腦膜敗血伊麗莎白菌耐藥性及同源性分析

劉 喆，王麗鳳，葉麗艷，沈定霞

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心，北京 100853

腦膜敗血伊麗莎白菌(Elizabethkingia meningoseptica，EME)舊稱腦膜膿毒金黃桿菌，2005年Kim等[1]將其從金黃桿菌中分列出來(lái)，以首次發(fā)現(xiàn)者Elizabeth的名字命名為腦膜敗血伊麗莎白菌，歸至伊麗莎白菌屬。該菌廣泛存在于醫(yī)院的各種環(huán)境中。近年來(lái)，EME導(dǎo)致感染的病例有所增加。EME可以引起新生兒腦膜炎，在免疫力低下人群中可引起敗血癥、肺炎、心內(nèi)膜炎等[2-3]。隨著廣譜抗菌藥物的廣泛使用，EME的耐藥菌株也在增多，且呈現(xiàn)較為廣泛的耐藥性。為幫助臨床合理選擇抗菌藥物，治療EME引起的感染，本研究對(duì)我中心分離的44株EME進(jìn)行常用抗菌藥物的耐藥性和菌株之間同源性的分析，菌株之間相似性大多＜90%，差異較大，無(wú)明確相關(guān)性。

材料與方法

1 菌株來(lái)源 選取2012年4月- 2018年12月我中心臨床標(biāo)本，按照同一患者相同來(lái)源菌株只計(jì)入第1次分離到的菌株的原則，獲得44株EME供本研究使用。質(zhì)控菌株：大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC29213、腸球菌ATCC29212。

2 儀器和試劑 35℃恒溫培養(yǎng)箱(Thermo公司)；VITEK MS(法國(guó)梅里埃公司)；血瓊脂平板、中國(guó)藍(lán)平板、M-H平板瓊脂平板為英國(guó)Oxoid公司產(chǎn)品；96孔藥敏板購(gòu)自上海星佰生物技術(shù)有限公司，選取的抗菌藥物有哌拉西林/他唑巴坦(TZP)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢吡肟(FEP)、亞胺培南(IPM)、美羅培南(MEM)、慶大霉素(CN)、阿米卡星(AK)、米諾環(huán)素(MH)、環(huán)丙沙星(CIP)、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶(SXT)、萬(wàn)古霉素(VA)、利奈唑胺(LZD)。

3 細(xì)菌的復(fù)蘇與鑒定 將臨床保存好的EME菌種在血平板上傳代1次，再用M-H瓊脂平板傳代2次，用質(zhì)譜儀鑒定后備用[4-5]。

4 藥物敏感性實(shí)驗(yàn) 采用微量肉湯稀釋法檢測(cè)12種抗菌藥物對(duì)44株EME的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)[6]，實(shí)驗(yàn)中嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)的規(guī)則進(jìn)行操作。菌液配制挑取菌落數(shù)個(gè)，置入2 ～ 3 ml滅菌0.9%氯化鈉注射液中，用0.5麥?zhǔn)媳葷峁苓M(jìn)行比濁，調(diào)制菌液濃度為1.5×108CFU/ml左右。取上述菌液60μl，滴入無(wú)菌加樣槽中，加營(yíng)養(yǎng)肉湯液1支(12 ml)，混勻。用8通微量移液器，吸取稀釋菌液100μl，加入除陰性對(duì)照孔以外的微量藥敏板孔中，每孔中菌液含量為7.5×104CFU，陰性對(duì)照孔加100μl無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液。將板條放入35℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。自培養(yǎng)箱中取出板條，用干毛巾輕輕擦拭板條底部。肉眼判讀各個(gè)孔的結(jié)果，粉色結(jié)果顯示該孔有細(xì)菌生長(zhǎng)，藍(lán)色為無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，記錄各種抗菌藥物抑制該菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度。除萬(wàn)古霉素和利奈唑胺外，其余10種抗菌藥物按照CLSI關(guān)于非發(fā)酵菌抑菌圈標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行敏感性的判讀。

5 同源性檢測(cè) 利用基質(zhì)輔助激光解析離子-飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MS)檢測(cè)44株EME的蛋白峰譜，并據(jù)此進(jìn)行蛋白峰譜的差異比較。首先，用1μl定量接種環(huán)先將標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC8739均勻涂抹在質(zhì)控位點(diǎn)的靶板上，然后加1μl的VITEK MS-CHCA基質(zhì)液，待檢的純培養(yǎng)細(xì)菌涂板方法與質(zhì)控菌株一致，等待靶板自然干燥后放入MS質(zhì)譜儀器進(jìn)行檢測(cè)，然后儀器會(huì)自動(dòng)將所得菌的蛋白質(zhì)峰圖與數(shù)據(jù)庫(kù)中峰圖進(jìn)行比較，分析得出鑒定結(jié)果。

6 同源性分析方法 質(zhì)譜儀通過(guò)自帶軟件Saramis獲得細(xì)菌的蛋白質(zhì)峰圖信息，并將蛋白質(zhì)峰圖信息導(dǎo)入軟件，進(jìn)行各個(gè)峰圖的成份分析及聚類分析，從而對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型，分析菌株之間的同源性。菌株相似性＜90%為無(wú)同源性。

結(jié) 果

1 標(biāo)本來(lái)源分布 標(biāo)本采集自患者下呼吸道36例(81.7%)、血液2例(4.5%)、尿液1例(2.3%)和拭子1例(2.3%)，其次來(lái)自穿刺液、腹水、膿液、膽汁各1例(分別占2.3%)，共獲得44株EME。其中男性患者34例，女性患者10例，多數(shù)患者伴有基礎(chǔ)疾病，如高血壓、糖尿病、腎病、車禍傷、腦外傷、慢阻肺、惡性腫瘤等。EME在我中心分布范圍較廣，多個(gè)病區(qū)均分離出該菌，其中最多的為各科室的ICU病房(43.2%)，其次為呼吸科和急診科，分別占18.1%和13.6%。44株EME的科室分布見(jiàn)表1。

表1 腦膜敗血伊麗莎白菌檢出的科室分布Tab.1 Distribution of detection of Elizabethkingia meningoseptica bacteria in meningeal septicemia

2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC29213和腸球菌ATCC29212的MIC值在質(zhì)控范圍內(nèi)，除萬(wàn)古霉素和利奈唑胺外其余10種抗菌藥物對(duì)大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853的MIC值也在質(zhì)控范圍內(nèi)。臨床菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果：EME對(duì)頭孢菌素類、氨基糖苷類、碳青霉烯類和磺胺類抗菌藥物均有很高的耐藥性，呈現(xiàn)出多重耐藥，除了亞胺培南外其余藥物耐藥率均高于80%，而對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素的耐藥率達(dá)到100%。對(duì)含酶抑制劑類抗菌藥物哌拉西林/他唑巴坦的耐藥率達(dá)到63.6%。該菌對(duì)米諾環(huán)素的耐藥率為0，敏感率達(dá)到100%。個(gè)別菌株對(duì)復(fù)方新諾明敏感，大部分菌株對(duì)復(fù)方新諾明中度耐藥，幾乎所有菌株對(duì)碳青霉烯類(亞胺培南，美羅培南)、酶抑制劑類(哌拉西林/他唑巴坦)、頭孢類、氨基糖苷類(慶大霉素，阿米卡星)、喹諾酮類(環(huán)丙沙星)高度耐藥。見(jiàn)表2(中介指的是處于敏感和耐藥之間)。

3 萬(wàn)古霉素和利奈唑胺的藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)EME的MIC值均≥8μg/ml，其中萬(wàn)古霉素的MIC值集中在8 ～ 64μg/ml，≥128μg/ml各有1株菌，而利奈唑胺對(duì)EME菌的MIC值≥16μg/ml超過(guò)97%以上。見(jiàn)表3。

4 同源性分析 44株EME質(zhì)譜同源性結(jié)果顯示各菌株相似的百分比多數(shù)＜90%，菌株的采集時(shí)間和各科室分布均較分散，提示菌株之間無(wú)明確相關(guān)性。見(jiàn)圖1。

圖 1 44株EME質(zhì)譜同源性分析Fig.1 Homology analysis by mass spectrometer of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica

表2 10種抗菌藥物對(duì)44株EME細(xì)菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity test results of 44 strains of Elizabethkingia meningoseptica to 12 kinds of drugs (n,%)

表3 萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)EME不同MIC值的菌株數(shù)Tab.3 Different minimum inhibitory concentration of Elizabethkingia meningoseptica to vancomycin and linezolid

討 論

腦膜敗血伊麗莎白菌是一種非發(fā)酵的革蘭陰性桿菌，廣泛存在于水和土壤環(huán)境中。該菌無(wú)芽孢、無(wú)鞭毛、無(wú)動(dòng)力，在血平板、中國(guó)藍(lán)平板和MH平板上均可生長(zhǎng)，其中在血平板上37℃培養(yǎng)24 h后，會(huì)形成白色或黃色菌落，呈圓形且邊緣整齊[7]。該菌在醫(yī)院很多處存在，如水槽、水龍頭、吸痰器、鼻導(dǎo)管、氧氣瓶等。近年來(lái)，關(guān)于該菌引起的新生兒和早產(chǎn)兒感染、免疫力低下成年人醫(yī)院獲得性肺炎的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮。目前，該菌已被認(rèn)為是醫(yī)院感染常見(jiàn)的條件致病菌之一。本研究結(jié)果顯示，44株EME主要來(lái)自下呼吸道標(biāo)本(占81.7%)，其余血、尿等一些無(wú)菌體液標(biāo)本均較少(占18.3%)，與寧興旺等[8]報(bào)道的EME主要引起病人下呼吸道感染基本一致。另外，44株EME感染患者主要來(lái)自腎病科、神經(jīng)科等6個(gè)科室的ICU病房，其次來(lái)自呼吸科和急診科，分別占43.2%、18.1%和13.6%。分析原因，與ICU病房患者大多合并基礎(chǔ)疾病，健康營(yíng)養(yǎng)條件差，呼吸科患者大量使用呼吸機(jī)、吸痰器以及急診科患者多有腦外傷、車禍傷、手術(shù)創(chuàng)傷等有關(guān)[9]。且這些患者多數(shù)接受各種侵入性檢查，如靜脈插管、機(jī)械通氣等，EME通過(guò)傷口進(jìn)入機(jī)體從而引起感染[10]。加強(qiáng)醫(yī)院環(huán)境定期消毒，加強(qiáng)介入性醫(yī)療操作無(wú)菌規(guī)范是有效預(yù)防EME引起醫(yī)院感染的重要途徑。

EME具有多重耐藥性，尤其對(duì)用于治療革蘭陰性桿菌感染的抗菌藥物，如頭孢類、氨基糖苷類以及碳青霉烯類[8,11-15]。本研究藥敏結(jié)果顯示44株EME對(duì)阿米卡星、環(huán)丙沙星、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶和美羅培南耐藥率均高于80%，對(duì)頭孢他啶、頭孢吡肟、慶大霉素的耐藥率高達(dá)100%。這與寧興旺等[8]報(bào)道結(jié)果一致。因此，臨床治療時(shí)避免使用此類抗菌藥物。而對(duì)含酶抑制劑類抗菌藥物哌拉西林/他唑巴坦的耐藥性也達(dá)到了63.6%，這與殷麗軍等[11]報(bào)道的差異較大。可能是由于我中心感染患者來(lái)自ICU病房較多，已經(jīng)廣泛使用抗菌藥物進(jìn)行治療，導(dǎo)致菌株多重耐藥有關(guān)。另外，EME對(duì)米諾環(huán)素有較好的抗菌活性，敏感率達(dá)到100%，因此，米諾環(huán)素可作為經(jīng)驗(yàn)治療EME感染首選藥物。

多項(xiàng)報(bào)道提示萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)EME有較好的抗菌活性[16-18]。但本次研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示兩者M(jìn)IC值均較高，由于CLSI并沒(méi)有關(guān)于萬(wàn)古霉素和利奈唑胺對(duì)EME的折點(diǎn)范圍，因此建議謹(jǐn)慎選用這兩種藥物治療EME所致的感染。

于濤等[18]曾報(bào)到利用PFGE對(duì)EME進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)ICU治療室臺(tái)面和該科護(hù)士的手有相同的PFGE圖譜，表明受污染的物體表面與醫(yī)護(hù)人員的手會(huì)造成EME傳播。對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析有許多方法，如PFGE、測(cè)序等。這兩種方法分辨率較高，可以更精準(zhǔn)地對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析。本文中采用質(zhì)譜儀對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析雖然相對(duì)粗糙，但該方法簡(jiǎn)單、快速，而且質(zhì)譜儀是臨床實(shí)驗(yàn)室常用設(shè)備，且該儀器本身的數(shù)據(jù)庫(kù)支持同源性分析，因此該方法可作為臨床初步判定菌株間傳播流行的依據(jù)。本研究利用質(zhì)譜儀對(duì)44株EME進(jìn)行初步同源性分析，結(jié)果顯示從采集時(shí)間和科室分布來(lái)看，各菌株相似程度較低，即各株EME之間無(wú)明確相關(guān)性，說(shuō)明EME在我中心各科室間沒(méi)有引起傳播流行。