人參皂苷Rg1對輻射致腸IEC-6細胞損傷保護作用的體外實驗

王毓國，竇永起，趙 森

解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 中醫(yī)科，北京 100853

放射性腸損傷是腫瘤放射治療的常見并發(fā)癥，有研究表明在腹部、盆腔放療中，60%以上患者出現(xiàn)腹痛、惡心、腹脹、便血等放射性腸損傷的早期癥狀，而放射性腸損傷后期可能會出現(xiàn)腸梗阻，甚至腸穿孔[1-2]。因此，放射性腸損傷的發(fā)生降低了腫瘤治愈率。目前，該病的發(fā)生機制已基本明確：一方面，放射線的直接殺傷作用可引起快速增殖的腸上皮細胞死亡；另一方面，細胞內(nèi)活性氧類增加，核DNA損傷，引發(fā)細胞凋亡。兩方面均導致腸上皮更新速度減緩，腸道屏障破壞[3-4]。近年來，手術、氨磷汀注射、抗生素、高壓氧等多種治療方式雖然取得了一些效果，但存在作用范圍小、不良反應多等缺陷[5]。而越來越多的臨床研究表明，中醫(yī)藥能夠有效減輕患者的消化道反應，提高生存質(zhì)量，且本團隊前期證實了益氣涼血解毒中藥能夠有效減輕大鼠放射性腸損傷，抑制炎癥反應[6-8]。人參皂苷Rg1是人參中的主要成分之一，研究證實其可有效改善輻射導致的皮膚損傷、神經(jīng)損傷，但Rg1對腸細胞輻射損傷的治療研究卻鮮有報道[9-10]。因此，本實驗擬探討Rg1對輻射致IEC-6細胞損傷的保護作用，并探索其作用機制。

材料和方法

1 實驗材料與儀器 細胞系：選擇大鼠小腸隱窩上皮細胞(intestinal epithelial cell No.6，IEC-6)，購自國家實驗細胞資源共享平臺。實驗用試劑：人參皂苷Rg1(貨號：E035580)、LY294002(貨號：F035850)均購自上海一飛生物科技有限公司；胎牛血清(貨號：FSP500)、PBS(貨號：C10010500bt)購自上海吉泰依科賽生物科技有限公司；胰酶(貨號：25200-072)購自賽默飛世爾科技有限公司公司；DMEM培養(yǎng)液(貨號：26418007)購自康寧公司；CCK-8試劑(貨號：CK04)購自東仁化學科技有限公司；裂解液(貨號：Cat.#1610747)購自伯樂公司；凋亡試劑盒(貨號：E-CK-A211)購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；p-AKT抗體(貨號：BSM-52131R)購自北京博奧森生物技術有限公司；Bax抗體(貨號：ab32503)購自艾博抗公司；Bcl-2抗體(貨號：ab59348)購自艾博抗公司；SDS-PAGE凝膠試劑盒(貨號：G2003)購自武漢賽維爾生物科技有限公司。儀器：60Co-γ照射裝置(軍事醫(yī)學科學院軍事醫(yī)學研究院)；CO2培養(yǎng)箱：賽默飛HEPA dass100；潔凈工作臺：中國冠鵬900；高速離心機：長沙TDZ5-WS；酶標儀：賽默飛2030-0050；流式細胞儀：碧迪Calibur。

2 細胞培養(yǎng)及處理 大鼠IEC-6細胞于含有5% FBS和0.01 mg/ml胰島素的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件為37℃、5% CO2、飽和濕度，匯合度達80%時傳代培養(yǎng)。參考文獻[11]方法進行照射，照射源由軍事醫(yī)學研究院提供，照射劑量為4 Gy，距離4 m。實驗分為空白組(Control)、模型組(Model)、中藥組(Rg1)及中藥+抑制劑組(Rg1+LY294002)。

3 CCK8法測定細胞活力 消化生長狀態(tài)良好的IEC-6細胞，進行計數(shù)后，以2×103/ml的細胞密度接種于96孔板上(200μl/孔)，中藥組加入10μmol/L的人參皂苷Rg1，中藥+抑制劑組加入同等濃度Rg1外，再滴加10μmol/L的LY294002。隨后置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。分別于照射后12 h、24 h、36 h，每孔加入100μl含10% CCK-8的培養(yǎng)基孵育1 h，使用酶標分析儀測量各孔光密度值。

4 Annexin V-FITC/PI雙染法檢定IEC-6細胞的生存率及凋亡率 將細胞以4×105/孔接種于六孔板，各組藥物干預處理同CCK-8，依照Annexin V-PI凋亡檢測試劑盒說明，對照射后12 h、24 h、36 h細胞凋亡率進行檢測。先用0.25%胰酶消化細胞，轉(zhuǎn)移至離心管進行離心(1 000 r/min，5 min)。棄上清，用PBS重懸細胞，再次離心1次，棄上清，用100μl Binding Buffer重懸細胞，加入5μl的Annexin-V和5μl的PI混勻后，避光反應20 min，使用流式細胞儀檢測生存率和凋亡率。

5 Western blot法測定細胞p-AKT、Bcl-2、Bax表達 收集細胞，提取細胞蛋白，經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)至PVDF膜、常溫封閉、孵育、一抗4℃過夜、二抗室溫結合、漂洗等操作后，采用圖像分析軟件Adobe PhotoShop分析結果，檢測各組p-AKT、Bcl-2、Bax相對表達水平。

6 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)均以-x±s表示，符合正態(tài)分布且方差齊的細胞活性及Bcl-2、Bax蛋白表達實驗結果的組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，其余數(shù)據(jù)方差不齊，兩兩比較采用Tamhane檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 人參皂苷Rg1對輻射后IEC-6細胞增殖活力的影響 CCK-8結果表明，照射后12 h、24 h、36 h各照射組細胞增殖活力較空白組均出現(xiàn)下降趨勢，其中12 h時模型組(0.47±0.01)及中藥+抑制劑組(0.47±0.02)細胞增殖活力明顯低于空白組(0.51±0.02，P＜0.05)，且中藥組(0.51±0.01)高于模型組及中藥+抑制劑組(P＜0.05)；24 h時中藥組(0.52±0.01)仍高于模型組(0.47±0.01，P＜0.05)及中藥+抑制劑組(0.47±0.01，P＜0.05)。見圖1。

圖 1 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細胞活力比較(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.1 Comparison of activity of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 2 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細胞生存和凋亡的流式細胞圖(n=9)Fig.2 Flow cytometry of survival and apoptosis of IEC-6 cells in each group at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9)

2 人參皂苷Rg1對輻射后IEC-6細胞存活率和凋亡率的影響 照射后12 h：與空白組比較，模型組及中藥+抑制劑組IEC-6細胞存活率明顯降低(P＜0.05)，凋亡率顯著升高(P＜0.05)；與模型組比較，中藥組細胞存活率升高(5.53%±4.14% vs 78.89%±6.89%，P＜0.05)，凋亡率降低(73.39%±16.46% vs 12.14%±3.02%，P＜0.05)；且中藥組存活率高于中藥+抑制劑組(78.89%±6.89% vs 5.67%±3.91%，P＜0.05)，凋亡率低于中藥+抑制劑組(12.14%±3.02% vs 90.26%±5.41%，P＜0.05)。照射后24 h：模型組及中藥+抑制劑組存活率低于空白組(P＜0.05)，中藥組存活率高于中藥+抑制劑組(P＜0.05)；中藥+抑制劑組凋亡率高于空白組和模型組(P＜0.05)，中藥組凋亡率低于中藥+抑制劑組(P＜0.05)。照射后36 h：模型組、中藥組細胞存活率較空白組相當(P＞0.05)，而中藥+抑制劑組仍低于空白組(P＜0.05)，凋亡率均高于其他組(P＜0.05)，見圖2 ～ 圖4。

圖 3 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細胞存活率變化(n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.3 Changes of survival rate of IEC-6 cells at 12 h (A),24 h (B) and 36 h (C) after irradiation (n=9) (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 4 照射后12 h (A)、 24 h (B)、 36 h (C) IEC-6細胞凋亡率變化(n=9； aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.4 Changes of apoptotic rate of IEC-6 cells in each group after irradiation (n=9;aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

圖 5 各組IEC-6細胞p-AKT、Bcl-2及Bax表達情況(n=9) A:p-AKT表達； B:Bcl-2表達； C:Bax表達； D:Bax/Bcl-2比值(aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)Fig.5 Expression of p-AKT,Bax and Bcl-2 in IEC-6 cells of each group (n=9) A:p-AKT expression;B:Bcl-2 expression;C:Bax expression;D:Bax/Bcl-2 ratio (aP＜0.05,vs control； bP＜0.05,vs model； cP＜0.05,vs Rg1)

3 人參皂苷Rg1對輻射12 h時IEC-6細胞p-AKT、Bcl-2和Bax表達的影響 統(tǒng)計分析結果表明：各組p-AKT相對表達量比較，模型組及中藥+抑制劑組較空白組明顯下降(P＜0.05)，與模型組比較，中藥組升高(0.49±0.07 vs 0.66±0.07，P＜0.05)，中藥+抑制劑組降低(P＜0.05)；各組Bax和Bax/Bcl-2相對表達量比較，模型組、中藥+抑制劑組Bax和Bax/Bcl-2均高于空白組(P＜0.05)，中藥組Bax低于模型組(0.11±0.03 vs 0.28±0.04，P＜0.05)，中藥組Bax/Bcl-2低于模型組(0.39±0.11 vs 2.54±0.71，P＜0.05)，中藥組Bax和Bax/Bcl-2均低于中藥+抑制劑組(P＜0.05)；Bcl-2相對表達量比較，各照射組均低于空白組(P＜0.05)，中藥組較模型組升高(0.30±0.03 vs 0.12±0.04，P＜0.05)，且高于中藥+抑制劑組(P＜0.05)。見圖5。

討 論

放射性腸損傷是放療的主要并發(fā)癥，給患者帶來較大痛苦，一直缺乏有效的治療手段及藥物。IEC-6細胞是取自健康大鼠空腸隱窩部位，并在體外培養(yǎng)成的細胞系，能較好地體現(xiàn)腸上皮細胞的生物特性，是放射性腸損傷研究中的經(jīng)典細胞類型[12]。有研究表明，人參單體及多種有效成分均具有輻射防治作用，如人參可通過阻斷ROS的產(chǎn)生，抑制Caspase、p38等通路來保護細胞[13]；人參皂苷Rg1能夠增強小鼠造血干/祖細胞對輻射衰老的抵抗力[14]，還能夠通過Nrf2/HDAC2信號減弱射線誘導的糖皮質(zhì)激素抵抗[15]；人參多糖可調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2和Caspase-3的表達，對小鼠腸輻射損傷產(chǎn)生保護作用[16]。但Rg1對輻射所致腸IEC-6損傷的治療研究極少。有動物實驗表明，Rg1是人參中抑制腸隱窩細胞凋亡的最有效成分之一。本團隊研究表明，益氣涼血中藥能夠有效延緩病情發(fā)展，延長大鼠生存期。因此，本實驗擬證實Rg1對輻射致腸IEC-6細胞凋亡的抑制作用。

PI3K/AKT是一條經(jīng)典的促生存和抗凋亡通路，其中PI3K具有蛋白激酶活性，可產(chǎn)生胞內(nèi)信使PIP3，調(diào)節(jié)細胞凋亡、增殖、代謝[17-18]。PIP3可以與AKT結合，產(chǎn)生磷酸化的p-AKT，激活下游靶點Bcl-2。Bcl-2蛋白可直接調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性，調(diào)節(jié)凋亡因子的釋放，而Bax的高表達可促進細胞凋亡，Bcl-2與Bax是一對凋亡相關蛋白，Bcl-2可以和Bax形成二聚體，進而促進細胞生存、抑制凋亡[19]。LY294002是PI3K的典型抑制劑，可靶向地抑制PI3K催化亞基p110的作用，進而抑制p-AKT的表達及下游因子的活化[20]。

本實驗研究表明，IEC-6細胞在遭受輻射后，細胞活力下降，照射后12 h，模型組細胞存活率下降明顯，中藥組存活率明顯高于模型組，表明人參皂苷Rg1能夠有效促進照射后的IEC-6細胞恢復及生長，而同時應用IP3K抑制劑LY294002后，存活率顯著下降。生存率及凋亡率比較顯示，照射后細胞出現(xiàn)存活率下降、凋亡率升高的趨勢，以模型組和中藥+抑制劑組最明顯，而人參皂苷Rg1能夠有效促進細胞生存、減少凋亡發(fā)生，至照射后36 h，各照射組細胞狀態(tài)逐漸恢復。課題組進一步選擇細胞存亡組間差異最為顯著的12 h行蛋白印跡檢測，其結果提示人參皂苷Rg1有效促進p-AKT、Bcl-2的表達，抑制Bax表達。結合中藥+抑制劑組蛋白表達情況，我們認為人參皂苷Rg1是通過促進PI3K/AKT的表達，進而達到抑制IEC-6細胞凋亡，促進存活，并保持其良好的增殖活性。

本實驗闡釋了人參皂苷Rg1對于放射線所致腸IEC-6細胞損傷的作用機制，為本病的臨床治療提供新的思路，為研制放射性腸損傷特效藥奠定實驗基礎。