免疫檢查點抑制劑的臨床前和臨床試驗已經(jīng)展開，揭示了聯(lián)合或單獨應用NK細胞在腫瘤治療中的潛在作用(圖1)。本文主要綜述人NK細胞表面抑制性受體的類型、功能特點及其在腫瘤免疫逃逸及免疫治療中的進展。

1 MHC-Ⅰ類特異性抑制性受體

圖 1 人類NK細胞抑制性受體及其配體 本文總結(jié)人NK細胞抑制性受體與配體，框中顯示當前開發(fā)應用于臨床試驗的免疫檢查點抑制劑Fig.1 Human cell NK inhibitory receptors and their ligands NK cell-based immune checkpoint-blocking antibody which has been developed for clinical use are displayed in the upper pannel

1.1 殺傷細胞免疫球蛋白樣受體 KIR在所有NK細胞和少數(shù)T細胞上表達，分為活化型和抑制型。抑制型KIR包括KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3、KIR2DL5、KIR3DL1、KIR3DL2和KIR3DL3，識別HLA-A、HLA-B或HLA-C。成熟的NK細胞必須表達至少一種對自身MHC-Ⅰ類分子特異的抑制性受體(KIR和NKG2A)，以識別和殺死靶細胞并阻止NK細胞對自體細胞的活化。個體之間具有顯著不同的KIR-HLA組合，不同KIR單倍型可能對NK細胞功能具有不同的影響，進而影響宿主對感染或腫瘤細胞的免疫應答。一項研究KIR基因型對結(jié)直腸癌患者手術預后影響的實驗顯示，缺乏抑制型KIR但存在激活型KIR與長期無病生存率相關[1]。在探究KIR基因?qū)σ晾实貐^(qū)人頭頸部鱗狀細胞癌遺傳易感性影響的實驗，以及討論KIR基因單倍型影響骨髓增生異常綜合征患者臨床結(jié)局的實驗中，也得出類似的結(jié)論[2-3]。由此可見，抑制性KIR在不同類型腫瘤中起到了負性調(diào)控作用，因此成為免疫檢查點阻斷治療的有利靶點。

目前開展了多個臨床試驗以驗證阻斷抑制性KIR來增強NK細胞抗腫瘤功能的實際意義。lirilumab(IPH2102)是目前開發(fā)靶向KIR2DL1-3的IgG4單克隆抗體，至今已有多個使用lirilumab的臨床試驗注冊完成。Lirilumab單藥應用于首次緩解的老年晚期急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)患者的維持治療(NCT01687387)，或與其他藥物如ipilimumab(抗-CTLA-4)在晚期實體瘤患者中的聯(lián)合使用(NCT01750580)，均未顯示出較單獨應用抗CTLA-4更好的療效。但KIR阻滯劑聯(lián)合5-氮胞苷作為治療難治性或復發(fā)性AML的初步數(shù)據(jù)顯示，前25名患者中有20%對治療有反應，其中兩名患者獲得了完全緩解(NCT02399917)。此外，KIR和PD-1的聯(lián)合阻斷顯示接受化療的晚期頭頸部腫瘤患者客觀應答率有增加的趨勢(NCT01714739)。這些初步數(shù)據(jù)顯示了聯(lián)合進行KIR阻斷的臨床應用前景，不過大劑量、長期使用可能會阻礙NK細胞的活化[4]。有研究者認為這與單核細胞和嗜中性粒細胞的胞啃作用有關[5]。

1.2 CD94-NKG2A異二聚體 CD94/NKG2A是與C型凝集素相關的異二聚體抑制性受體，識別人類非經(jīng)典MHC-Ⅰ類分子HLA-E，在調(diào)節(jié)NK細胞終末成熟方面具有重要作用。某些類型的癌癥，如腎癌、急性髓性白血病和肝細胞癌，HLA-E和HLA-G分子的表達發(fā)生異常上調(diào)，可能是因為這些自身分子在腫瘤細胞上的表達損害NK細胞的同種異體反應性，從而使癌細胞對NK細胞的殺傷具有抗性。如腎癌細胞在表面表達HLA-E，并且能夠促進NK細胞上調(diào)CD94-NKG2A異二聚體來抑制腫瘤浸潤NK細胞的效應功能[6]。慢性乙肝患者外周血NK細胞頻率下降，NKp46和NKG2A表達上調(diào)，這些改變與免疫清除病毒有關[7]。此外，NKG2A在肺癌、浸潤性乳腺癌患者NK細胞中的上調(diào)是腫瘤轉(zhuǎn)移的一個預測因素[8-9]。

人源化抗NKG2A單克隆抗體(IPH2201，monalizumab)已應用于多項臨床試驗。在血液系統(tǒng)疾病中，阻斷NKG2A可改善造血干細胞移植后早期NK細胞的同種異體反應性，從而預防急性和慢性移植物抗宿主病以及機會性感染[10]。同時NKG2A的抑制可顯著激活NK細胞以殺死原發(fā)性白血病細胞[11]。異基因造血干細胞移植后應用Monalizumab進行治療的Ⅰ期臨床試驗(NCT02921685)正在進行，將確定MonalizumabⅡ期試驗的最大耐受劑量和推薦劑量。Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(Nct02557516)使用Monalizumab聯(lián)合Irutinib(一種已用于治療慢性淋巴細胞白血病的Bruton's酪氨酸激酶抑制劑)以確定慢性淋巴細胞白血病患者的長期臨床效益。Monalizumab也應用到不同的實體瘤臨床試驗中，Monalizumab聯(lián)合西妥昔單抗治療頭頸部鱗癌的Ⅱ期臨床試驗(NCT02643550)顯示約31%的患者部分緩解，54%的患者病情無明顯進展，而之前的數(shù)據(jù)顯示單藥西妥昔單抗治療的客觀緩解率為13%，表明NKG2A阻滯劑與腫瘤靶向抗體聯(lián)用治療的有效性。

2 非MHC-Ⅰ類特異性抑制性受體

2.1 TIGIT與CD96 在MHC-Ⅰ類分子表達下調(diào)的癌癥中非MHC-Ⅰ類特異性抑制性受體可能發(fā)揮更突出的作用，在這種情況下，腫瘤細胞可利用這些受體來逃避抗腫瘤免疫應答。CD96以及TIGIT與活化型DNAX輔助分子1(DNAX accessory molecule 1，DNAM-1)競爭性結(jié)合脊髓灰質(zhì)炎病毒受體(poliovirus receptor，PVR)和脊髓灰質(zhì)炎病毒受體相關2(poliovirus receptor-related 2，PVRL2)后，通過持續(xù)的下游通路執(zhí)行免疫負性調(diào)節(jié)。TIGIT可抑制人類和小鼠NK細胞的殺傷功能，而CD96主要抑制NK細胞產(chǎn)生干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)[12]。TIGIT在包括子宮內(nèi)膜異位癥、乳腺癌、腎透明細胞癌、非小細胞肺癌和結(jié)直腸癌的腫瘤浸潤淋巴細胞中顯著上調(diào)[13]。另外感染人類免疫缺陷病毒的患者NK細胞TIGIT水平更高，且此時NK細胞產(chǎn)生干擾素-γ能力較低[14]。有研究者提出TIGIT表達可與NK細胞功能異質(zhì)性聯(lián)系起來，可解釋為什么不同個體對感染、自身免疫性疾病和腫瘤的易感性不同[15]。

相關動物實驗證明，阻斷檢查點分子TIGIT可防止NK細胞耗竭并引發(fā)強效的抗腫瘤免疫[16]。當前有不同團隊研制的4種抗TIGIT單克隆抗體應用到臨床試驗中(圖1)。Tiragolumab與抗PD-1聯(lián)合使用應用于非小細胞肺癌的臨床前研

究中(NCT03563716)。由Bristol-Myers Squibb公司開展的一項處于Ⅰ/Ⅱ期的臨床研究，將BMS-986207單獨或與nivolumab聯(lián)合使用于晚期實體瘤中(NCT02913313)。由OncoMed Pharmaceuticals開發(fā)的etigilimab(OMP-313M32)在一項Ⅰ期臨床試驗(NCT031119428)中單一或與抗PD-1組合對實體瘤進行治療。最后由Arcus Bioscience開發(fā)的AB154已開始進行Ⅰ期臨床試驗(NCT03628677)，評估AB154在晚期實體腫瘤中作為單一療法或與AB122(抗PD-1)聯(lián)合使用的安全性、藥代動力學、藥效學和初步療效。CD96在腫瘤轉(zhuǎn)移模型中的阻斷證實了其作為NK細胞檢查點受體的作用，但其作用依賴于NK細胞[16]。CD96的抗體阻斷促進了小鼠NK細胞IFN-γ的產(chǎn)生，并且與抗CTLA-4、抗PD-1、多柔比星組合較單獨使用抗CD96能更有效地控制動物模型中的腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。

2.2 程序性死亡受體1與細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4 PD-1與CTLA-4阻斷可以通過其他免疫細胞如腫瘤特異性T細胞直接和間接地增強NK細胞的抗腫瘤活性。有證據(jù)表明PD-1在大約四分之一健康人外周血中NK細胞亞群上有高表達，且僅限于NKG2A-KIR+CD57+表型特征的CD56dimNK細胞[18]。功能分析表明，與PD-1-NK細胞相比，PD-1+NK細胞受細胞因子誘導后增殖能力差、脫顆粒率低、細胞因子生成少，但是這些可被抗PD-1抗體逆轉(zhuǎn)[18]，這顯示了利用PD-1/PD-L1抑制通路的阻斷同時激活NK細胞進行治療的可行性。 PD-1/PD-L1阻斷使體內(nèi)以細胞毒性表型為特征的NK細胞維持時間增強，使用抗PD-1/PD-L1破壞該抑制途徑增強可NK細胞對多發(fā)性骨髓瘤細胞的殺傷，改善NK細胞釋放IFN-γ，并在PDL1+靶細胞存在時部分恢復PD-1+NK細胞的脫顆粒[18-19]。PD-1阻斷可誘導T淋巴細胞產(chǎn)生增強NK細胞功能的物質(zhì)，如IFN-γ，這可能是PD-1抗體臨床功效的另一種機制。然而PD-1/PD-L1阻斷可能產(chǎn)生免疫不良反應[20]。CTLA-4是T細胞擴增的關鍵調(diào)節(jié)因子，在NK細胞上部分表達，結(jié)合配體CD80和CD86顯示出抑制特性。黑色素瘤患者抗CTLA-4治療的臨床結(jié)果與治療前后TIM-3在循環(huán)T細胞和NK細胞中的低表達相關，并且與治療期間成熟循環(huán)CD56dimNK細胞的頻率增加相關[21]?？笴TLA-4療法可能通過阻斷抑制性CTLA-4+Treg或恢復CTLA-4+T細胞功能間接改善NK細胞功能[22]。目前，6種針對這兩種免疫檢查點途徑的抗體已被批準用于臨床(圖1)。

2.3 T細胞免疫球蛋白和黏蛋白結(jié)構(gòu)域的分子3與淋巴細胞活化基因-3 除了在T細胞上表達，TIM-3幾乎在所有NK細胞上都可檢測到，尤其是成熟CD56dimCD16+NK細胞。TIM-3的同源配體包括galectin-9(Gal-9)、凋亡細胞中的磷脂酰絲氨酸(PtdSer)、高遷移率族盒(HMGB1)和癌胚抗原相關細胞黏附分子(CEACAM1)。目前開發(fā)的兩種針對TIM-3的抑制劑(圖1)單獨或與其他藥物聯(lián)合應用于多項臨床試驗，不過TIM-3對NK細胞的功能作用存在爭議。TIM-3在多種癌癥患者的外周血NK細胞中上調(diào)，且TIM-3表達持續(xù)增加與NK細胞衰竭和功能障礙有關，阻斷來自晚期黑色素瘤和肺腺癌患者NK細胞的TIM-3可以增加NK細胞毒性和IFN-γ的產(chǎn)生[23]。然而，另有報道稱TIM-3阻斷會降低NK細胞介導的對胰腺癌細胞的殺傷功能[24]，并且在阻斷原發(fā)性急性髓性白血病母細胞Gal-9后，NK細胞與其共孵育減少IFN-γ的產(chǎn)生[25]。TIM-3與多個配體的混雜結(jié)合可能是其對NK細胞功能有不同影響的原因。

LAG-3在結(jié)構(gòu)上與CD4相似，但與MHC-Ⅱ類分子結(jié)合的親和力高于CD4，在活化的T細胞和NK細胞中表達，LAG-3的另一種潛在的配體是肝和淋巴結(jié)竇狀內(nèi)皮細胞C型凝集素。四種針對于LAG-3的檢查點抑制劑參與多項臨床試驗(圖1)，顯示了其增強T細胞應答的效應性。研究發(fā)現(xiàn)利用抗LAG-3或可溶性LAG-3阻斷該抑制途徑對人NK細胞的細胞毒性沒有影響[26]?？傊捎赥IM-3和LAG-3具有激活T細胞和NK細胞的潛力，它們可能是基于NK細胞免疫治療的良好候選者，有必要進一步確定TIM-3及LAG-3在NK細胞癌癥監(jiān)測中的確切作用。

2.4 唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素 唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素(sialic acid-binding immunoglobulin-like lectins，Siglec)家族成員眾多，在NK細胞表達的Siglec包括Siglec-7以及Siglec-9。Siglec-7在所有NK細胞上高表達，Siglec-9在CD56dimNK細胞上選擇性表達。代表Siglec抑制性配體的唾液酸聚糖(sialylated glycans)的過表達可能是腫瘤細胞逃避NK細胞識別的機制之一。Siglec-7和Siglec-9配體均已在多種腫瘤細胞系中檢測到，包括腎細胞癌、黑色素瘤、結(jié)腸腺癌、宮頸癌和慢性髓樣白血病細胞[27]。Jandus等[28]使用神經(jīng)氨酸酶對K562細胞和HeLa細胞進行去唾液酸化，可顯著增加外周血NK細胞介導的細胞毒性，對Siglec-7和Siglec-9阻斷也可增強NK細胞介導的針對K562和HeLa細胞系的細胞毒性。因此，通過改變腫瘤細胞中的唾液酸水平或使用阻滯劑靶向Siglec7和Siglec9，可增強基于NK細胞的腫瘤免疫治療效果。小分子高親和力的抑制劑可作為Siglec-7結(jié)合配體抑制該受體的作用，如甲基磺酰胺以及使用二唾液酸在多糖葡聚糖(DiSia-Dex)上合成的小分子Siglec-7抑制劑[29-30]。由于兩種抑制受體具有極大的相似性，未來的靶向策略調(diào)整為同時靶向Siglec-7和Siglec-9，可能以更強的方式增強NK細胞的抗腫瘤效果。

2.5 殺傷細胞凝集素樣受體G1 殺傷細胞凝集素樣受體G1(killer cell lectin-like receptor G1，KLRG1)是屬于凝集素樣超家族的跨膜受體，其通過細胞質(zhì)ITIM基序介導抑制作用。KLRG1優(yōu)先在NK細胞和T細胞上表達。三種Ⅰ型鈣黏蛋白E-、N-和R-鈣黏蛋白(cadherin)為KLRG1的配體，可介導“缺失自我”式識別，引發(fā)NK細胞激活。一些腫瘤可利用KLRG1-鈣黏蛋白相互作用以逃避免疫監(jiān)視，如在侵襲性乳腺癌中，一些腫瘤細胞最初下調(diào)E-鈣黏蛋白以獲得運動和轉(zhuǎn)移潛能，隨后重新表達以促進黏附并逃避免疫攻擊[31]。此外，上皮腫瘤可以從表達E-鈣黏蛋白轉(zhuǎn)變?yōu)楸磉_N-鈣黏蛋白，該蛋白通過與內(nèi)皮細胞和基質(zhì)細胞上的配體相互作用，賦予腫瘤更多侵襲性[31]。相關研究顯示，在動物模型中抑制KLRG1途徑可增強對癌癥的免疫控制[32]。在一些病毒感染如人類巨細胞病毒、Epstein-Barr病毒和人類免疫缺陷病毒的慢性感染期間，KLRG1會在NK細胞、CD8+T和CD4+T細胞中快速上調(diào)[33]。然而Grundemann等[34]研究發(fā)現(xiàn)，KLRG1-鈣黏蛋白相互作用主要抑制CD8+T細胞的擴增及其效應功能，但對NK細胞的細胞毒性幾乎沒有影響。在今后的研究中需要確定KLRG1-鈣黏蛋白結(jié)合的分子基礎，并繼續(xù)探究KLRG1途徑在人類不同癌癥中的調(diào)節(jié)作用，有助于我們理解其在免疫維持和腫瘤進展中的確切作用并為腫瘤治療提供新靶點。

3 其他抑制性受體

NK細胞還存在一些分布較為廣泛的抑制性受體，如CD300a、癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)、白細胞相關免疫球蛋白樣受體-1(leukocyte-associated Ig-like receptor，LAIR-1)及白細胞免疫球蛋白樣受體(leukocyte immunoglobulin-like receptor，LILR)。磷脂酰絲氨酸(PS)/磷脂酰乙醇胺(PE)和CD300a相互作用，可能在某些腫瘤中介導了一種新的免疫逃逸機制，損害NK細胞及其他淋巴細胞的功能。NK細胞上CEACAM1通過嗜同性和與CEACAM5的嗜異性作用進行細胞間黏附，并可同TIM-3協(xié)同抑制NK細胞介導的殺傷作用，干擾NK細胞IFN-γ釋放活性[35]。有研究將CEACAM1表達與黑色素瘤進展和轉(zhuǎn)移聯(lián)系起來，并開始了使用CEACAM1特異性抗體的臨床試驗[36]。LAIR-1幾乎在免疫系統(tǒng)的所有細胞上表達，LAIR-1的配體是膠原蛋白，說明細胞外基質(zhì)可能具有免疫調(diào)節(jié)的功能。由NK細胞、T細胞或吞噬細胞介導的針對腫瘤細胞的免疫，可能通過腫瘤增加的膠原蛋白與這些效應細胞上LAIR-1連接而被抑制。相關研究顯示LAIR-1在口腔鱗狀細胞癌、肝細胞癌可介導免疫逃逸[37-38]。LILR在多種細胞如淋巴和骨髓細胞上都有表達，其具有調(diào)節(jié)炎癥、免疫耐受、細胞分化和神經(jīng)系統(tǒng)可塑性等多種功能。LILRB1、LILRB2、LILRB5、LILRA2在NK細胞上表達，不過LILR在調(diào)節(jié)NK細胞活化中的作用尚不完全清楚。除免疫細胞外，LILRB和其相關的含ITIM的受體也由腫瘤細胞表達并促進腫瘤的進展[39]。因此，與CEACAM1類似，LILRBs的阻斷可能是一種潛在的癌癥治療方法，不僅可以逆轉(zhuǎn)腫瘤相關免疫細胞的抑制表型，而且還可以直接靶向惡性細胞。

4 結(jié)語

NK細胞在抗腫瘤免疫反應中至關重要，對KIR、TIGIT、NKG2A及CD96受體阻斷的臨床前和臨床試驗證實，NK細胞功能衰竭可被逆轉(zhuǎn)，同時改善基于T細胞的免疫療法進而顯著增強抗腫瘤治療效果。但不同腫瘤類型、不同病變階段之間這些抑制性受體變化是否一致，抑制性拮抗劑的使用對NK細胞毒性和自身免疫性是否有影響，這些檢查點抑制劑應用到人類是否有效調(diào)節(jié)NK細胞功能并改善臨床反應、阻斷治療的最佳時機等問題，仍需進一步探討。目前仍有較多抑制性受體功能尚不完全清楚，多數(shù)受體并非NK細胞特異性表達且模式多變。進一步揭示這些抑制性受體在NK細胞與特定腫瘤微環(huán)境之間的作用機制，將為開發(fā)新的抗腫瘤策略鋪平道路。在未來的研究中，針對癌癥不同療法的優(yōu)化組合，包括應用NK細胞多靶點阻斷或與其他檢查點阻滯劑聯(lián)合治療，將開啟癌癥免疫療法的新途徑。